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요약

이 프로토콜은 팔미트산 유발 시험관 내 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 platycodin D의 보호 효과를 조사합니다.

초록

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 발생은 전 세계적으로 놀라운 속도로 증가하고 있습니다. Platycodon grandiflorum 은 다양한 질병의 치료를위한 전통적인 민족 의학으로 널리 사용되며 일상 식단에 포함될 수있는 대표적인 기능성 식품입니다. 연구에 따르면 Platycodon grandiflorum의 주요 활성 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 생체이용률이 높고 NAFLD의 진행을 크게 완화하지만 이에 대한 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구는 시험관 내에서 NAFLD에 대한 PD의 치료 효과를 조사하는 것을 목적으로 한다. AML-12 세포는 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위해 24시간 동안 300μM 팔미트산(PA)으로 전처리되었습니다. 이어서, 세포를 PD로 처리하거나 24시간 동안 PD 치료를 받지 않았다. 활성 산소종(ROS)의 수준은 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 분석되었으며, 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 염색 방법으로 측정되었습니다. 또한, 세포 용해물에서 LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 ROS 및 미토콘드리아 막 전위 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 한편, PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 LC3-II/LC3-I 수준을 증가시키고 p62/SQSTM1 수준을 감소시켰습니다. 결과는 PD가 산화 스트레스를 줄이고 자가포식을 자극하여 시험관 내에서 NAFLD를 개선한다는 것을 나타냅니다. 이 시험관 내 모델은 NAFLD에서 PD의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

서문

Platycodon grandiflorus (PG)는 Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.는 중국 전통 의학(TCM)에서 사용됩니다. 주로 중국의 북동부, 북부, 동부, 중부 및 남서부 지역에서 생산됩니다1. PG 성분에는 트리테르페노이드 사포닌, 다당류, 플라보노이드, 폴리페놀, 폴리에틸렌 글리콜, 휘발성 오일 및 미네랄이 포함됩니다2. PG는 아시아에서 식품 및 약초로 사용되어 온 오랜 역사를 가지고 있습니다. 전통적으로이 약초는 폐 질환에 대한 약을 만드는 데 사용되었습니다. 현대 약리학은 또한 다른 질병을 치료하기 위한 PG의 효능에 대한 증거를 제공합니다. 연구에 따르면 PG는 다양한 약물 유발 간 손상 모델에서 치료 효과가 있습니다. PG 또는 platycodin 추출물의 식이 보충제는 고지방 식단으로 인한 비만 및 관련 대사 질환을 개선할 수 있습니다 3,4,5. PG의 다당류는 생쥐의 LPS/D-GalN에 의한 급성 간 손상 치료에 사용할 수 있다6. 또한 PG 뿌리의 사포닌은 고지방 식단으로 유발된 비알코올성 지방간염(NASH)을 개선합니다.7. 또한, PG의 가장 중요한 치료 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 인간 간세포 암종(HepG2) 세포에서 저밀도 지단백 수용체 발현과 저밀도 지단백 흡수를 향상시킬 수 있다8. 또한, PD는 또한 세포자멸사를 유도하고 HepG2 세포에서 부착, 이동 및 침윤을 억제할 수 있다 9,10. 따라서 본 연구에서는 마우스 간암 AML-12 세포를 시험관 내 모델 구축에 사용하고 이 모델에서 PD의 약리학적 효과 및 기본 메커니즘을 추가로 연구합니다.

비알코올성 지방간장(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방증, NASH, 간경변증, 간세포암종 등을 포함하는 간 질환을 일컫는 일이다11. NAFLD의 발병기전은 불완전하게 이해되었지만 고전적인 "2히트" 이론에서 현재의 "멀티플 히트" 이론에 이르기까지 인슐린 저항성은 NAFLD12,13,14의 발병기전에서 핵심적인 것으로 간주됩니다. 연구에 따르면 간세포의 인슐린 저항성은 유리 지방산을 증가시켜 간에 축적되는 트리글리세리드를 형성하고 간을 지방으로 만들 수 있음이 입증되었습니다15,16. 지방의 축적은 지방 독성, 산화 스트레스로 인한 미토콘드리아 기능 장애, 소포체 스트레스 및 염증성 사이토카인 방출을 유발하여 NAFLD17,18의 발병 및 진행을 초래할 수 있습니다. 또한, 자가포식은 세포 인슐린 감수성, 세포 지질 대사, 간세포 손상 및 선천성 면역 조절에 관여하기 때문에 NAFLD의 발병기전에도 중요한 역할을 합니다 19,20,21.

NAFLD22,23의 발병기전 및 잠재적 치료 표적을 탐색하기 위한 기초를 제공하기 위해 다양한 동물 모델 및 세포 모델이 확립되었습니다. 그러나 단일 동물 모델은 NAFLD24의 모든 병리학적 과정을 완전히 모방할 수 없습니다. 동물 간의 개인차는 병리학 적 특징을 다르게 유도합니다. NAFLD의 시험관 내 연구에서 간 세포주 또는 일차 간세포를 사용하면 실험 조건에서 최대 일관성을 보장합니다. 간 지질 대사 조절 장애는 NAFLD25에서 더 높은 수준의 간세포 지질 액적 축적으로 이어질 수 있습니다. 올레산 및 팜유와 같은 유리 지방산은 고지방 식단으로 인한 NAFLD를 모방하기 위해 시험관 내 모델에서 사용되었습니다26,27. 인간 간모세포종 세포주 HepG2는 시험관 내에서 NAFLD 모델을 구축하는 데 자주 사용되지만, 종양 세포주로서 HepG2 세포의 대사는 정상적인 생리학적 조건에서 간 세포의 대사와 크게 다르다28. 따라서, 약물 스크리닝을 위한 시험관내 NAFLD 모델을 구축하기 위해 원발성 간세포 또는 마우스 일차 간세포를 사용하는 것이 종양 세포주를 사용하는 것보다 더 유리하다. 동물 모델과 시험관 내 간세포 모델 모두에서 약물 효과와 치료 표적의 시너지 조사를 비교하면 마우스 간세포를 사용하여 시험관 내 NAFLD 모델을 구성하는 것이 더 나은 응용 가능성을 갖는 것으로 보입니다.

간으로 들어가는 유리 지방산은 산화되어 에너지를 생성하거나 트리글리세리드로 저장됩니다. 중요한 것은, 유리지방산은 특정 지방독성을 가지고 있으며, 세포사멸 장애와 세포자멸사를 유발할 수 있다는 것이다12. 팔미트산(Palmitic acid, PA)은 인간 혈장에 가장 풍부한 포화 지방산이다29. 비지방 조직의 세포가 고농도의 PA에 장시간 노출되면 활성 산소종(ROS)의 생성을 자극하고 산화 스트레스, 지질 축적, 심지어 세포자멸사를 유발합니다30. 따라서 많은 연구자들은 PA를 유도제로 사용하여 간 세포가 ROS를 생성하도록 자극하여 시험관 내 지방간 질환 모델을 구성하고 세포에 대한 특정 활성 물질의 보호 효과를 평가합니다31,32,33,34. 이 연구는 PA에 의해 유도된 NAFLD의 세포 모델에 대한 PD의 보호 효과를 조사하기 위한 프로토콜을 소개합니다.

프로토콜

AML-12 세포(정상 마우스 간세포 세포주)는 세포 기반 연구에 사용됩니다. 세포는 상업적 공급원으로부터 얻어진다 ( 재료 표 참조).

1. 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위한 AML-12 세포의 전처리

  1. 세포를 정상 세포 배양 배지 (0.005 mg/mL 인슐린, 5 ng/mL 셀레늄, 0.005 mg/mL 트랜스페린, 40 ng/mL 덱사메타손, 및 10% 소 태아 혈청 [FBS]를 함유하는 DMEM 플러스 Ham's F12 [1:1], 재료 표 참조)를 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C로 유지한다.
  2. 2.8 x 105 cells/well의 밀도로 12웰 플레이트(1mL/well)에 세포를 시딩합니다.
    참고: 모든 세포 분해 및 배지 교환 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
  3. 하룻밤 배양(~10시간) 후 세포의 배양 배지를 제거한 다음 1mL의 무혈청 배지(웰당)로 세포를 두 번 세척합니다.
  4. 12웰 세포 플레이트를 (1) 대조군, (2) PD 처리군, (3) PA 처리군, (4) PA+PD 처리군을 포함하여 왼쪽에서 오른쪽으로 4개의 다른 처리군으로 나눕니다.
    참고: 각 실험 처리 그룹의 3회 반복이 동일한 12웰 세포 플레이트에 위에서 아래로 배열됩니다.
  5. 정상세포배양액(1mL/웰)을 대조군과 PD처리군에 추가하고, PA처리군과 PA+PD처리군에 300μM의 PA가 보충된 정상세포배양액(1mL/웰)을 추가한다.
  6. 배양 24시간 후 세포의 배양액을 제거하고, 세포를 1 mL의 무혈청 배지(웰당)로 2회 세척하였다.
  7. 비히클(디메틸 설폭사이드, DMSO, 0.1% v/v)이 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 대조군에 추가합니다. 1μM PD가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 PD 처리군에 추가합니다. PA 처리군에 300μM PA가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 추가합니다. 300μM PA 및 1μM PD가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 PA + PD 처리군에 추가합니다.
  8. 추가 24시간 동안 배양한 후 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색(2단계), JC-1 염색(3단계) 및 웨스턴 블로팅(4단계)을 사용하여 세포에 대한 PD의 보호 효과를 조사합니다.
    참고: 모든 배양 작업은 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 수행됩니다.

2. ROS 생산의 변화 측정

참고: 세포의 세포 내 ROS 수준은 DCFH-DA 염색 분석을 기반으로 평가됩니다.

  1. 처리 기간(단계 1.8)이 끝날 때, 웰당 1 mL의 인산염 완충 식염수(1x PBS, pH 7.4)로 세포를 3회 세척한 다음, 웰당 10 μM의 10 μM DCFH-DA로 세포를 염색한다( 재료 표 참조). 세포를 어둠 속에서 30분 동안 배양한다.
    참고: 배양 30분 후에도 뚜렷한 녹색 형광이 관찰되지 않으면 프로브와 세포의 배양 시간을 적절하게 늘릴 수 있습니다(30-60분). 배양 30분 후 녹색 형광 값의 과다 노출이 관찰되면 프로브 및 세포의 배양 시간을 적절하게 줄일 수 있습니다(15-30분).
  2. 세포를 1x PBS(1mL/웰)로 세 번 세척합니다. 각 웰에 1x PBS 1mL를 추가합니다.
  3. 12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고( 재료 표 참조) 20x 대물렌즈를 사용하여 세포의 형태를 관찰합니다(배율: 200x).
  4. 여기 파장이 480nm이고 방출 파장이 530nm인 녹색 형광 채널을 사용하여 형광 현미경에서 각 웰에 대해 3개의 대표적인 형광 이미지(배율: 200x)를 캡처합니다.
    알림: 여기 파장이 480nm이고 방출 파장이 530nm인 녹색 형광 채널이 DCFH-DA를 감지하는 것이 좋습니다. 추가적으로, DCFH-DA는 형광 현미경35,36에서 GFP 및 FITC에 대한 파라미터 설정으로 검출될 수 있다.
  5. 마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어( 재료 표 참조)로 이미지를 처리한 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 평균 형광 강도 또는 다른 그룹의 비율을 계산합니다.
    참고: 이미징 작업에 사용된 형광 현미경 및 Image J 소프트웨어의 기술적 세부 사항은 이전에설명되었습니다 37,38.

3. 미토콘드리아 막 전위의 변화 측정

참고: 미토콘드리아 막 전위의 변화는 JC-1 염색 분석에 의해 모니터링됩니다.

  1. 처리 기간(단계 1.8)이 끝나면 웰당 1mL의 1x PBS로 세포를 3회 세척한 다음 5μg/mL JC-1 작업 용액 100μL( 재료 표 참조)로 암실에서 37°C에서 30분 동안 세포를 염색합니다.
    참고: 배양 30분 후에도 뚜렷한 녹색 형광이 관찰되지 않으면 프로브와 세포의 배양 시간을 적절하게 늘릴 수 있습니다(30-60분). 배양 30분 후 녹색 형광 값의 과다 노출이 관찰되면 프로브 및 세포의 배양 시간을 적절하게 줄일 수 있습니다(15-30분).
  2. 세포를 1x PBS(1mL/웰)로 세 번 세척합니다. 각 웰에 1x PBS 1mL를 추가합니다.
  3. 12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20x 대물렌즈를 사용하여 세포의 형태를 관찰합니다(배율: 200x).
  4. 여기 및 방출 파장이 각각 485nm 및 535nm인 녹색 형광 채널과 여기 및 방출 파장이 각각 550nm 및 600nm인 적색 형광 채널을 사용하여 형광 현미경에서 각 웰에 대한 3개의 대표적인 형광 이미지(배율: 200x)를 캡처합니다.
    참고 : 여기 파장이 485nm이고 방출 파장이 535nm인 녹색 형광 채널은 탈분극된 미토콘드리아 39,40,41로 취급되는 JC-1 단량체를 검출하는 데 사용되며, 여기 파장이 550nm이고 방출 파장이 600nm인 적색 형광 채널은 JC-1 이량체를 검출하는 데 사용됩니다. 이는 편광된 미토콘드리아 39,40,41로 취급됩니다.
  5. 마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어로 이미지를 처리한 다음 Image J 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 평균 형광 강도 또는 다른 그룹의 비율을 계산합니다.
    참고: 이미징 작업에 사용된 형광 현미경 및 Image J 소프트웨어의 기술적 세부 사항은 이전에설명되었습니다 37,38.

4. LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현량 측정

  1. 처리 후(단계 1.8), 4°C에서 예냉각된 1x PBS(1mL/웰)로 세포를 3회 세척합니다.
  2. 프로테아제와 포스파타제 억제제 칵테일(1x)( 재료 표 참조)이 보충된 RIPA 용해 완충액(100μL/웰)을 12웰 플레이트에 넣고 얼음에서 5분 동안 용해합니다.
  3. 세포 용해물을 1.5mL 미세원심분리 튜브에 수집하고, 4°C에서 20분 동안 12,000 x g 로 원심분리한다. 상청액의 단백질 농도를 표준 절차42에 따라 BCA 방법에 의해 결정한다.
  4. SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼(5x, 재료 표 참조)를 세포 용해물 상층액(부피 비율 = 1:4)에 추가합니다.
  5. 와동(~15초 동안 고속으로)으로 혼합하고 혼합된 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.
  6. 12-well-prepared 12% SDS-PAGE gel을 전기영동조에 넣은 후, 초순수로 희석한 SDS up-sample buffer(1x)를 높이한계 위치에 올려 놓는다.
    알림: SDS-PAGE 젤은 제조업체의 지침에 따라 상업용 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 준비됩니다.
  7. 단백질 마커(5μL/웰)와 샘플(20μg/웰)을 SDS-PAGE 젤의 다른 웰에 추가합니다.
  8. 안정전압 모드를 100V로 설정하고 80분 동안 전기영동을 수행합니다.
  9. SDS-PAGE 전기영동 후, 이전에 발표된 보고서 43,44에 따라 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(0.45 μM, 재료 표 참조)으로 단백질의 전기전달을 수행합니다.
  10. 단백질의 전전 후 PVDF 멤브레인을 TBST(1x TBS, 0.1% 트윈 20) 10mL로 실온의 셰이커에서 2회(5분/회) 세척합니다.
  11. PVDF 멤브레인을 5mL의 소혈청알부민(BSA, 5%)으로 실온에서 1시간 동안 쉐이커로 차단합니다.
  12. PVDF 멤브레인을 10mL의 TBST로 세 번(10분/회) 세척합니다. 이어서, 4°C에서 밤새 LC3(마우스 mAb, 1:2,000), p62/SQSTM1(이하 p62, 마우스 mAb, 1:2,000) 및 β-액틴(마우스 mAb, 1:2,000)( 재료 표 참조)에 대한 블로킹 완충액에 희석된 특정 1차 항체 5mL에 PVDF 멤브레인을 배양합니다.
  13. PVDF 멤브레인을 TBST 10mL로 실온에서 3회(10분/회) 세척합니다. 이어서, PVDF 멤브레인을 실온에서 블로킹 완충액(1:10,000)( 재료 표 참조)에 희석된 토끼 항-마우스 IgG(HRP) 2차 항체와 함께 인큐베이션하고 2시간 동안 빛으로부터 보호하였다.
  14. PVDF 멤브레인을 TBST 10mL로 실온에서 3회(10분/회) 세척합니다. 그런 다음 플라스틱 랩에 PVDF 멤브레인을 놓고 적절한 양의 ECL 작업 용액(200μL/멤브레인)을 추가하고( 재료 표 참조) 2분 동안 배양합니다.
  15. 배양 후 ECL 작업 용액을 제거하고 이미지 현상을 위해 이미징 시스템에 PVDF 멤브레인을 노출시킵니다. 마지막으로 Image J 소프트웨어를 사용하여 각 밴드의 회색 값을 분석합니다.
    참고: 이미징 작업에 사용된 웨스턴 블로팅 및 이미지 J 소프트웨어의 기술적 세부사항은 이전에 설명되었습니다45,46.

5. 통계 분석

  1. 실험 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시합니다.
  2. 앞서 설명한 통계 소프트웨어 도구를 사용하여 유의성 분석을 수행합니다47.
  3. t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 통계적 차이를 계산합니다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005).

결과

세포의 세포 내 ROS
AML-12 세포를 24시간 동안 300μM PA로 유도하고 NAFLD 세포 모델을 확립했습니다. 이어서, 세포를 24시간 동안 PD로 처리하였다. 세포를 DCFH-DA 형광 프로브로 표지하고, 형광현미경으로 ROS 생성을 관찰하였다. 세포내 ROS의 DCFH-DA 염색 결과를 도 1에 나타내었다. 결과는 PD가 300μM의 PA(P < 0.01)로 배양된 세포에서 세포내 ROS 수준을 유의하게 감?...

토론

연구에 따르면 NAFLD는 지방간에서 NASH에 이르는 임상 병리학 적 증후군으로 간경변 및 간암으로 진행될 수 있습니다51. 고지방 식단과 비활동적인 생활 방식은 NAFLD의 전형적인 위험 요소입니다. NAFLD 치료를 위한 비약물 요법과 약물 요법 모두 연구되었다51,52,53. 그러나 NAFLD의 발병기전은 완전히 밝혀지지 않?...

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 충칭 과학 기술위원회 (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 및 jbky20210029)와 중국 박사후 과학 재단 (No. 2021MD703919)의 보조금으로 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

참고문헌

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