Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy(초저온 전자 현미경을 위한 단층 그래핀 코팅 그리드 제작)

요약

여기에서는 그래핀의 단일 단층을 전자 현미경 그리드에 적용하기 위한 프로토콜과 CryoEM 구조 결정에 사용하기 위해 이를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

극저온 전자 현미경(cryoEM)은 고분자 복합체의 원자 구조를 조사하기 위한 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM을 위한 시료 전처리는 일반적으로 천공된 지지 필름의 구멍 내에 부유하는 유리질 얼음의 얇은 층에 검체를 보존해야 합니다. 그러나 CryoEM 연구에 일반적으로 사용되는 모든 시료 전처리 접근법은 시편을 공기-물 계면에 노출시켜 시료에 강한 소수성 효과를 발생시켜 종종 변성, 응집 및 복잡한 해리를 초래합니다. 또한, 시료의 영역과 공기-물 계면 사이의 바람직한 소수성 상호 작용은 거대분자가 채택한 방향에 영향을 미쳐 이방성 방향 분해능으로 3D 재구성을 가능하게 합니다.

CryoEM 표본을 그래핀 단층에 흡착하면 배경 노이즈의 유입을 최소화하면서 공기-물 계면과의 상호 작용을 완화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 그래핀 지지체는 또한 CryoEM 이미징에 필요한 단백질 농도를 크게 낮추는 이점을 제공합니다. 이러한 지지대의 장점에도 불구하고 그래핀 코팅 그리드는 상업적 옵션의 엄청난 비용과 대규모 자체 생산과 관련된 문제로 인해 CryoEM 커뮤니티에서 널리 사용되지 않습니다. 이 논문은 단층 그래핀을 거의 완전히 커버하는 CryoEM 그리드 배치를 준비하는 효율적인 방법을 설명합니다.

서문

단일 입자 극저온 전자 현미경(cryoEM)은 생체 고분자의 3D 구조를 조사하는 데 점점 더 많이 사용되는 기술입니다. 지난 10년 동안 전자 현미경 광학, 직접^{전자 검출1} 및 컴퓨터 알고리즘 ^2,3,4의 기술 발전으로 CryoEM 사용자는 거의 원자 분해능 5,6,7,8 까지 생화학적으로 안정적인 고분자 복합체의 구조를 결정할 수 있게 되었습니다 . 이러한 발전에도 불구하고 CryoEM 이미징을 위한 시료 보존에는 여전히 중요한 장벽이 남아 있으며, 이로 인해 대부분의 생물학적 시료가 고해상도로 분해되지 않습니다.

고분해능 CryoEM 분석을 위한 시료 전처리에는 유리화된 얼음의 얇은 층 내에 광범위한 방향으로 고르게 분포된 거대분자를 포획하는 작업이 포함됩니다. "블롯 및 플런지" 동결 방법은 CryoEM 연구를 위해 그리드에서 생물학적 샘플의 박막을 생성하는 데 가장 널리 사용되는 방법입니다 ^9,10. 이러한 방법은 친수성으로 만들어진 창공 필름이 포함된 EM 그리드에 몇 마이크로리터의 샘플 용액을 적용한 다음 여과지로 샘플의 대부분을 제거한 다음 그리드를 액체 에탄 또는 에탄-프로판 혼합물의 극저온제에 빠르게 담그는 것을 포함합니다⁹.

이 방법은 광범위한 생물학적 표본의 구조를 측정하는 데 성공적으로 사용되었지만, 일반적으로 사용되는 모든 CryoEM 표본 준비 방법은 표본을 소수성 공기-물 계면(AWI)에 노출시키므로 고해상도 구조 측정을 제한하는 문제가 발생하는 경우가 많습니다. 생물학적 표본은 AWI에 노출될 때 변성되는 경향이 높으며, 이는 복잡한 응집 및 분해로 이어질 수 있음이 확인되었습니다^11,12,13,14. 더욱이, 생물학적 표본의 표면 상의 소수성 패치는 입자가 얼음(¹²)에서 바람직한 방향을 채택하도록 한다. 많은 시나리오에서 샘플의 단일 소수성 영역은 모든 입자가 얼음에서 단일 방향을 채택하도록 강제하므로 신뢰할 수 있는 재구성을 생성하는 능력이 없어집니다. AWI의 문제점에 더하여, 시편은 구멍(¹⁵) 내의 얼음 내에 부유하는 입자의 수를 제한하는 필름의 창호층의 표면에 대한 친화력을 나타낼 수 있다.

AWI 또는 필름과의 상호 작용에서 발생하는 이러한 문제를 줄이기 위해 몇 가지 방법론적, 기술적 솔루션이 개발되었습니다^16,17. 한 가지 인기 있는 접근 방식은 EM 그리드의 창공 필름을 비정질 탄소의 얇은(수십 나노미터) 층으로 코팅하는 것입니다. 이 코팅은 입자가 흡착될 수 있는 구멍에 연속적인 표면을 제공하여 AWI^15,18,19,20과의 상호 작용으로부터 시료를 부분적으로 보호하는 이점이 있습니다. 그러나 추가 탄소 층은 이미징된 영역에서 배경 신호의 양을 증가시켜 특히 작은(<150kDa) 표본의 경우 달성 가능한 분해능을 손상시킬 수 있는 노이즈를 유발합니다. 최근 몇 년 동안 산화그래핀(GO) 플레이크를 사용하여 CryoEM 그리드에서 지지 필름을 생산하는 것이 기존의 비정질 탄소에 비해 장점이 있는 것으로 나타났습니다. GO 플레이크는 흑연 층의 산화를 통해 생성되며, 표면과 가장자리에 카르복실, 수산기 및 에폭시기 형태의 상당한 산소 함량으로 인해 친수성인 단층 흑연의 유사 결정질 시트가 생성됩니다. 수성 현탁액 내의 상용 GO 플레이크는 저렴하며, GO 플레이크를 EM 그리드에 적용하기 위한 수많은 공개된 방법이 있다(^18,21). 그러나 이러한 방법은 종종 GO 플레이크로 부분적으로만 덮인 그리드와 여러 층의 GO 플레이크를 포함하는 영역을 생성합니다. 또한 GO 플레이크는 얇은 비정질 탄소^22,23에서 관찰된 것과 유사한 CryoEM 이미지에 눈에 띄는 배경 신호를 제공합니다.

탄소 원자의 단일 2D 결정 배열로 구성된 자연 그대로의 단층 그래핀은 전자 현미경에서 위상차를 생성하지 않는다는 점에서 GO와 구별됩니다. 따라서 단층 그래핀은 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 보이지 않는 지지층을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 단층 그래핀은 또한 GO보다 강하고 EM 그리드에 단일 단층으로 적용될 수 있으며, 최근 그래핀 코팅된 EM 그리드 제조의 발전으로 고커버리지 단층 그래핀 그리드를 사내에서 제조할 수 있게 되었습니다 24,25,26,27,28,29,30. 그러나 CryoEM 구조 측정에 그래핀 코팅 그리드를 사용할 때의 이점에도 불구하고 상업적 옵션의 엄청난 비용과 자체 생산의 복잡성으로 인해 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 생물학적 표본의 CryoEM 구조 측정을 위해 그래핀 단층으로 덮인 EM 그리드를 효과적으로 생성하기 위한 단계별 가이드를 설명합니다(그림 1). 이 상세한 프로토콜을 따름으로써 CryoEM 연구원은 하루에 수십 개의 고품질 그래핀 지지 그리드를 재현성 있게 준비할 수 있습니다. 그래핀 코팅 그리드의 품질은 LaB6 필라멘트가 장착된 저가형 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 쉽게 검사할 수 있습니다.

프로토콜

1. 그래핀 그리드 제작에 필요한 재료 및 액세서리 준비

알림: 그래핀은 쉽게 오염되어 그래핀 코팅의 효율성과 그래핀 그리드의 품질을 감소시킵니다. 따라서 그래핀과 접촉하는 모든 물질을 철저히 세척하는 것이 중요합니다. 재료 준비 및 모든 단계는 흄 후드에서 처리해야 합니다.

1. 그래핀으로 그리드를 코팅하는 데 사용할 필요한 재료를 수집합니다(그림 2A).
2. 유리 제품을 탈이온수(DI)로 여러 번 헹구어 먼지, 보푸라기 및 기름진 잔여물을 제거합니다.
3. 일회용 물티슈를 사용하여 75% 에탄올로 유리 커버슬립을 청소하고 공기 먼지떨이를 사용하여 오염 물질을 제거하십시오.
   알림: 이 프로토콜에 사용되는 클램핑 TEM 그리드 홀더 블록은 최대 45개의 그리드를 수용할 수 있습니다. 그래핀 그리드의 대량 생산의 경우 한 번에 45개 이하의 그리드를 준비할 수 있습니다. 그러나 실험실에서 분석법이 확립될 때까지 소량 생산(4-6개 그리드)으로 시작하는 것이 좋습니다.

2. 물에 0.2M 과황산 암모늄 (APS)의 제조

참고: 이 APS 용액은 이후 단계에서 그래핀/Cu 시트에서 구리(Cu) 지지체를 제거하기 위한 에칭제로 사용됩니다. 항상 신선한 APS 용액을 준비하십시오. 재사용되거나 오래된 용액은 구리를 효과적으로 에칭하지 않으며 이후 단계에서 그래핀에 구리 잔류물을 남길 수 있습니다.

1. 500mL 플라스크를 탈이온수(DI) 물로 헹군 다음 탈이온수 200mL를 넣고 최대 설정을 사용하여 약 1분 동안 전자레인지에 돌려 물의 가스를 제거합니다.
2. 탈이온수 200mL에 과황산암모늄 9g을 첨가하여 0.2M APS의 용액을 생성합니다.
   주의 : APS는 독성이 있으므로 APS를 취급할 때 개인 보호 장비(PPE)를 착용하는 것이 좋습니다. APS 폐기물을 승인된 폐기물 처리장에 버리십시오.
3. 플라스크를 흄 후드 아래의 진공 소스에 연결하면서 자석 교반기의 교반 막대로 용액을 저어줍니다.
   알림: APS 용액을 탈기하면 기포 형성을 방지하는 데 도움이 되며, 이는 6단계에서 Cu 에칭의 효율성을 감소시킬 수 있습니다.

3. 그래핀/구리를 압지로 깨끗한 커버슬립에 옮깁니다.

참고 : 우리는 그래 핀 공급 업체의 Cu에 15 x 15cm 화학 기상 증착 (CVD) 그래 핀 필름을 사용합니다. 상업적으로 구입한 단층 그래핀/Cu 시트는 진공 상태에서 보관해야 합니다. 그래핀은 CVD 방법에 의해 Cu의 양면에 성장하기 때문에 그래핀 공급업체는 일반적으로 품질 검사를 수행하고 더 나은 면을 사용하도록 권장합니다. 우리는 이 프로토콜에서 그래핀의 이 권장 면을 "상단" 면이라고 하고 다른 쪽은 "후면"이라고 합니다.

1. 압지를 약 20mm x 40mm의 직사각형 모양으로 자릅니다. 이 압지는 그래핀/Cu 시트의 패딩으로 사용되며 그래핀/Cu 시트를 코팅하는 데 사용되는 과량의 메틸 메타크릴레이트(MMA(8.5) MMA EL6)를 흡수합니다. 따라서 반드시 사용하는 그래핀/Cu 시트보다 큰 크기로 잘라야 한다.
2. 폴리이미드 테이프를 사용하여 압지의 네 모서리를 홈메이드 스핀 코터에 맞는 깨끗한 커버슬립 상단에 테이프로 붙입니다.
   참고: 폴리이미드 테이프는 얇고 쉽게 제거할 수 있어 취급이 쉽기 때문에 사용됩니다.
3. 진공 저장소에서 그래핀/Cu 시트 한 조각을 제거합니다.
4. 깨끗하고 먼지가없는 가위를 사용하여 Cu- 그래 핀 시트의 작은 사각형을 조심스럽게 자르면 준비 할 그리드 수를 완전히 덮을 수 있습니다. 예를 들어 5 x 5 배열로 배열된 25개의 그리드의 경우 18mm x 18mm 조각을 자릅니다. 깨끗하고 마른 핀셋으로 압지 위에 그래핀/Cu 시트를 놓습니다. 그래핀/Cu 시트의 뒷면이 아래를 향하도록 하고, 그래핀/Cu 시트는 윗면과 뒷면을 구분하기 어려우므로 실수로 뒤집히지 않도록 주의한다.
5. 그래핀/Cu 시트의 네 모서리를 압지/커버슬립에 테이프로 붙여서 테이프로 덮인 영역이 다음 단계에서 MMA로 덮이지 않기 때문에 테이프와 그래핀/Cu 시트 사이의 접촉량을 최소화합니다.
   알림: 정전기 방전은 그래핀 필름을 손상시킬 수 있으므로 그래핀 또는 그래핀 그리드를 취급할 때 전기적으로 접지된 상태를 유지하고 정전기 축적을 최소화하는 것이 좋습니다. 이것은 그래핀 또는 그래핀 그리드를 다루기 직전에 손목 접지 스트랩을 착용하거나 접지된 금속 물체를 만져 수행할 수 있습니다.

4. 단층 그래핀/Cu 시트에 MMA(8.5)MMA EL6(MMA)를 얇게 코팅합니다.

참고: Cu가 에칭된 후 이 MMA 층은 그래핀 단층을 지지하여 향후 단계에서 그래핀 시트를 처리할 수 있습니다. MMA 코팅은 또한 그래핀 단층만이 투명하기 때문에 그래핀 필름의 시각화를 가능하게 합니다.

1. 테이프로 감싼 그래핀/Cu 시트가 있는 커버슬립을 흄 후드 내부의 홈메이드 스핀 코터(컴퓨터 팬을 사용하여 조립할 수 있음)에 놓습니다(그림 2B), Han et ^al.25.
2. 보안경을 착용하고 그래핀 시트에 유리 피펫을 사용하여 MMA 두 방울을 떨어뜨리고 즉시 최대 속도로 회전을 시작합니다.
3. 회전하는 동안 중앙에 두 방울을 더 추가합니다. 1분 동안 돌립니다.
   알림: 그래핀을 완전히 코팅하기 위해 충분한 MMA가 적용되었는지 확인하십시오. 확실하지 않은 경우 몇 방울을 더 추가합니다. 그래핀이 완전히 코팅되지 않은 경우, Cu가 에칭된 후 필름에 "구멍"이 나타납니다.
4. 흄 후드 내부에서 10분 동안 자연 건조시킵니다.

5. graphene/Cu 시트 뒷면의 graphene을 제거합니다.

참고: 구리의 뒷면(MMA로 코팅되지 않은 면)에서 성장한 그래핀은 이 과도한 그래핀이 Cu 에칭의 효과를 감소시키기 때문에 후속 단계를 진행하기 전에 제거해야 합니다. 그래핀을 플라즈마에 노출시켜 이 그래핀을 제거하며, 이는 생물학적 시료 전처리를 위해 EM 그리드를 준비하는 데 일반적으로 사용되는 글로우 방전 장치를 사용하여 수행할 수 있습니다.

1. 테이프를 조심스럽게 제거하고 깨끗하고 마른 핀셋으로 커버슬립에서 MMA 코팅 그래핀/Cu 시트를 들어 올립니다.
2. MMA 면이 아래로 향하도록 MMA/그래핀/Cu 시트 조각을 테이프로 붙여서 깨끗하고 먼지가 없는 유리 커버슬립에 붙입니다.
3. MMA/그래핀/Cu 시트가 있는 커버슬립을 글로우 배출 장치에 넣고 음성 염색 또는 CryoEM 샘플 준비를 위한 그리드를 준비할 때 일반적으로 사용되는 설정을 적용합니다.
   참고 : 그래 핀 필름에 산화 구리 (CuO) (나노) 입자가 오염 될 수있는 뒷면의 Cu 산화를 방지하기 위해 장시간 글로우 방전을 피해야합니다.

6. APS 용액에서 MMA/그래핀/Cu 시트에서 Cu를 에칭합니다.

1. 흄 후드에서 갓 만든 APS 용액 200mL를 깨끗하고 먼지가 없는 결정화 접시(150 x 75mm)에 붓습니다.
2. 유리 슬라이드에서 MMA/그래핀/Cu 시트를 제거합니다. 어느 쪽에 MMA가 있는지 추적하십시오.
3. 에칭을 시작하려면 플라즈마 처리된 Cu 면이 아래로 향하도록 MMA/그래핀/Cu 시트를 APS 용액 표면에 놓습니다. 먼지가 들어가지 않도록 넓은 유리 비커를 알루미늄 호일이나 뚜껑으로 덮습니다.
4. 3 시간 동안 배양합니다. 1시간 후에도 대부분의 Cu가 에칭되지 않으면 섹션 2-6의 단계를 반복한 후 다음 단계를 계속합니다.
   참고 : 대부분의 Cu가 1 시간 후에 에칭되지 않으면 필름의 MMA / 그래 핀 측면이 Cu 측이 아닌 APS 용액의 표면에 놓였을 가능성이 있습니다. Cu는 3시간 후에 완전히 에칭되어야 하며, Cu가 완전히 에칭되면 MMA/그래핀 필름은 무색입니다. 그래핀은 쉽게 오염되므로 표면에 보푸라기나 기름기 많은 잔여물이 쌓이지 않도록 용기를 덮어야 합니다., 그래핀의 품질에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다.

7. MMA/그래핀 필름을 탈이온수로 헹굽니다.

1. 흄 후드에서 깨끗하고 먼지가 없는 결정화 접시에 DI 물을 채웁니다.
2. APS 용액 표면을 기준으로 ~45° 각도로 배치된 깨끗하고 먼지가 없는 유리 커버슬립으로 그래핀-MMA 필름을 부드럽게 퍼냅니다.
3. 유리 슬라이드를 물에 거의 90° 각도로 배치하고 유리 커버슬립을 물 속으로 부드럽게 내려 MMA/그래핀이 슬라이드에서 천천히 미끄러져 물 표면에 뜨도록 합니다.
4. MMA/그래핀 필름을 수면에 1시간 동안 그대로 두어 APS를 씻어냅니다.

8. 그래핀 단층으로 코팅할 그리드를 청소합니다.

알림: 그래핀이 전송될 그리드는 그리드 호일 표면에 그래핀이 최대한 부착되는 것을 최대화하기 위해 가능한 한 깨끗해야 합니다. 상업적으로 구매한 그리드에는 그래핀 전송 전에 제거해야 하는 잔류 오염 물질이 포함되어 있는 경우가 많습니다.

1. 먼지가 없도록 3 개의 결정화 접시를 청소하고 말리십시오.
2. 흄 후드에서 클로로포름, 아세톤 및 이소프로필 알코올(IPA) 200mL를 세 가지 결정화 접시 각각에 붓습니다. 유기 용매의 증발을 최소화하기 위해 결정화 접시를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
   주의 : 클로로포름과 아세톤은 피부 자극을 일으키며 흡입하면 유독할 수 있습니다. 이러한 유기 용제에 대한 노출을 제한하고 PPE를 착용하십시오.
3. 클램핑 TEM 그리드 홀더 블록의 베이스를 클로로포름 200mL가 들어 있는 첫 번째 결정화 접시의 바닥에 놓습니다.
4. 각 그리드를 그리드 상자에서 그리드 홀더 블록의 웰로 개별적으로 전송하여 창공 필름 면이 위를 향하도록 합니다. 결정화 접시를 알루미늄 호일로 덮고 궤도 셰이커에 놓고 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
5. 그리드 홀더 블록에 금속 뚜껑을 놓으면 다음 결정화 접시로 이동하는 동안 그리드가 고정됩니다. 구부러진 포크와 긴 핀셋을 사용하여 결정화 접시에서 그리드 홀더 블록을 조심스럽게 들어 올려 200mL의 아세톤이 들어 있는 두 번째 결정화 접시의 바닥에 놓습니다. 그리드 홀더 블록에서 뚜껑을 제거하고 오비탈 셰이커를 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
6. 그리드 홀더 블록에 뚜껑을 놓고 200mL의 IPA 용액이 들어 있는 결정화 접시로 옮겨 아세톤 잔여물을 제거합니다. 그리드 홀더 블록에서 뚜껑을 제거하고 20분 동안 부드럽게 흔듭니다.
7. 창공 필름 면이 그리드 홀더 블록에서 위를 향하도록 그리드를 압지로 덮인 유리 페트리 접시로 개별적으로 옮깁니다.
8. 흄 후드 아래에서 그리드를 최소 30분 동안 건조시키고 그리드가 먼지가 떨어지지 않도록 덮도록 합니다.

9. 깨끗한 그리드를 탈이온수 아래의 스테인리스 스틸 와이어 메쉬 또는 천공된 트레이에 놓인 압지로 옮깁니다.

알림: 그리드는 그래핀이 물 위에 떠 있고 그리드 위로 내려갈 수 있도록 평평한 표면의 DI 물 아래에 잠겨야 합니다. 이는 Palovcak et ^al.18에 의해 기술된 바와 같이, 상업용 그리드 코팅 트로프를 사용하거나 페트리 접시 및 연동 펌프를 사용하여 수행할 수 있습니다.

1. 스테인리스 스틸 메쉬 또는 트레이를 그리드 코팅 트러프에 놓고 DI 물로 헹굽니다.
2. 스테인리스 스틸 메쉬/트레이보다 약간 작은 압지를 잘라 DI 물에 담근 플랫폼 위에 놓습니다.
   알림: 압지는 이동 및 취급이 가능하도록 플랫폼보다 약간 작습니다.
3. 청소한 격자를 창공된 필름 면이 압지 위에 위로 향하도록 하여 부드럽게 옮깁니다. 그리드는 소수성일 가능성이 높으므로 그리드를 수직으로 물에 담그거나 물 장력으로 인해 구부러질 수 있습니다. 그리드를 정사각형 배열로 배치하여 가능한 한 서로 가깝지만 겹치지 않도록 합니다(그림 2C).
4. 이제 그리드를 그래핀 단층으로 코팅할 준비가 되었습니다. 격자 코팅 통에 더 많은 탈이온수를 채워 물 표면이 격자 위로 최소 5mm 이상 오도록 합니다.

10. 그래핀을 그리드로 옮깁니다.

1. 그래핀 필름에서 약간 떨어진 곳에 비스듬히 커버슬립을 천천히 내려 깨끗한 커버슬립으로 결정화 접시에서 MMA/그래핀 필름을 조심스럽게 퍼냅니다. 시트의 가장자리와 커버슬립이 평행이 되도록 커버슬립을 그래핀-MMA 시트 아래에 놓은 다음 커버슬립을 수직으로 물 밖으로 들어 올려 MMA/그래핀 필름을 가져옵니다.
2. 커버슬립을 ~45° 각도로 물 속으로 내려 MMA/그래핀 필름을 트로프로 옮기면 MMA/그래핀 필름이 커버슬립에서 분리되어 물 표면에 뜨게 됩니다.
3. 수위가 낮아지기 전에 MMA/그래핀 필름을 그리드 바로 위에 놓습니다. 팁이 녹아 개구부를 밀봉한 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 MMA/그래핀 필름의 위치를 조심스럽게 조작합니다.
4. MMA/그래핀 필름이 여과지에 닿을 때 그리드 표면을 완전히 덮을 수 있도록 주사기로 약 1.25mL/분의 속도로 수위를 천천히 낮춥니다
   알림: 수위가 떨어질 때 그리드 위의 위치를 유지하기 위해 그래핀-MMA 시트의 추가 조작이 필요할 수 있습니다.
5. 깨끗하고 마른 핀셋을 사용하여 그리드를 고정하는 압지를 깨끗하고 건조하며 먼지가 없는 페트리 접시로 들어 올리거나 전체 스테인리스 스틸 플랫폼을 옮깁니다.
6. 흄 후드 아래에서 MMA/그래핀 그리드를 최소 30분 동안 자연 건조합니다. 먼지 입자로 인한 오염을 방지하기 위해 그리드를 알루미늄 호일이나 뚜껑으로 덮으십시오.
7. 그리드를 인큐베이터로 옮기고 65°C 인큐베이터에서 30분 동안 베이킹합니다.
8. 인큐베이터에서 그리드를 제거하고 실온에서 5분 동안 뚜껑을 덮은 상태로 두어 그리드를 실온으로 식힙니다.

11. MMA 제거 및 그리드 청소

알림: MMA는 그래핀 코팅된 그리드에 잔류 MMA를 방지하기 위해 아세톤으로 완전히 씻어내야 합니다.

1. 흄 후드에서 실온에서 200mL의 아세톤을 포함하는 두 개의 결정화 접시와 200mL의 이소프로판올(IPA)을 포함하는 하나의 결정화 접시를 준비합니다. 유기 용매의 증발을 최소화하기 위해 결정화 접시를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
   주의 : 아세톤은 피부 자극을 유발할 수 있고 흡입하면 해로울 수 있으므로 취급 시 PPE를 착용하십시오.
2. 클램핑 TEM 그리드 홀더 블록의 베이스를 200mL의 신선한 아세톤이 들어 있는 첫 번째 결정화 접시의 바닥에 놓습니다.
3. 각 그리드를 압지에서 그리드 홀더 블록의 웰로 개별적으로 전송하여 MMA 쪽이 위를 향하도록 합니다. 결정화 접시를 호일로 덮고 궤도 셰이커에 놓고 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
4. 그리드 홀더 블록에 금속 뚜껑을 놓으면 다음 결정화 접시로 이동하는 동안 그리드가 고정됩니다. 구부러진 포크와 긴 핀셋을 사용하여 결정화 접시에서 그리드 홀더 블록을 조심스럽게 들어 올려 200mL의 신선한 아세톤이 들어 있는 두 번째 결정화 접시의 바닥에 놓습니다. 그리드 홀더 블록에서 뚜껑을 제거하고 오비탈 셰이커를 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
5. 그리드 홀더 블록에 뚜껑을 놓고 200mL의 IPA 용액이 들어 있는 결정화 접시로 옮겨 아세톤 잔여물을 제거합니다. 그리드 홀더 블록에서 뚜껑을 제거하고 20분 동안 부드럽게 흔듭니다.
6. 그리드를 압지로 덮인 작은 유리 페트리 접시에 옮기고 그리드를 최소 10분 동안 자연 건조시킵니다. 먼지 입자로 인한 오염을 방지하기 위해 그리드를 뚜껑으로 덮은 상태로 유지하십시오.
7. 그리드는 진공 데시케이터 내부의 알루미늄 호일로 포장된 그리드 박스로 사용하거나 옮길 준비가 되었습니다.
   알림: 그래핀 그리드를 진공 데시케이터 내부에 보관하면 주변 조건에서 소수성 입자가 오염되는 것을 방지할 수 있습니다. 이러한 그리드는 사용하기 전에 최대 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다²⁷.

12. UV/오존 처리로 친수성 그래핀 그리드를 렌더링합니다.

참고: 그래핀은 극소수성으로, 블롯 플런지 접근법에는 샘플 방울이 고르게 퍼질 수 있는 친수성 표면이 필요하기 때문에 CryoEM 시료 전처리와 호환되지 않습니다. 기존의 글로우 방전 장치는 플라즈마를 부드럽게 펄스하여 그래핀 표면을 친수성으로 만들도록 구성할 수 있지만, 이러한 장치는 얇은 그래핀 단층을 파괴하는 경향이 있습니다. UV/오존 클리너를 사용하여 그래핀²⁵의 표면에 부분적으로 산소를 공급하여 단층을 손상시키지 않고 CryoEM 샘플 준비를 위한 친수성을 만들 수 있음을 이전에 보여주었습니다.

1. 프라이밍이 필요한 UV/오존 시스템을 사용하는 경우 시스템을 켜고 l을 프라이밍합니다.amp 10분 동안(이 단계에서 그리드가 노출되지 않았는지 확인). UV/오존 클리너가 프라이밍되는 동안 진공 데시케이터에서 그리드를 제거하고 깨끗한 커버슬립으로 옮깁니다.
2. UV/오존 시스템이 준비되면 그래핀 면이 위를 향하도록 그리드가 포함된 커버슬립을 UV/오존 클리너에 놓고 그리드를 오존 가스에 4분 동안 노출시킵니다.
3. 오존에 노출된 후 CryoEM 시료 전처리를 위해 그리드를 즉시 사용하십시오.
   알림: 프라이밍이 필요한 UV/오존 시스템을 사용하는 경우 램프가 10분 동안 프라이밍된 직후 그리드를 클리너에 넣어야 하며, 그렇지 않으면 샘플 준비를 위해 그래핀에 산소를 공급하기에 충분한 오존 가스를 생성하기에는 너무 차가울 수 있습니다. 그리드를 오존 가스에 6분 이상 노출시키면 그래핀 층이 파괴됩니다.

결과

여기에 설명된 그래핀 그리드 제조 프로토콜을 성공적으로 실행하면 그래핀의 단일 단층으로 완전히 코팅된 EM 그리드가 생성됩니다. 그리드의 그래핀 커버리지는 모든 TEM을 사용하여 확인할 수 있습니다. 깨끗한 그래핀의 단층은 TEM에서 거의 보이지 않기 때문에 현미경의 회절 모드를 사용하여 검사하고 그래핀을 구성하는 탄소 원자의 육각형 조직에 해당하는 브래그 스폿을 관찰해야 합니다(그림 3A). MMA 코팅 중에 발생하는 단층 그래핀의 일부 주름이 가끔 관찰되는 것은 정상입니다(그림 3B). 또한 그래핀으로 덮인 구멍 중 하나의 중앙에서 고배율 이미지를 획득하여 그래핀에 존재하는 오염 수준을 확인할 수 있습니다(그림 3C). 고해상도 검출기로 획득한 경우 이 이미지의 푸리에 변환에는 2.14Å에서 탄소-탄소 간격에 해당하는 브래그 스폿이 포함되어야 합니다(그림 4C). 탄소 원자의 단층은 위상차를 생성하기에 충분한 전자 산란을 생성하지 않으므로 깨끗한 그래핀의 이미지는 이미지의 푸리에 변환에서 대비 전달 함수와 관련된 톤 고리를 나타내지 않습니다. 그러나 그래핀 그리드가 생성된 후 오염을 방지하는 것은 매우 어려우며, EM 그리드를 충분히 세척하지 않거나 그래핀 코팅 후 MMA를 제거하면 실제 공간 이미지에서 볼 수 있는 그리드에 현저한 오염 물질이 발생합니다(그림 3C). 그림 4에서 볼 수 있듯이 그래핀 그리드는 0.5mg/mL의 아포페리틴을 그래핀 지지체가 있는 경우(그림 4A)와 없는 구멍이 있는 금 그리드에 적용할 때 관찰되는 바와 같이 샘플에 집중 효과가 있습니다(그림 4B). 유사한 그래핀 제조 프로토콜은 고분해능^25,27에서 아포페리틴과 같은 단백질의 CryoEM 구조를 해결하기 위해 이전에 설명되었습니다.

그림 1: 그래핀 코팅 CryoEM 그리드를 준비하기 위한 개략도. 그래핀 그리드 제조 과정의 주요 단계가 설명되어 있습니다. 약어: cryoEM = cryogenic electron microscopy; MMA = 메틸 메타크릴레이트; APS = 과황산암모늄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 그래핀 그리드를 만드는 데 필요한 재료. (A) Cryo-EM 그리드를 코팅하는 데 필요한 재료는 그에 따라 라벨이 부착됩니다. (B) 그래핀/Cu 시트를 유리 슬라이드의 압지에 테이프로 붙인 코터의 클로즈업 보기. 스핀 코터는 지역 컴퓨터/철물점에서 부품을 구입하여 조립할 수 있습니다. (C) 수위를 제어하는 데 사용할 수 있는 주사기에 부착된 그리드 코팅 트러프의 클로즈업 보기. 그리드는 스테인리스 스틸 메쉬의 압지 위에 배치됩니다. 압지는 그래핀 시트가 그리드와 일치할 수 있도록 그리드의 위치를 조작하는 데 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 주름 또는 MMA 오염을 보여주는 그래핀 그리드의 대표적인 회절 패턴 이미지 및 명시야 이미지. (A) 그래핀 단층으로 덮인 EM 그리드는 회절 모드의 TEM에서 이미지화할 때 그래핀의 육각형 격자에 해당하는 브래그 피크를 보여줍니다. 2.14 Å 탄소-탄소 간격에 해당하는 브래그 피크는 원으로 표시되고 화살표로 표시됩니다. (B) 그래핀 단층에 약간의 주름(화살표로 표시)이 있는 단층 그래핀 그리드의 명시야 이미지. (C) MMA 오염이 있는 단층 그래핀의 명시야 이미지(화살표로 표시). 척도 막대 = 100nm(B,C). 약어: EM = 전자 현미경; MMA = 메틸 메타크릴레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 그래핀으로 덮인 금 격자의 아포페리틴: (A) 그래핀으로 덮인 금 격자에 있는 0.5mg/mL 아포페리틴의 CryoEM 현미경 사진. (B) 동일한 농도로 이미징된 아포페리틴은 그래핀이 없는 구멍이 뚫린 금 격자를 사용하여 제조할 때 실질적으로 더 낮은 농도에서 볼 수 있습니다. (C) 그래핀으로 덮인 금 격자에 0.5mg/mL 아포페리틴의 CryoEM 현미경 사진의 FFT, 브래그 피크는 육각형 그래핀 격자에 해당합니다. 척도 막대 = 100nm(A,B). 약어: cryoEM = cryogenic electron microscopy; FFT = 고속 푸리에 변환. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

유리질 얼음의 얇은 층에서 생물학적 시료를 보존하는 것은 고분해능 CryoEM 구조 측정에 매우 중요한 단계입니다. 그러나 연구자들은 AWI와의 상호 작용으로 인해 발생하는 문제에 자주 직면하는데, 이는 선호 방향, 복잡한 분해, 변성 및 응집을 유발합니다. 더욱이, 샘플은 창호 필름의 구멍에 매달려 있는 얇은 얼음을 채울 수 있을 만큼 항상 충분히 농축될 수 없습니다. 여러 연구 그룹은 이러한 한계 24,25,26,27,28,29,30 중 일부를 극복하는 데 도움이 되도록 그래핀의 단층으로 EM 그리드를 코팅하는 방법을 개발했으며 그래핀 그리드는 큰 성공을 거두었습니다. 여기에서는 사내에서 그래핀 그리드 배치를 효과적으로 준비하고 TEM으로 그래핀 그리드의 품질을 검사하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 우리는 아래에 요약된 몇 가지 중요한 단계에서 특별한 주의를 기울여야 함을 강조합니다.

그래핀은 공기 중 오염 물질을 끌어들이는 경향이 강합니다. 따라서 그래핀 그리드 제조 과정에서 그래핀/Cu 시트 또는 그리드와 접촉하는 모든 도구가 깨끗하고 먼지가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 그래핀을 옮기는 데 사용되는 유리 커버슬립은 에탄올과 탈이온수로 헹구거나 에어 더스터를 사용하여 청소할 수 있습니다. 또한 흄 후드 아래에서 작업하고 그래핀 시트와 그리드를 항상 호일이나 깨끗한 유리판으로 덮은 상태로 유지하는 것이 좋습니다. 그리드의 먼지나 오염 물질은 그래핀이 EM 그리드에 완전히 부착되는 것을 방해할 수 있습니다. 그래핀 또는 그래핀 코팅 그리드를 취급할 때는 정전기 방전으로 인한 그래핀 필름의 손상을 방지하기 위해 전기적으로 접지하는 것이 중요합니다. 정전기 방전은 손목 접지 스트랩을 사용하거나, 그래핀 또는 그래핀 그리드를 취급할 때마다 접지된 금속 물체를 만지거나, 및/또는 핀셋(²⁴)을 잡는 손에 장갑을 착용하지 않음으로써 피할 수 있다.

그래핀의 단층은 매우 얇기 때문에(탄소 원자의 너비) 그래핀을 그리드로 옮기는 동안 MMA 또는 폴리-MMA(PMMA)와 같은 유기층으로 그래핀을 지지하는 것이 중요합니다. PMMA는 그래핀 전달에 가장 널리 사용되는 재료입니다. 그러나 PMMA는 그래핀과 강한 친화력을 가지며 종종 그래핀 필름에 폴리머 오염을 초래할 수 있습니다. MMA는 잔류 오염을 덜 남기기 때문에 이 프로토콜에서 사용된다²⁵. 그러나 PMMA와 MMA는 모두 그래핀 필름의 일부 영역에서 관찰할 수 있는 주름과 균열을 형성하는 단점이 있습니다(그림 3B). 이러한 주름을 피하는 것은 CVD 방법(³¹)에 의해 그래핀 성장 동안 일반적으로 발생하기 때문에 어려울 수 있다. 주름 없이 울트라 플랫 그래핀을 성장시키기 위한 방법이 최근에 개발되었는데, 이에 의해 동박은 성장 기질(³²)로서 Cu(111)/사파이어 웨이퍼로 대체된다.

당사의 경험에 비추어 볼 때, 구리 에칭 후 부서지기 쉽고 후속 단계에서 다루기 어려운 고분자로 덮인 Cu-그래핀 시트를 제조업체에서 구입하는 것보다 그래핀/Cu 시트를 사내에서 구매하여 MMA로 그래핀을 지지하는 것이 좋습니다. MMA 코팅에 사용한 스핀 코터는 앞서 설명한 대로 로컬 컴퓨터/철물점의 부품을 사용하여 저렴하게 제작할 수 있습니다²⁵.

MMA 코팅 단계에서, Cu-graphene 시트의 그래핀 표면 전체를 MMA로 덮는 것이 중요하다. Cu가 에칭된 후 MMA-그래핀은 반투명해지고 MMA 커버리지가 없는 영역은 빈 구멍처럼 보입니다. 구리 쪽의 MMA 코팅을 방지하려면 코팅하는 동안 CVD 필름에서 회전하는 과도한 MMA를 흡수하도록 그 아래에 작은 압지를 놓는 것이 중요합니다.

에칭 및 헹굼 후 MMA/그래핀 시트는 수위를 제어하기 위해 주사기 또는 연동 펌프가 있는 상업용 또는 수제 트로프 시스템을 사용하여 EM 그리드로 옮길 준비가 됩니다. 이송 단계 전에 클로로포름, 아세톤 및 IPA의 연속 수조에서 그리드를 철저히 헹구는 것이 중요합니다. 그래핀 코팅된 그리드를 65°C에서 베이킹하면 그래핀 무결성을 보존하고 그래핀이 그리드에 흡착되는 것을 촉진합니다. 마지막으로, 그리드의 MMA 오염을 방지하려면 아세톤 수조에서 MMA를 완전히 제거하고 IPA에서 그리드를 청소하는 것이 중요합니다. 세척되지 않은 MMA 잔류물은 EM 그리드에서 관찰되어 이미지의 신호 대 잡음비를 감소시킵니다(그림 3C). 아세톤-IPA 세척 공정을 반복하여 그래핀 표면을 추가로 청소할 수 있습니다.

그래핀 그리드를 친수성으로 렌더링하기 위해 그리드를 UV/오존에 노출시켰습니다. UV/오존 클리너의 다양한 모델은 그래핀을 손상시키지 않고 CryoEM 시료 전처리를 위해 그래핀 층에 충분한 산소를 공급하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다. 시스템에 관계없이 UV/오존 처리 직후 CryoEM 시료 응용 분야에 이러한 그리드를 사용하는 것이 중요합니다. 그래핀 그리드를 친수성으로 렌더링하는 대안적인 방법은 다른 연구들^(33,34)에 기술되어 있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% EtOH	Pharmco (190 pf EtOH)	241000190CSGL
Acetone	Sigma Aldrich	650501-4L
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	215589-500g	Hazardous; use extreme caution
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids	PELCO	16830-45
Computer fan	Amazon (Noctua)	B07CG2PGY6
Cover slip	Bellco Glass	1203J71	Standard cover slips
Crystallizing dish	Pyrex	3140-100
Electronics duster	Falcon Safety Products	75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster	Staples	N/A
Filter papers	Whatman	1001-055
Fine tip tweezer	Dumont	0508-L4-PO
Flask	Pyrex	4980-500
Fork	Supermarket	N/A
Glass pasteur pipette	VWR	14672-608
Graphene/Cu	Graphenea	N/A	CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough	Ladd Research Industries	10840	Fragile
Isopropanol	Fisher Scientific	67-63-0
Kapton Tape	Amazon (MYJOR)	MY-RZY001	Polyimide tape
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Long twzeer	Cole Parmer Essentials	UX-07387-15
Metal grid holder	Ted Pella	16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6	KAYAKU Advanced Materials	M31006 0500L 1GL	Flammable
Model 10 Lab Oven	Quincy Lab, Inc.	FO19013
Petri dish	Pyrex	3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950)	Gatan, Inc.	N/A
Scissors	Fiskars	194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker	VWR	89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300	Quantifoil	N/A	Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems	UVOCS	model T10X10/OES