생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

요약

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

초록

알파 시누클레인 (aSyn)은 파킨슨 병의 특징 인 Lewy 몸과 신경 고리에 피브릴라 응집체가 풍부한 본질적으로 무질서한 단백질입니다. 그러나, 그의 생물학적 활성의 대부분은, 그것의 응집뿐만 아니라, 중앙적으로는 단백질의 가용성 단량체 형태를 포함한다. aSyn 생물학 및 병태생리학의 분자 메커니즘에 대한 해명은 구조적으로 고도로 분해된 방법을 필요로 하며 생물학적 조건에 민감하다. 그것의 본래 펼쳐진, 메타 안정한 구조는 단량체 aSyn을 많은 구조 생물학 기술에 다루기 어렵게 만든다. 여기에서는 이러한 접근법 중 하나의 적용이 설명됩니다 : aSyn과 같은 열역학적 안정성이 낮고 보호 인자가 약한 단백질을 연구하기 위해 밀리 초 시간 척도의 수소 / 중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)이 설명됩니다. 밀리초 시간 척도에서 HDX-MS 데이터에는 aSyn의 용매 접근성 및 수소 결합 구조에 대한 정보가 포함되어 있으며, 이는 더 긴 라벨링 시간에 손실되어 궁극적으로 아미노산 수준까지 구조적 분해능을 산출합니다. 따라서 HDX-MS는 형태 역학 및 열역학, 분자 내 및 분자 간 상호 작용, 돌연변이 또는 환경 조건에 대한 변경의 구조적 영향에 대한 높은 구조적 및 시간적 해상도로 정보를 제공 할 수 있습니다. 광범위하게 적용가능하지만, 단량체 aSyn에서 밀리초 HDX-MS 측정을 획득, 분석 및 해석하는 방법이 입증된다.

서문

파킨슨 병 (PD)은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환입니다¹. 그것은 뇌의 흑질파 콤팩타 영역에서 Lewy 바디 및 Lewy 뉴라이트로 알려진 세포질 내포물의 형성을 특징으로합니다. 이들 세포질 내포물은 본질적으로 무질서한 단백질 aSyn²의 응집체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. PD 및 다른 synucleinopathies에서, aSyn은 가용성 무질서 상태에서 불용성, 고도로 구조화 된 병적 상태로 변형된다. 그것의 본래 형태에서, 단량체성 aSyn은 그것의 N- 및 C-테르미니 사이 장거리 정전기 상호 작용 및 그것의 C-말단 및 비-아밀로이드 베타 성분 (NAC) 영역 3,4,5,6 사이의 소수성 상호작용에 의해 안정화된 광범위한 입체 형태를 채택한다. 돌연변이, 번역 후 변형 및 국소 환경의 변화와 같은 이러한 안정화 상호 작용의 중단은 단량체의 오폴딩으로 이어질 수 있으며, 따라서 응집 과정을 촉발시킬 수 있습니다⁷.

aSyn 8,9,10,11의 올리고머 및 피브릴라 형태에 대한 방대한 양의 연구가 존재하지만, 단백질의 단량체 형태를 연구하고 어떤 순응자가 기능적인지 (그리고 어떻게) 그리고 어떤 것이 응집되기 쉬운지를 더 잘 이해할 필요가 있습니다^8,9,10,11 . 본질적으로 무질서하고, 크기가 14 kDa에 불과하고, 결정화하기 어려우며, aSyn 단량체는 대부분의 구조적 생물학적 기술에 복종할 수 없다. 그러나 단량체 aSyn의 형태 역학을 측정 할 수있는 한 가지 기술은 밀리 초 HDX-MS이며, 이는 최근에^12,13,14를 얻는 것이 어렵거나 불가능한 중요한 구조적 관찰을 생성했습니다. 밀리초 HDX-MS는 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 입체 앙상블의 평균을 민감하게 측정하여 밀리초 시간 척도에서 특정 단백질 영역의 용매 접근성 및 수소 결합 네트워크 참여를 나타냅니다. HDX-MS의 밀리 초 측면을 강조 할 필요가 있는데, 이는 기본적으로 펼쳐진 메타 안정 특성으로 인해 aSyn은 기존 HDX-MS 시스템의 하한보다 훨씬 낮은 매우 빠른 수소 교환 동역학을 나타내기 때문입니다. 예를 들어, 대부분의 aSyn 분자는 1 s 미만의 세포 내 조건 하에서 중수소와 완전히 수소를 교환했습니다. 몇몇 실험실은 이제 빠른 혼합 계측기를 구축했습니다. 이 경우 50ms의 데드 타임과 1ms의 시간 분해능으로 HDX-MS를 수행 할 수있는 프로토 타입 고속 혼합 담금질 흐름 기기가¹⁵ 사용됩니다. 밀리 초 HDX-MS는 최근 aSyn의 연구에서 매우 중요하지만, 본질적으로 무질서한 단백질 / 영역을보다 광범위하게 연구하고 약하게 안정적인 루프 / 영역을 가진 많은 수의 단백질을 연구하는 데 가치가 있습니다. 예를 들어, 펩티드 약물 (예를 들어, 인슐린; GLP-1/글루카곤; tirzepatide) 및 펩티드-융합 단백질 (예를 들어, HIV 억제제 FN3-L35-T1144)은 용액-상 구조 및 안정성 정보가 약물 개발 결정에 중요한 입력이 될 수 있는 주요 약물 포맷이지만, 펩티드 모이어티는 종종 초적 시간 척도^{16,17,18,19,20}에서 HDX-MS에 의해 약하게 안정하고 난치성일 뿐이다. . 초/분 도메인에서 표지를 갖는 창발적 HDX-MS 방법은 DNA G-사분면체에 대한 구조적 정보를 도출하는 것으로 나타났지만, 밀리초 HDX-MS²¹의 적용에 의해 이를 보다 다양한 올리고뉴클레오티드 구조로 확장할 수 있어야 한다.

HDX-MS 실험은 세 가지 상이한 수준에서 수행될 수 있다: (1) 상향식 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화됨), (2) 중간-다운 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화되고, 생성된 펩티드는 연질-단편화 기술에 의해 추가로 단편화됨), 및 (3) 하향식 (이에 의해 소프트-단편화 기술이 표지된 단백질을 직접 단편화함)²² . 따라서, 하위분자 HDX-MS 데이터는 우리가 단백질의 특정 영역에 대한 교환 거동을 국부화할 수 있게 해주므로, 그러한 실험에 대해 적절한 서열 커버리지를 갖는 것이 매우 중요하다. 임의의 HDX-MS 실험의 구조적 분해능은 소화 또는 연질 단편화시 단백질로부터 유래된 단백질 분해 펩티드 또는 단편의 수에 각각 의존한다. 위에서 설명한 세 가지 실험 유형 각각에서, 각 펩티드/단편에서의 아미드 교환의 변화는 단백질의 국부적인 영역의 거동을 나타내기 위해 단백질의 일차 구조에 다시 매핑된다. 가장 높은 구조적 분해능은 소프트 단편화를 통해 달성되지만, 이러한 실험에 대한 설명은 aSyn 단량체 입체 형태의 측정에 초점을 맞춘 현재 연구의 범위를 벗어납니다. 여기에 설명된 일반적으로 적용되는 "상향식" 워크플로를 통해 우수한 결과를 얻을 수 있습니다.

여기서, 절차는 (1) aSyn 샘플 및 HDX-MS 버퍼를 준비하고 처리하는 방법, (2) 상향식 HDX-MS 실험을 위한 펩티드 매핑을 수행하는 방법, (3) 생리학적 조건, 특히 밀리초 시간 영역에서 단량체성 aSyn에 대한 HDX-MS 데이터를 획득하는 방법(맞춤형 장비 사용; 밀리초 라벨링을 위한 대체 기기도 설명됨)에 대해 제공된다. (4) HDX-MS 데이터를 처리하고 분석하는 방법. 두 용액 조건에서 생리학적 pH (7.40)에서 단량체성 aSyn을 사용하는 방법이 여기에 예시된다. aSyn의 연구에 매우 유용하지만, 이러한 절차는 모든 단백질에 적용될 수 있으며 본질적으로 무질서한 단백질에만 국한되지 않습니다.

프로토콜

1. aSyn의 단백질 발현 및 정제

1. 이전에 게시된 보고서 다음에 aSyn을 준비^{합니다 9}.
2. 안전한 저장 완충액(예를 들어, 트리스, pH 7.2)으로 투석한다.
3. 필요한 경우, 샘플을 농축한다 (예를 들어, 약 10-30분 동안 3 kDa MWCO, 14,000 x g 를 사용하는 스핀 필터 마이크로원심분리 튜브, 재료 표 참조).
   참고 : 지나치게 집중하지 않는 것이 좋습니다. 단량체 앙상블의 완전성은 25 μM 이상으로 검증되지 않았다.
4. 분취량 및 -80 °C에서 저장
   참고: aSyn 단량체 단백질은 이러한 저장 조건에서 최대 1년 동안 안정합니다.

2. HDX 버퍼 준비

참고: 트리스는 고온 계수를 갖기 때문에 HDX 반응이 수행되는 온도(이 프로토콜에서 20°C)에 맞게 pH 측정을 조정해야 합니다.

1. 0.002 mol의 트리스를 LC-MS 등급 물 100 mL에 칭량하여 상태 A 및 주 B에 대한 평형 완충액을 준비하십시오. 상태 B의 경우, 29.8 mg의 KCl, 14.2 mg의 MgCl2, 36.8 g의_CaCl2 및 836 mg의 NaCl을 트리스 완충액에 첨가한다. pH를 7.40 내지 0.05± 조정한다.
   참고: 평형 버퍼에는 aSyn을 연구해야 하는 조건이 포함되어야 합니다. 이 경우, pH 7.4에서 20 mM 트리스 +/- 염이다.
2. 100 mL의 중수소 물에 0.002 mol의 Tris를 칭량하여 상태 A 및 주 B에 대한 라벨링 완충액을 준비하십시오. 상태 B의 경우, 29.8 mg의 KCl, 14.2 mg의 MgCl2, 36.8 g의_CaCl2 및 836 mg의 NaCl을 트리스 표지 완충액에 첨가한다. 표지 완충액의 pD는 평형 완충액의 pH에 상응한다. pH = pD - 0.41이므로 pH 측정기가 6.99 ± 0.05^23,24를 읽도록 조정하십시오.
   참고: 라벨링 버퍼는 중수소수를 사용하여 준비된다는 점을 제외하고는 평형 버퍼와 동일한 구성 요소를 가져야 합니다.
3. 0.010 mol의 Tris와 0.050 mol의 요소를 칭량하여 담금질 완충액을 준비하고 LC-MS 등급 물로 100 mL까지 구성하십시오. pH를 0.5°C에서 2.50 ± 0.05로 조정한다.
   참고: HDX 실험 전에 담금질 버퍼 스크린을 수행하여 관심 단백질에 가장 적합한 담금질 버퍼를 식별해야 합니다. 변성제 (예를 들어, 우레아 및 구아니디늄 히드로클로라이드) 및 환원제 (예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀)의 상이한 농도 및 조합은 포획 부피 및 온도와 같은 물리적 파라미터와 함께, 담금질 단백질을 효과적으로 펼치고 소화하기 위해 스크리닝된다. pH 2.50에서 100 mM 트리스 및 0.5 M 우레아를 포함하는 담금질 완충액이 본 연구에 최적이다.
4. 0.125 mol의 구아니디늄 염산염을 두란 유리 병에 칭량하여 소화 컬럼 세척 완충액을 준비한다. 메탄올 25 mL와 포름산 250 μL를 첨가한다. LC-MS 등급의 물로 최대 250 mL를 만드십시오.
   참고: Enzymate BEH 펩신 컬럼( 물질 표 참조)의 경우, 0.5M 구아니디늄 염산염, 10%(v/v) 메탄올 및 0.1%(v/v) 포름산의 컬럼 세척 버퍼를 사용하십시오.
5. 0.5 μL의 포름산을 LC-MS 등급 물 249.5 mL에 피펫팅하여 약한 세척 주사기를 준비한다.
6. LC-MS 등급의 등가의 물, 메탄올, 아세토니트릴, 및 이소프로판올을 혼합하여 강한 세척 주사기를 제조하였다. 포름산을 최종 2% (v/v) 농도에 첨가하십시오.
   참고: 다양한 버퍼와 단백질 사이의 교차 오염을 방지하고 주입구의 세척을 가능하게 하려면 주사기 세척 용액을 준비하고 밸브로의 유로(종종 "세척 라이너"로 명명됨)가 액체로 완전히 프라이밍되는 것이 중요합니다. 포름산은 주사기 약한 세척을 위해 선택적이다.

3. 펩타이드 매핑 절차

1. 아래 단계에 따라 샘플을 준비합니다.
   1. -80°C 냉동고로부터 해동된 aSyn 단백질 스톡을 0.22 μm 시린지 필터로 여과한다. 여과된 스톡 단백질의 흡광도를 280 nm에서 측정하여 Beer-Lambert 법칙에 의해 농도를 결정한다. 단백질을 평형 완충액 중에서 5 μM의 농도로 희석한다(단계 2.1.).
      참고: Beer-Lambert 법칙: A = εcl, 여기서 A는 흡 광도이고, ε는 M-1 ^cm-1단위를 갖는 측정된 파장(여기에서 280 nm)에서의 단백질의 흡광 계수이고, c는 M의 단백질 농도이고, l은 경로 ^{길이 cm이다}. 야생형 aSyn²⁶의 경우 ε = 5960 M−1 cm⁻¹입니다.
2. 액체 크로마토그래피 방법을 설정합니다.
   1. 7000-9000 psi의 압력에서 3 분의 로딩 / 포획 시간으로 입구 파일을 만든 다음 7 분 안에 5 % 아세토 니트릴에서 40 % 아세토 니트릴로 구배를 한 다음 10 분 동안 5 % -95 % 아세토 니트릴 물의 세척 단계를 반복하십시오.
   2. 잠금 스프레이 (예를 들어, 류신 엔케팔린, 재료 표 참조)가 2000 psi로 흐르고 질량 분광계의 소스 잠금 스프레이 프로브에 연결되도록하십시오.
3. 질량 분광법 MS^E 방법을 설정하십시오.
   참고: MS^E 는 전구체 질량 격리가 없는 광대역 데이터 독립적 수집 방법입니다. 따라서, 선택된 m/z 범위 내의 모든 이온은 충돌-유도된 해리(CID)²⁷을 사용하여 추가로 단편화된다.
   1. MS 메소드 파일에서 MS^E 연속체 를 선택하고 2-10 분, 전기 분무 소스 및 포지티브 해상도 모드 사이의 수집 시간을 설정하십시오. 50-2000 Da를 통해 MS^E 를 획득하여 0.3 초마다 스캔하십시오.
   2. 기능 1(저에너지)의 경우 트랩 및 전달 충돌 에너지를 4V로 설정합니다. 함수 2(고에너지)의 경우, 램프 전달 충돌 에너지를 4V에서 일정하게 설정하고, 트랩 충돌 에너지를 각 매핑 에너지 레벨에 대해 표 1 에 명시된 바와 같이 설정한다.
      참고: 이온 이동성 MS^E 방법도 사용할 수 있습니다. 대안적인 매핑 방법들(예를 들어, 데이터-의존적 획득 또는 DDA)은 사용자 재량에 따라 사용될 수 있다.
4. 자동 시료 주입기 로봇을 설정합니다( 재료 표 참조).
   1. 50 μL 단백질을 총 회수 바이알에 첨가한다. 바이알을 HDX 우측 챔버의 샘플 위치에 놓습니다. 이 챔버가 0.5°C에 있는지 확인하십시오.
   2. 평형 완충액의 시약 바이알 하나와 라벨링 버퍼의 시약 바이알 두 개를 HDX 좌측 챔버 내의 시약 위치 하나, 둘, 셋에 첨가한다. 펠티에 온도 제어기를 설정하여 이 챔버가 20°C에 있는지 확인하십시오( 재료 표 참조). 담금질 버퍼의 시약 바이알 하나를 HDX 우측 챔버 내에 시약 위치에 추가하십시오.
   3. HDX 왼쪽 챔버의 반응 위치에 여덟 개의 총 회수 바이알을 추가하고 HDX 오른쪽 챔버의 반응 위치에 여덟 개의 최대 회수 바이알을 추가합니다.
      참고: 분배된 부피의 완전한 세척과 최대한의 재현성을 보장하려면 자동 시료 주입기 주사기에서 주사기 세척 및 프라임 워시를 수행하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 매핑 실험을 시작하기 전에 (1) 약한 세척, (2) 강한 세척, (3) 약한 세척의 시퀀스를 실행하십시오. 이 순서는 광범위하게 반복 될 수 있으며 최대 20x까지 또는 주사기가 완전히 젖을 때까지 수행하는 것이 좋습니다.
   4. 스케줄링 소프트웨어에서 적절한 LC 및 MS 방법을 사용하여 샘플 목록을 설정하고 스케줄을 시작하십시오.
      참고: 본 연구를 위해, 크로노스는 스케줄링 소프트웨어로 사용된다( 재료 표 참조).
5. 매핑 데이터를 처리합니다.
   1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 매핑 실험 파일에서 펩티드를 식별 합니다(자료 표 참조).
   2. 다음 펩티드 역치 파라미터를 사용하여 펩티드 식별 데이터를 DynamX로 가져옵니다: 최소 강도 = 5000, 최소 서열 길이 = 0, 최대 서열 길이 = 40, 최소 생성물 = 1, 아미노산당 최소 생성물 = 0.25, 최소 연속 생성물 = 2, 생성물에 대한 최소 합계 강도 = 0, 최소 점수 = 0, 최대 MH+ 오차(ppm) = 0.
      참고: 또는 권장 워크플로우(²⁸)에 따라 최적화된 설정을 도출하십시오.
   3. 메뉴에서 데이터를 선택하고 PLGS 결과 가져오기를 클릭합니다. 추가를 클릭하여 스펙트럼 할당에 대한 관련 데이터 파일을 선택합니다. 모두 추가되면 다음을 클릭하고 위의 필터 설정을 입력하십시오. 그런 다음 마침을 클릭하십시오.
   4. 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 DynamX에서 aSyn의 최종 펩티드 커버리지 맵을 획득한다.

4. 밀리초 수소/중수소 교환 연구

1. HDX 실험을 시작하기 전에 FastHDX 프로토타입 장비( 자료표 참조)를 청소하십시오.
   1. 호환되는 HDX 소프트웨어 GUI를 열고 시스템을 초기화할 수 있도록 합니다.
   2. 샘플 챔버 온도를 20°C로, 담금질 챔버를 0.5°C로 입력합니다. 설정을 클릭하여 새 온도를 적용합니다.
   3. 모든 입구에 LC-MS 등급의 물로 원심 분리 튜브를 설치하십시오.
   4. 적정기 배관 배달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 프라임을 클릭하여 튜브의 잠복 공기 방울을 제거하십시오. 모든 거품이 사라질 때까지 반복하십시오.
   5. 매크로 탭에서 주사기의 모든 상자를 선택합니다. 주사기 홈 위치 보정을 클릭하십시오. 세척 주사기 로드 루프를 클릭합니다. 모든 믹싱 루프 볼륨 세척을 클릭하십시오.
   6. 4.1.5단계를 반복합니다. 1배 더.
   7. 버퍼 주사기에 기포가 나타나면 주사기를 분리하고 기포를 수직으로 배출하여 기가를 제거합니다. 주사기를 교체하고 제로 위치로 다시 보정하십시오.
2. HDX 실험을 위한 FastHDX 프로토타입 기기를 설정합니다.
   1. 여과된 500 uL의 여과된 5 μM aSyn을 총 회수 바이알에 첨가하고, 온도-유도된 올리고머화 및 응집을 방지하기 위해 탁상 냉장고 내부에 놓는다.
   2. 50mL의 평형, 라벨링 및 담금질 버퍼를 각 버퍼에 추가합니다(2. HDX 버퍼 준비 단계 1-3) 좌우 챔버 내의 입구.
   3. 컬럼 세척 완충액 50 mL를 첨가한다(2. HDX 완충액 준비 단계 4)를 펩신 세척 유입구로 세척한다.
   4. 단백질과 컬럼 세척 라인을 1x로 프라이밍하려면 적정기 배관 전달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 프라임을 한 번 클릭하십시오.
      참고 : 프라임에 대한 후속 클릭은 프라임 프로세스의 추가 반복을 유발하여 많은 양의 단백질 샘플을 소비합니다. 버튼 클릭을 시도한 후 소프트웨어에 지연이있는 경우에도이를 피하는 것이 좋습니다.
   5. 4.1.5단계를 반복합니다. 1배.
   6. 수동 담금질 흐름 탭에서 4.2.7.-4.2.10단계에서 설명하는 필수 설정을 입력합니다.
   7. 시간 코스 실험의 경우 기호 점 단추를 사용하여 시간을 밀리초 단위로 입력합니다. 반복실험이 필요한 경우, 동일한 시점을 여러 번 추가합니다(예: 50ms의 삼중의 경우 50,50,50개를 입력해야 함). 질량 분광계 소프트웨어 (MassLynx는 여기에서 사용됩니다. 재료 표 참조)의 샘플 목록은 해당 시점과 정확히 일치해야합니다.
      참고: 질량 분석기 샘플 목록 파일 이름 및/또는 샘플 텍스트는 FastHDX 소프트웨어 GUI에 입력된 시간에 해당하는 HDX 라벨링 시간의 영구 기록을 보장하기 위해 사용해야 합니다. 각 샘플 실행에 대한 레이블 지정 시간은 다른 곳에 저장되지 않습니다.
   8. 트랩 시간(분)을 트랩 시간의 길이로 설정합니다. 여기서, 그것은 3.00입니다.
   9. HPLC 대기 시간(분) = (트랩 시간 + 실행 시간 + 1.5분)을 설정합니다.
      참고: 예를 들어 3분 트래핑 및 17분 그라디언트가 있는 실험의 경우 21.50분이 됩니다.
   10. 샘플 실행 사이에 빈 실험을 실행하는 경우에만 빈 실행 상자를 클릭합니다. 그렇다면 각 샘플 실행 후 빈 실행에 대한 소프트웨어의 항목(예: 샘플 목록의 유효한 행)을 확인하십시오.
   11. 소프트웨어에서 샘플 목록이 준비되면 적절한 항목을 강조 표시하고 소프트웨어에서 재생 버튼과 FastHDX 를 클릭하여 소프트웨어에서 실행을 시작하십시오.
       참고: 수소/중수소 스크램블링으로 인해 MS 전용 방법 또는 소프트 단편화 기술(전자 전달 해리, 전자 포획 해리 및 자외선 광 해리)은²⁹개만 사용할 수 있습니다. 7.40의 생리학적 pH에서 aSyn의 경우, 50ms에서 300s 사이의 시간점이 가장 적용가능한데, 이는 이들이 전체 중수소 흡수 곡선⁽⁸)을 포괄하기 때문이다.

5. 데이터 처리

1. 펩티드 매핑 실험으로부터 분광적으로 할당된 펩티드의 파일을 로드한다. 파일 메뉴를 열고 DynamX 소프트웨어에서 열기 를 클릭하십시오( 자료표 참조).
2. 원시 파일을 선호하는 질량 측정 소프트웨어(예: DynamX, HDExaminer 등)로 가져옵니다. "데이터"메뉴를 열고 MS 파일을 클릭하십시오. 새 상태를 클릭하여 연구된 각 단백질 상태에 대한 상태를 만듭니다.
   1. 새 노출을 클릭하여 각 HDX 시간대를 추가합니다. 새 RAW를 클릭하여 .raw 파일을 가져옵니다. 각 .raw 파일을 올바른 위치로 끕니다. 완료되면 확인을 클릭하십시오.
3. 동위원소를 먼저 자동으로 할당하고(위의 5.2단계에 따라 자동으로 지정됨) 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 높은 데이터 품질을 보장합니다.
4. 클러스터 데이터를 단백질 이름, 서열 시작 번호, 서열 끝 번호, 서열, 변형, 단편, 가능한 최대 섭취량, 단동위원소 종의 질량, 상태 이름, 노출 시간, 파일 이름, 전하, 보존 시간, 강도 및 중심 순서로 열이 있는 .csv 파일로 내보냅니다.
5. 질량 측정 소프트웨어에서 데이터 메뉴를 열고 클러스터 데이터 내보내기를 클릭하십시오.

6. 데이터 분석

1. 내보낸 클러스터 데이터를 기본 HDX 분석 소프트웨어로 로드합니다. 여기서, HDfleX는^{30을 사용한다(}재료 표 참조).
2. 모든 펩티드 및 상태에 대한 실험 데이터를 적합시키고, HDX 반응에 대해 관찰된 속도 상수를 얻기 위해 적절한 역교환 보정 방법을 선택한다.
3. 선호하는 방법(HDfleX는 이에 대한 몇 가지 옵션 지원)으로 전역 유의 임계값을 계산하고 하이브리드 유의 테스트를 수행하여^31,32와 비교된 상태 간의 유의한 차이를 확인합니다.
   참고: 관찰된 차이가 전역 임계값보다 크고 p-값이 선택한 신뢰 수준(예: 95%)보다 작으면 그 차이는 유의한 것으로 간주됩니다.

결과

본질적으로 무질서한 특성으로 인해 생리적 pH에서 aSyn의 복잡한 구조적 변화를 포착하는 것은 어렵습니다. HDX-MS는 백본 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 형태 역학 및 상호 작용을 조사합니다. 높은 구조적 및 시간적 해상도에서이 정보를 얻는 몇 안되는 기술 중 하나입니다. 이 프로토콜은 광범위한 단백질 및 완충액 조건에 광범위하게 적용가능하며, 이는 단계 2.1.-2.2에 ?...

토론

본 기사에서, 다음의 절차가 기술된다: (1) 가장 높은 서열 커버리지를 얻기 위해 단량체성 aSyn에 대한 펩티드 매핑 실험을 수행하고, (2) 생리학적 조건 하에서 단량체성 aSyn에 대한 밀리초 HDX-MS 데이터를 획득하고, (3) 생성된 HDX-MS 데이터의 데이터 분석 및 해석을 수행한다. 제공된 절차는 일반적으로 실행이 간단하며, 각 라벨링 실험은 일반적으로 세 번의 반복실험과 8개의 시간 지점에 대해 약 8?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column	Waters Corporation	186002346	Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv	VWR	20060.420	For LC mobile phases
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670	Salt for HDX buffers
Chronos	Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)	667006090	Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-2-50	For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O)	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-4	Deuterated water
DynamX 3.0	Waters Corporation	176016027	Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column	Waters Corporation	186007233	Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade	Fisher Scientific	10596814	For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride	Sigma Aldrich	RDD001-500G	Chaotrope/Denaturant
HDfleX	University of Exeter	N/A	https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl	Sigma Aldrich	P3911	Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot	Waters Corporation	725000637	Autosampler robot
Leucine enkephalin	Waters Corporation	186006013	For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx	Waters Corporation	667004007	Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials	Waters Corporation	600000670CV	100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters	Millipore	N9CA7069B	Syringe filters
ms2min	Applied Photophysics Ltd	N/A	fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl	Sigma Aldrich	S9888	Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller	LEAP Technologies Inc.	HP115-COOL/D	Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0	Waters Corporation	715001030	Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps	Waters Corporation	186004632	100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2	Waters Corporation	186001420	100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-57	For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)	Amicon (Merck Sigma Aldrich)	UFC5003	Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer	Waters Corporation	176850035	Mass spectrometer
Total recovery vials	Waters Corporation	600000671CV	100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253-250G	Buffer
Trizma base	Sigma Aldrich	T60040-B2005	Buffer
Urea	Sigma Aldrich	U5378-1KG	Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column	Waters Corporation	186004623	Trap desalting column