1. 유지 보수 : 현미경으로 관찰 문화 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 hES 세포 중 하나가 접시를 제거하고 현미경을 가져. </li><li> 전체 문화 품질을 평가하기 위해, 2X 또는 5 배 확대를 사용하여 낮은 전력에서 식민지를 관찰합니다. 다음을 참고 : 정상 중간 색상, 모든 눈에 보이는 오염, 전체 식민지의 크기, 품질 및 밀도의 부재, 그리고 다른 관찰합니다. </li><li> 중간 색상 변화를 관찰. 산도의 변화와 hES 세포와 하룻밤 배양 후 배지의 영양분의 고갈로 인해, 매체는 &quot;지푸라기&quot;컬러에 붉은 색조에서 변경됩니다. 매체 보라색 나타나는 경우, 기본적인 산도의 변화가 발생했습니다. 매체 매우 노란색 나타나면, 매체는 산성 있습니다. 매우 노란색 매체는 물론이나 오염에 극도로 초만원 식민지의 결과 수 있습니다. 매체는 항상 명확 나타납니다. 매체 세포 파편의 특정 수준은 정상입니다하지만, 그것은 흐린 나타나지 않을 것입니다. 세포 파편의 높은 수준을 관찰하면, 문화 건강이 아니므로 오염 수 있습니다. </li><li> 문화가 유지 보수 passaging 필요하지 않으면, 그들은 (섹션 2 참조) 먹이에 생물 학적 안전 캐비닛로 이동하실 수 있습니다. </li><li> 문화가 약​​ 10 % 식민지 차별 개 이상 포함하는 경우, 전지가 수동으로 차별화된 영역 (섹션 3 참조) 제거하여 &quot;청소&quot;한다. </li><li> 문화가 크거나 밀도 식민지를 포함하거나, MEF 피더 층 이상 12일 된 경우, 전지 (섹션 4 참조) passaged해야합니다. </li></ol> 2. 수유 hES 셀 <ol><li> 무균 생물 학적 안전 캐비넷에서 문화 접시의 뚜껑을 제거하고 지출 매체를 대기음. 피펫의 팁을 직접 우물 내부가 아닌 다른 접시의 어떤 부분을 만지는 것을 허용하지 않습니다. 오염의 우려가있다면, 새, 멸균 피펫로 변경합니다. </li><li> 멸균 유리 pipet을 사용하여 각 음에 예열 hES 세포 배양 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 6 잘 플레이트의 문화, 잘 당 2.5 ML 매체를 추가합니다. </li><li> 37 ° C와 5% CO 2 상태로 인큐베이터에 접시를 반환합니다. </li></ol> 3. hES 세포 문화의 차별을 제거 <ol><li> 성형 알코올 버너의 불꽃 제어를 통해 조언에 의해 따기 도구로 9 인치 유리 파스퇴르 pipettes를 변환. 피펫의 팁을가 오염을 방지하기 위해 봉인과 문화 요리의 플라스틱을 긁힘 방지하기 위해 반올림되어 있는지 확인합니다. 사용 생물 학적 안전 캐비넷에서 UV 광원을 사용하거나 인클로저 따기 전에 채집 도구를 소독. </li><li> 차별 영역을 제거합니다. 차별은 종종 일반적으로 가장자리를 따라 또는 중앙에 고립 명소로 hES 세포 콜로니의 단지 부분에 발생합니다. 식민지만이 섹션 차별 경우에만 차별화된 영역은 제거되어야합니다. 차별화는 종종 &quot;끈적끈적한&quot;시트에서 접시를 리프트 수 있으며, 그것은 수확 도구의 마지막으로 식민지를 통해 라인을 그림으로써 식민지의 나머지 부분에서 차별화된 세포를 첫째 분리 도움이됩니다. </li><li> 식민지의 조각이 분리되면 부드럽게 원치 않는 세포를 분리하기 위해 접시 따라 채집 도구를 활강. 이 과정에서 식민지 사이에 너무 많이 MEF의 피더 레이어 멀리 밀고 안됩니다. </li><li> 차별화된 세포의 모든 접시 (그리고 중간에 떠있는)에서 제거됩니다 때, 생물 안전 캐비닛에 문화를 반환합니다. 차별화된 세포를 포함하는 매체를 대기음 신선한 hES 세포 배양 매체로 바꿉니다. </li></ol> 4. Passaging hES 셀 효소 배양 <ol><li> 무균 생물 학적 안전 캐비넷에서 6 잘 문화 접시의 뚜껑을 제거하고 passaged 수 우물에서 보낸 매체를 대기음. 피펫의 팁을 직접 우물 내부가 아닌 다른 접시의 어떤 부분을 만지는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 멸균 유리 pipet을 사용하여 passaged으로 각 잘하기 위해 예열 collagenase IV 1 ML를 추가합니다. </li><li> 5 분 37 ° C 배양기에 플레이트를 반환합니다. </li></ol> 근근이 살아가고 및 hES 세포를 풀링 <ol start="4"><li> collagenase와 세포 잠복기 후, 현미경으로 식민지를 관찰합니다. 효소는 식민지의 가장자리에있는 미묘한 변화를 관찰할 수 있지만 원인이됩니다. </li><li> 생물 학적 안전 캐비닛에서 부드럽게 각 우물에서 효소를 대기음 및 2.0 ML hES 세포 배양 매체로 바꿉니다. </li><li> 팁 문화가 약​​간 당신을 향한 판과 5 ML 유리 pipet 최초의 우물에 2.0 ML 매체를 가져가라. 천천히 매체를 발표하면서 접시의 바닥에 pipet의 직각을 개최하면 부드럽게 잘 건너 pipet 팁을 활강. </li><li> 힘든 및 pipetti를 반복NG 모션 3-4 회는 식민지의 모든 때까지 우물에서 삭제되었습니다. Pipet 부드럽게 조각 너무 작은으로 식민지를 파괴하지 않도록합니다. 세포가 최초의 우물에서 제거된 경우, 우물에 내용을두고 잘 다음의 세포를 근근이 살아가고 시작합니다. </li><li> passaged 수 우물의 모든 스크랩한되었습니다, 수영장 살균 15 ML 원뿔 튜브의 각 우물에서 식민지의 조각을 포함하는 매체를. </li><li> 각 잘하는 hES 세포 배양 매체 1 ML을 추가하여 스크랩한 우물 린스. 이 헹굼과 원뿔 관에 전달 수집합니다. </li><li> 원하는 크기로 식민지 조각을 깨지 튜브 부드럽게 Pipet 세포. </li><li> 200 X G.에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기 </li></ol> hES 셀 전지를 도금 <ol start="12"><li> hES 세포는 원심 분리기에있는 동안, 새로운 6 자 MEF 공급기 플레이트를 준비합니다. 셀 라인, 새로운 통로 번호 및 통로 날짜 : 적절한 hES 세포 정보 접시를 분류. 우물에서 MEF 미디어를 대기음 각 물론 1.0 ML PBS를 추가합니다. 부드럽게 소용돌이는 우물 주위에 버퍼와 PBS 세척을 대기음. 각 물론 1.5 ML hES 세포 배양 매체를 추가하고 접시를 따로 설정할 수 있습니다. </li><li> hES 세포가 centrifuging 완료되면, 생물 안전 캐비닛 다시 튜브를 가져와. 느슨하게 - 포장 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 표면에 뜨는를 대기음. </li><li> 1 ML hES 세포 배양 매체마다 잘 도금 될 정도로 매체와 펠렛의 세포를 Resuspend. 6 개의 새 항목의 우물로 분할은 6 ML 매체에서 펠렛을 resuspend 때. </li><li> 부드럽게하고 균일하게 MEF 피더 판을 잘 준비하기 위해 각 세포 현탁액 1 ML를 추가합니다. </li><li> 37 ° C 배양기에 접시를 놓고 신중하게 고르게 잘 내내 세포를 배포하는쪽으로 뒤로 앞으로 판과 측면을 슬라이드. </li><li> 세포 ° C 야간 37 첨부할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : Undifferentiated hES 세포는 작은 있으며, 단단히 - 포장, 그리고 일반적으로 세포 밖으로 더 크고 확산 구성되어 있습니다. 차별화는 식민지 (그림 1A) 내부 또는 식민지 (그림 3B) 사이에 발생할 수 있습니다. 다른 morhopologies는 현미경으로 낮은 배율에 따라 볼 수 있습니다. 같은 그림 2A에서 본 좋은 세포 형태, monolayer 성장 작은 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 전지없이 차별을 거의 깨끗한 정의 가장자리가 있어야합니다. 그림 2B에 표시된 세포가 passaging 준비하고 있으며, 그림 2C와 같이 세포가 초만원입니다. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. hES 문화의 차별화. 식민지의 (A) 분화 (B) 식민지 사이의 차별화. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Morphologies는 hES 문화에서 본. (A) 좋은 세포 형태 (B) (C) 콩나물 세포를 passaging 준비 hES 세포.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

hES 세포와 함께 작업을 할 때 불임이 항상 유지되어야합니다. 사용하기 전에 생물 학적 안전 캐비닛 및 모든 장비를 청소하고 소독. 모든 시약은 사용하기 전에 0.22 μm의 기공 크기의 필터를 사용하여 필터링해야합니다. hES 세포 문화에 antiboiotics의 사용은 필요하지 않으며 피해야한다. 별도의 환경을 지정 따기 스테이션으로 설정해야합니다. 역에 대한 살균 인클로저는 자외선 광원, 층류 후드, 또는 생물 학적 안전 캐비닛과 정적 인클로저 (예 : PCR 워크 스테이션 등)하실 수 있습니다. 따기 기지 내부의 해부 현미경은 차별화된 영역이 제거됩니다으로 식민지를 관찰하기 위해 필요합니다. 정적 인클로저 또는 생물 학적 안전 캐비닛의 전면 유리 패널은 적절한 공기 흐름 및 불임을 손상시키지 않고 패널을 통해 확장할 수있는 현미경의 oculars 수 있도록 수정해야합니다. 건강한 hES 세포 문화를 유지하기 위해 세포는 일반적으로 모든 4~7일, 최적의 시간에 passaged해야합니다. 이때 식민지들은 최대 크기에 도달하고 병합 시작 수 있습니다. 병합된 식민지의 문화에 분화의 속도를 높일 수 있습니다. 분할 비율은 일반적으로 도금 식민지, 확장 속도, 문화 조건의 개수에 따라 1시 3분과 1시 5분 사이의 가을. Overplated 식민지 (너무 낮은 분할 비율)은 가능성이 완전히 병합하고 그들의 최대 크기에 도달하기 전에 passaged해야합니다. 이상의 이주 된 MEF 피더 계층에 대한 문화가 undifferentiated 성장과 확산을 지원하는 새로운 MEFs에 passaged해야합니다. 차별 자연스럽게 hES 세포 배양에서 발생 이후, 소량 예정입니다. 문화가 적절한 치료를받지 못하면 자주하거나 과도한 차별이 발생할 수 있습니다. 세포가 매일 공급해야하며, 통로 사이의 전면에 자라난 것은 피해야한다. 항상 신선한 시약을 사용합니다. 미디어 MEFs 및 시약의 모든 undifferentiated hES 세포의 성장을 피하기 위해 14 일 이내에 사용해야합니다. 이러한 넉아웃 세럼 교체, FBS 및 MEFs 같은 시약의 새로운 많이는 사용하기 전에 검사해야합니다. passaging 이전에 제거되지 않은 차별화된 세포가 새로운 문화로 전송됩니다 잊지 마십시오. 또한 ° C 가능한 37 세포를 유지하려고합니다. 세포는 세포가 오랜 기간에 대한 보육이 될 경우에는 온수 현미경 무대가 아주 도움이 될 수 있습니다 (현미경의 무대에서 또는 생물 학적 안전 캐비넷에서 예.) 배양기 밖을 보내고 시간을 최소화합니다. 현미경 hES 세포 배양을 관찰하면, 먼저 식민지보기가 낮은 전력 (2X 또는 5 배)를 사용하여 목표의 전반적인 품질과 크기를 평가. 잠재적 차별화된 세포는 낮은 전력에서 관찰하는 경우, 높은 배율의 목표를 (10X)를 사용하여 차별화된 형태를 확인합니다. 바로 차별을 제거 후, ​​식민지의 가장자리는 톱니 또는 손상된 나타날 수 있습니다. 나머지 undifferentiated 세포 복구할 수 있도록 새로운 매체 하룻밤 식민지를 품어. 문화 분화의 영향없이,이 남은 식민지는 정상적으로 세포 분열 따위에 의해 번식 나갈 것입니다. 가능하면 낮은 통로 hES 세포를 사용하여 실험을 시작합니다. 모든 주요 실험 전후의 세포 핵형.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

인간의 배아 줄기 (hES) 세포는 건강한, undifferentiated 문화를 유지하기 위해 모니터링 및 치료를해야합니다. 최소한 문화가 손실 영양분을 보충하고 원하지 않는 차별화 요인의 무료 문화를 유지하는 완벽한 매체 변경을 수행하여 매일 공급해야합니다. 차별화의 소량의 정상과 줄기 세포 배양에 예상이지만, 문화는 정기적으로 수동으로 제거하거나, 차별화된 지역 &quot;을 따기&quot;로 청소해야합니다. 식별 및 hES 세포 배양에서 초과 차별을 제거하면 세포의 건강한 인구의 유지에 필수적인 기술입니다.

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Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

이 프로토콜은 건강, undifferentiated 인간의 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.4K 조회수.  Stemgent. 이 프로토콜은 건강, undifferentiated 인간의 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

연구

생물학

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...