이 작품은 국가 자연 과학 재단의 중국 (21435008 및 호우를 21327006), 그리고 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 (호우에 XDB14030200).

1입니다. 준비
<ol><li>
1.0 m m PD0325901의 솔루션 (MEK 억제제)와 3.0 m m CHIR99021 준비 (GSK3 억제제).
	<ol>
<li>PD0325901의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 4.15 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>CHIR99021의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 1.43 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>다음 재구성,-20 ° C에서 aliquots (200 µ L PCR 튜브에 50 µ L/튜브)를 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 냉장고를 사용 하기 전에 실내 온도에 녹여 냉동된 주식을 포함 하는 튜브를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심 분리기 튜브의 1 mL에 Vc의 0.0176 g의 무게와 사용 하기 전에 100 m m의 최종 농도에 살 균 물의 1 mL와 함께 그것을 다시 구성 하기.</li>
	<li>FBS 비활성화: 500ml FBS의 30 분 동안 56 ° C에서 물 욕조에 품 어.</li>
	<li>
마우스 ES 세포 배양에 대 한 기본적인 매체의 600 mL를 준비 합니다.
	<ol>
<li>DMEM/높은 포도 당 매체 (500 mL)의 병을 사용 하 고 40 mL를 제거 합니다.</li>
		<li>DMEM/높은 포도 당 보통 20%의 보충 460 mL 비활성화 FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (107 U/mL 재고 솔루션의 60 µ L), 0.1 m m 비 본질적인 아미노산 (NEAA) (10 m m 재고 솔루션의 6 mL), 1 m m 나트륨 pyruvate (100 m m 재고 솔루션의 6 mL) 2 mM L-글루타민 (200 m m 재고 솔루션의 6 mL), 0.1 m m β-mercaptoethanol (100 m m 재고 솔루션의 600 µ L), 및 33 IU/mL 페니실린과 33 µ g/mL 스 (페니실린 스 솔루션 (10000 IU/mL 페니실린 및 10000 µ g/mL 스) 혼합의 2 개 mL) . 혈 청 매체 기본 매체를 정의 합니다.</li>
		<li>플라스틱 PD0325901의 재고 솔루션의 50 µ L (1.0 m m) 및 Vc (100 m m), 혈 청 매체의 50 mL에 각각, (최종 농도: 1.0 µ M PD0325901 100 µ m Vc), Vc/PD0325901 매체 매체를 정의 하 고. 참고: Vc의 불안정으로 인해 사용 하기 전에 Vc/PD0325901 중간 신선한을 준비 합니다.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여 전송 PD0325901의 재고 솔루션의 50 µ L (1.0 m m) 및 CHIR99021 (3.0 m m), 혈 청 매체의 50 mL에 각각, (최종 농도: PD0325901 1.0 µ M 및 CHIR99021 3.0 µ M), 2i 매체로 매체를 정의 하 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤라틴 코팅 요리를 준비 합니다.
	<ol>
<li>0.1% 젤라틴 용액을 준비: 모자와 함께 유리 시 약 병에 초순의 300 mL에 젤라틴의 0.3 g을 분해 하 고 실내 온도에서 살 균 솔루션 20 분 저장소에 대 한 121 ° C에서 압력솥에 소독.</li>
		<li>실 온에서 15 분 0.1% 젤라틴 용액 2 mL로 세포 문화 요리 (6cm 직경) incubate 고 젤라틴을 발음. 건조 한 공기에서 요리 하 고 그들을 사용 하 여 12 h 이내.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 ES 세포 동결 15ml 원심 관에 매체의 10 mL를 준비: 90 %FBS (9 mL) 및 10 %DMSO (1 mL). 매체를 사용 하 여 1 일 이내.</li>
	<li>냉동 컨테이너를 준비: 냉동 컨테이너의 급지를 100% 이소프로필 알코올을 추가 하 고 오래 된 이소프로필 알코올을 삭제. 모든 5 사용 후 직접 새로운 이소프로필 알코올을 추가 합니다.</li>
	<li>효소 소화 버퍼 만들기: 무게 1.2114 g 100 mM Tris 솔루션을 준비 하 여 추가 초순의 100 mL로 트리 파우더의 pH 7.6 (집중된 HCl 솔루션의 약 0.6 mL)를 조정 하 트리 스 솔루션으로 HCl 솔루션 (약 12 M)를 집중.</li>
	<li>라디오 immunoprecipitation 분석 결과 버퍼 (RIPA 버퍼) 50 mL를 준비: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 m m NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 %NP40, 1 mM EDTA, 1mm EGTA. 1mm DTT, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, X 1과 1 m m와 보충 PMSF 사용 하기 전에. PMSF는 추가 되 면 30 분 이내 버퍼를 사용 합니다.</li>
</ol>2. 젤라틴 코팅 요리에 마우스 ES 세포 성장
<ol><li>미리 따뜻한 마우스 ES 세포 (야생 타입, 129 SvEv) 문화 매체, 트립 신, 고 37 ° c.에 물 목욕에서 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)</li>
	<li>
셀 통로 셀 린스를 요리 접시와 피 펫 2 mL PBS의에서 완전히 중간 발음
	<ol>
<li>피 펫으로 PBS를 제거 하 고 2 mL의 PBS로 세포 세척.</li>
		<li>PBS를 제거 하 고 각 요리에 트립 신-EDTA (0.25%)의 0.3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>트립 신으로 전체 요리를 신속 하 게 커버 하 고 즉시 제거.</li>
		<li>접시에서 세포를 분리 하려면 1 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 넣어. 인큐베이터에서 요리를 꺼내와 trypsin의 작업 종료를 미리 데워 진된 혈 청 매체의 2 개 mL를 추가.</li>
		<li>10 번 피 펫 (5 mL 피 펫 팁)와 resuspending에 의해 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 식민지를 분리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 젤라틴 코팅 접시에 셀 솔루션 (약 190000 세포는 hemocytometer를 계산 하 여)의 2 개 mL의 150 µ L를 전송 및 3 mL 6 cm 문화 접시 당 갓 만든된 Vc/PD0325901 매체의 보충. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.</li>
	<li>잠복기, 하는 동안 모든 24 시간 오래 된 문화 매체를 제거 하 고 2-3 일 후에 Vc 기대 70-80 %confluency 불안정으로 인해 문화 접시에 신선한 Vc/PD0325901-매체의 3 개 mL를 추가.</li>
	<li>도달 후 70-80 %confluency, 세포를 통과 하 고 2.2-2.4 단계에 설명 된 대로 그들의 문화를 계속 합니다.</li>
</ol>3. 고정 및 마우스 ES 세포를 녹여
<ol><li>
마우스 ES 세포를 고정 합니다.
	<ol>
<li>다음 단계 2.2 trypsin으로 요리에서 셀 분리 합니다.</li>
		<li>15 mL 플라스틱 튜브와 3 분 800 x g 및 실 온에서 원심 분리기로 셀을 전송 합니다.</li>
		<li>비 커에는 상쾌한 부드럽게 덤프 하 고 resuspend 셀 펠 릿의 1 mL와 함께 갓 어 중간 했다. 사용 하기 전에 실내 온도 인지 확인 하려면이 단계 전에 동결 중 30 분을 준비 합니다.</li>
		<li>전송 매체 1 mL 피 펫 1.8 mL microcentrifuge 튜브에 세포 고 microcentrifuge 튜브 냉동 컨테이너 합니다. 냉동 컨테이너의 급지에 이소프로필 알코올을 추가 하 고 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 유지.</li>
		<li>-80 ° C 냉동 실에 냉동 컨테이너를 하룻밤 둡니다.</li>
		<li>최대 2-3 년 동안 액체 질소 용기 microcentrifuge 튜브를 전송. 참고: 오래 어 중간 하지 계속 셀 시간 고 셀 DMSO의 독성 때문에-80 ° C 냉동 고에 신속 하 게 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 ES 세포 녹여
	<ol>
<li>전 37 ° C 물 욕조에 혈 청 매체의 50 mL 따뜻한.</li>
		<li>액체 질소 용기에서 포함 하는 셀 유리병 밖으로가 고 출장된 유리병 37 ° C 물 욕조에 담가. 빨리 해 동 물 목욕에 흔들. 1 mL 피 펫 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. 냉동 매체를 희석 하 여 다음 800 x g 및 3 분 동안 실 온에서 원심 관에 미리 데워 진된 혈 청 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 5 mL 피 펫을 사용 하 여 신선한 Vc/PD0325901 매체의 3 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>젤라틴 코팅 접시에 15 mL 튜브에서 셀을 전송 하 고 문화 24 h. 문화에 대 한 셀 2 단계에에서 설명 된 대로 다시 셀.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀에서 총 단백질 추출
<ol><li>1 mL의 PBS로 수집 된 세포를 헹 구 고 800 x g 및 3 분 동안 실 온에서 원심.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 철저 하 게 부드럽게 pipetting DTT, 칵테일, protease 억제제와 PMSF 보완 RIPA 버퍼 셀 펠 릿을 resuspend. RIPA 버퍼의 볼륨은 약 5 x 셀의 작은. 참고: 셀 물의 resuspension 얼음에 실시 합니다.</li>
	<li>RIPA 버퍼 얼음과 원심 분리기에서 13000 x g와 4 ° C 5 분 동안에 30 분에 셀을 계속.</li>
	<li>새로운 튜브는 상쾌한 전송 및 저장할-80 ° c.에 aliquots</li>
	<li>Bradford 단백질 분석 실험 키트와 함께 단백질의 농도 결정 합니다.</li>
</ol>5. 효소를 사용 하 여 단일 Nucleoside에 다이제스트 DNA를 세포 DNA 추출
<ol><li>단계 3.1.1 3.1.2에에서 설명 된 대로 trypsin으로 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>DNA 추출 genomic DNA 정제 키트를 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.</li>
	<li>1 mL 원심 분리기 튜브에서 추출 된 DNA를 저장 합니다. 원심 분리기 튜브에 초순의 100 µ L을 추가 하 고 약 15 배를 pipetting으로 DNA를 분해. 농도 결정 하 고 260에서 흡 광도의 측정에 의해 DNA의 품질 평가 nm 및 280 nm15. DNA 농도 약 500 ng / µ L.</li>
	<li>50 µ L 솔루션 시스템에 DNA의 다이제스트 5 µ g: 100 mM Tris HCl 솔루션, pH 7.6의 5 µ L 추가 (최종 농도: 10 m m), 2 U 송아지 장 인산 가수분해 효소, 1 U DNase I, 0.005 U 뱀 독이 포스, 그리고 DNA의 5 µ g (는 measu에 따라 추가 볼륨을 계산 레드 DNA 농도, ~ 10 µ L) 원심 분리기 튜브 및 증가 초순 물으로 50 µ L 솔루션의 볼륨. 37 ° C에 혼합물을 밤새 품 어. 1000 g 및 튜브의 하단에는 솔루션을 수집 하는 1 분 동안 실 온에서 소화 DNA 솔루션 원심</li>
	<li>원심 분리기 튜브에서 울트라 여과 튜브로 소화 DNA 솔루션을 전송 (분자량 컷오프: 3 kDa) 및 13000 g와 소화 효소를 제거 하려면 30 분 동안 4 ° C 원심 분리기.</li>
	<li>
5mC와 5hmC 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다.
	<ol>
<li>5hmC 분석: 피펫으로 36 µ L의 새로운 분리기를 필터 솔루션 (1 mL) 튜브 및 추가 4 µ L의 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) 3의 최종 농도 가진 nM.</li>
		<li>5mC 분석: 5mC genomic DNA에서의 높은 밀도 인해 튜브 (50-fold 희석), 196 새로운 분리기 관으로 초순의 µ L를 피펫으로 4 µ L 필터 솔루션의 추가. 36 µ L 희석된 솔루션의 새로운 원심 분리기 튜브 전송과 4 µ L의 추가 (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) 50의 최종 농도 가진 nM. [D3]를 사용 하 여-5hmC [D3]-5mC 교정 5hmC 및 5mC, 각각에 내부 표준으로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정 튜브 샘플 솔루션 전송 및 4 ° c.에 저장 5mC 및 5hmC 다중 반응 모니터링 (UHPLC-MS/MS (MRM)) 이전 보고서15에 설명 된 대로 초 고성능 액체 착 색 인쇄기-트리플 4 극 자 질량 분석으로 분석 합니다.</li>
</ol>6. 분석 5mC와 5hmC UHPLC-MS/MS15 를 사용 하 여
<ol><li>
5mC와 5hmC를 분석 하기 위한 다양 한 매개 변수를 설정 UHPLC MS 소프트웨어를 사용 하 여.
	<ol>
<li>새로운 메서드를 설정 합니다. 소프트웨어를 오픈 하 고 클릭 합니다 "파일 | 새로운 | 방법 "입니다. 전시 콘텐츠 "기가" 메시지 상자 "할 저장 하려는 현재 메서드에 대 한 변경" "아니오"를 클릭 합니다.</li>
		<li>샘플러의 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "샘플러 | 설치 | 주입 "입니다. "표준 주입"를 선택 하 고 "주입 볼륨에서 5 µ L" 입력.</li>
		<li>UHPLC에서 펌프의 매개 변수를 구축 합니다.<ol>
<li>클릭 "BinPump2 | 설치 "펌프의 매개 변수를 만들려고. "15 분"에서 "0.25 mL/min" 및 "중지 시간"에서 "흐름"을 설정 합니다.</li>
			<li>"5% 용 매 B" 설정 "최대 600 바"에서 "제한 압력"와.</li>
			<li>클릭 "BinPump2 | 시간표 "차입 5mC 분석에 대 한 매개 변수는 isocratic를 구축 하 행을 추가 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "0.00" 입력. 한 번 더 새 행을 추가 하려면 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "15.00" 입력.</li>
			<li>클릭 "BinPump2 | 시간표 "5hmC 분석에 대 한 그라데이션 차입 매개 변수를 구축 클릭 "행을 추가 하려면 추가. 시간 및 "B %" 5.0에서 0.00을 입력 합니다. 한 번 더 새 행을 추가 하려면 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "3.00" 입력. 6 행을 추가 하려면 다른 6 번에 대 한 "추가"를 클릭 합니다. 시퀀스에서 "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "3.01" "시간"과 "15.0"에서 "B %", "시간"에서 "6.00"와 "B %"에서 "15.0", "6.01" "시간" 및 "100"에 "B %", "10.00" "시간"과 "100.0"에서 "B %", "시간"에서 "10.01"과 "B %"에서 "5.0", "15.00"를 입력 합니다. 참고: 5mC와 UHPLC의 다른 분리 조건 때문에 개별적으로 5hmC의 분석을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>UHPLC에서 열 구획 (TCC)의 온도 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "TCC | 설치 | 온도 (왼쪽) "" 30 ° C "를 입력 하 고.</li>
		<li>QQQ-MS/MS의 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>클릭 "MS QQQ | 중지 시간 | 아니 제한/로 펌프"," 이온 소스 | ESI"," 시간 필터링 | 최대 폭: 0.07 분 ". 설정 "세그먼트 시간: 시작 시간: 0"; "스캔 유형: MRM"; "Div 값: Ms"; "델타 EMV (+): 200"와 "델타 EMV (-): 0".</li>
			<li>5mC, D3의 전환 모니터링 매개 변수를 구축-5mC, dC, 5hmC, 및 D3-5hmC<ol>
<li>클릭 "MS QQQ | 수집 | 세그먼트 검사: 연연: 90"; "Fragmentor: 90"; "충돌 에너지: 5"; "가속기 전압 셀: 4"와 "극성: 긍정적인".</li>
				<li>"복합 이름", "전조 이온", 5mC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "126"에서 "242"에서 "5mC"를 입력 합니다. 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 "행 추가" 새 행을 추가 하려면. 입력 "D3-5mC" "복합 이름", "전조 이온", D3에 대 한 "제품 이온"에서 "129"에 "245"에서-5mC 분석.</li>
				<li>다른 동일한 모드를 사용 하 여 세 행을 보충 한다. "복합 이름", "전조 이온", dC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "112"에서 "228"에서 "dC"를 입력 합니다. "복합 이름", "전조 이온", 5hmC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "142"에서 "258"에서 "5hmC"를 입력 합니다. 입력 D3-5hmC 화합물 이름, "선구자 이온", D3에 대 한 "제품 이온"에서 "145"에서 "261"에서-5hmC 분석.</li>
			</ol>
</li>
			<li>가스 소스 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "MS QQQ | 소스 | 매개 변수 소스: 가스 온도: 300 ℃ "; "가스 흐름: 11 L/분"; "분무기: 15 psi"; "긍정적인 모 세관: 3500 V".</li>
			<li>제안된 된 방법을 저장 합니다. 클릭 "MS QQQ | 악기 | 저장 방법 ". "디렉토리"에 의해 제안된 된 방법에 대 한 경로 선택 하 고 입력 "방법"의 내용을 예 하 여 메서드에 대 한 이름을: 5mC와 5hmC 분석.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UHPLC 분리 및 mononucleosides의 MS/MS 분석
	<ol>
<li>준비 모바일 단계 5mC와 시 토 신 (C) 분석: 솔루션의 모바일 단계와 포 름 산의 500 µ L로 초순의 B. 솔루션 a: 500 mL (최종 농도: 0.1%), 그리고 100% 메탄올 솔루션 b: 500 mL. 모바일 단계 elute 5mC와 C (단계 6.1.3.3에서에서 설정)로 95:5 (v:)에 해결책 A와 B를 혼합. 0.25 mL/min (단계 6.1.3.1에서에서 설정)에 흐름 속도 설정 합니다.</li>
		<li>5hmC 분석에 대 한 용 매 A와 B에 의해 모바일 단계를 준비 합니다. 용 매 A는 2.0 m m NH4HCO3 용액 (pH 9.0) (500 mL), 그리고 용 매 B 100% 메탄올 (500 mL). 최적화 된 그라데이션 차입에 의해 별도 5hmC: 0-3 분, 5.0% 및 95% (v: v); A 3-6 분, 15.0% 및 85% 6-10 분, 100 %B; 10-15 분, 5.0% 및 95 %A (단계 6.1.3.4에서에서 설정). 0.25 mL/min (단계 6.1.3.1에서에서 설정)에 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분석 하는 열에서 차입 고 긍정적인 이온 모드 (단계 6.1.5.2.1에서에서 설정)을 채택 MRM 모드 (단계 6.1.5.1에서에서 설정) 분무 MS/MS를 이용 한다.
	<ol>
<li>전환 모니터링: 5mC, m/z 242→126 (충돌 에너지, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (단계 6.1.5.2.2에서에서 설정).</li>
		<li>+3,500 V (단계 6.1.5.3에서에서 설정)에 모 세관 및 조각 전압을 설정 하 고 90 (설정 단계 6.1.5.2.1에서에서), 각각.</li>
		<li>5 µ L에서 주입 볼륨을 설정 하 고 분석 하는 각 샘플 3 번 (6.1.2 단계에서 설정). 5mC와 5hmC의 양을 평가 하 해당 표준 곡선을 사용 합니다.<ol>
<li>5mC의 표준 곡선 설정: 전송 1-50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, 최종 농도) 원심 분리기로 5mC의 표준 솔루션 튜브 및 추가 50 nM [D3]-튜브 5mC. 보충 50 µ L. 총 볼륨 5mC 샘플 (6 단계)에 대 한 지침에 따라 표준 5mC의 분석을 수행 합니다.</li>
			<li>5hmC의 표준 곡선을 작성: 1-20 nM를 전송 (1, 2, 5, 10, 20 nM, 최종 농도) 원심 관 3을 추가 하는 5hmC의 표준 솔루션 nM [D3]-튜브를 5hmC. 보충 50 µ L. 총 볼륨 5hmC 샘플 (6 단계)에 대 한 지침에 따라 표준 5hmC의 분석을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 통계적 의미 분석
<ol><li>
소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다.
	<ol>
<li>소프트웨어를 열고 "새 테이블 및 그래프"에서 "열"을 선택 합니다. 다음과 같이 매개 변수를 설정: "데이터를 견본 | 빈 데이터 테이블로 시작"; "그래프의 첫 번째 모드를 선택 하십시오"; "복제 또는 오차 막대 그래프 | 플롯 | SEM으로 의미 ".</li>
		<li>클릭 "만들기"를 각각 "A"와 "B" 라인 제어 및 Vc/PD0325901-대우 그룹의 3 개의 복제를 입력 합니다. 6 데이터를 선택 하 고 "분석"에서 "분석"을 클릭 합니다.</li>
		<li>"열 분석"에서"t (시험과 비패라메트릭 테스트)"를 선택 하 고 "확인"을 입력 하는 다음 인터페이스를 클릭 합니다.</li>
		<li>다음과 같이 매개 변수를 설정: "선택 테스트 | 테스트 이름 | 짝이 없는 t 테스트; 옵션 | 양측 "; "자신감을 간격: 95%"; "유효 자릿수 | 4 유효 자릿수 표시 ". 제어 및 Vc/PD0325901 치료 사이의 p 값을 얻으려면 "확인"을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>컨트롤 및 양측 고 짝이 없는 학생의 t채용 실험 그룹 간의 통계적 의미를 평가-16테스트. 참고: p < 0.05 통계적 의미를 보유 하는 차이 나타냅니다. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo.">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3.">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation.">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li><li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO.">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li><li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals.">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li><li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. 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Ther. 8 (1), 171 (2017).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li><li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos.">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194 (2011).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine:+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites.">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li><li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li><li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells.">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li><li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li><li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency.">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li><li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM14:+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming.">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+in+the+embryo+and+in+culture.">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li></ol>

저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.

작품, 우리 시연 Vc 및 PD0325901 vc DNA demethylation를 홍보 하 고 de novo DNA 억제 시너지 행동에 의해 달성 되었다는 undifferentiated 및 hypomethylated 상태에서 마우스 ES 세포를 유지 하기 위해 결합 하는 새로운 방법 메 틸 PD0325901입니다. 또한, 마우스 ES 세포 Vc/PD0325901 문화 시스템 아래 큰 형태를 보였다.
더 나은 마우스 ES 세포의 상태는 Vc/PD0325901 문화 시스템에서을 하려면 몇 가지...

ES 세포 blastocyst1의 ICM에서 기인 된다. 셀은 pluripotency 상태에 있고 모든 계보 체세포와 생식 세포2형성할 수 있다. ES 세포의 설립 기회 개발 조사를 생체 외에서 처리 하 고 그들의 pluripotency3에 기반 하는 재생 의학에 대 한 의료 관련의 세포를 생성할 수 있습니다 제공 합니다.
두 그룹은 seminally 1981 년에 마우스 ES 세포 라인을 설립 하 고 소 태아 혈 청 (FBS)에 셀 초기 마우스 배아에서 파생 했다 경작 하는 때-급지대 레이어1,4로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)와 매체를 포함 하 . MEFs mitotically 비활성화 했다 고 미리 이전에 ES 세포를 배양 접시에 성장 했다. MEFs는 마우스 ES 셀 첨부 파일에 대 한 지원을 제공 하 고 전파를 홍보 하 여 필수적인 영양 요소와 세포 증식에 대 한 호르몬을 제공 하는 FBS 차별화5억 누르다 성장 인자를 생산. 후속 연구 LIF 피더 세포에 의해 생성 했다 자기 갱신 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수에 대 한 주요 cytokine 매체에 LIF의 추가 피더 세포6에 대 한 대체할 수 있는 표시. 현재, 지류에 FBS/LIF 매체에 마우스 ES 세포의 주 아직도 많은 연구자에 의해 채택 된 표준 방법입니다. 그러나,이 고아 한 문화 접근 몇 가지 문제가 발생합니다. 첫째, 피더 세포 분 비 과잉 통제 요인 및 병원 성 오염7을 발생할 수 있습니다. 혈 청에 포함 된 젤라틴과 요리 표면 및 LIF의 추가 코팅이 간섭을 유발 하지 않도록 매체 급지대 계층 셀 없이 마우스 ES 세포를 유지 하기 위한 대체 방법이 있습니다. 또한, 혈 청/LIF 조건 하에서 성장 하는 마우스 ES 세포 형태학이 세포 인구 및 pluripotency 관련 요인8식 수준 에서도 전시. 최근 연구 제안 조건 하에서 혈 청/LIF, (를 포함 하 여, Nanog, OCT4, SOX2) pluripotency 관련 핵심 전사 인자 LIF 및 WNT 신호; 통해 pluripotency 유지할 수 있습니다. 그러나, 특히, 그들은 또한 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 신호 차별화8트리거를 활성화 합니다. 핵 녹음 방송 요인의 상반 된 이중 작용으로 인해 마우스 ES 세포 혈 청에서 교양된 ICM을 닮은 끝났다 epiblast 상태8다른 유사한 두 개의 상호 인구의 구성 된이 현재. 또한, 마우스 ES 세포 혈 청에 자주 전시 글로벌 hypermethylation9, ICM과 PGCs 그들의 pluripotency9,10와 밀접 하 게 연결 되는 글로벌 hypomethylated 상태에 있는 반면.
마우스 ES 세포 배양을 위한 새로운 방법을 개발 하는 상당한 수요가 있다. 여러 가지 향상 된 프로토콜 200311 이후 설립 되었습니다 하지만 몇 가지 제한 사항 및 단점7계속. 2008 년 이후, 두 개의 작은 분자 kinase 억제제, PD0325901의 결합된 이용 (물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK)의 억제 물 extracellular 신호 통제 / 키 니 아 제 (ERK) (MEK)) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase의 억제제를 키 니 아 제 3 (GSK3)), 자란 마우스 ES 세포12대 한 N2B27 에 매체 LIF와 혈 청 하지 않고 새로운 관점 오픈 했습니다. 이 새로운 정의 된 매체 2 억제제 (2i)의 사용에 의해 특징입니다. 2i/LIF 매체에 경작 마우스 ES 세포는 세포 인구 및 pluripotency 요인의 표현에 더 균질. 또한, 2i/LIF 교양 마우스 ES 세포 전시 DNA hypomethylation 세계적으로 ICM 같은 셀9,13에 가깝다. 그럼에도 불구 하 고, 2i 문화는 그것의 단점이 있습니다. PD0325901 및 CHIR99021는 물에 용 해 일반적으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 해산-문화 매체에 그들을 추가 하려면 재고 솔루션을 기반으로. 연구는 그 장기 그리고 DMSO에 셀의 낮은 복용량 노출 세포 독성14이어질 수 있습니다.
우리 두 작은 분자 화합물을 활용 하는 여기, 마우스 ES 세포의 새로운 문화 방법을 개발 하 고. 새로운 문화 메서드 빠르게 DNA hypomethylation 홍보 Vc와 MEK 억제제 PD0325901를 결합 하 고 효과적으로 PGC의 유사한 수준에 임명 된 Vc/PD0325901 자란 프로토콜. Vc/PD0325901 추가 혈 청에 포함 된 매체에 마우스 ES 세포 형태학에 동질성을 전시 하 고 접지 상태에서 지속. 2i 문화에 비해, Vc/PD0325901 조건 하에서 경작 하는 마우스 ES 세포 DNA demethylation의 빠른 활동을 전시 하 고 PGC의 비교 hypomethylation 수준에 도달할 수 있습니다. 또한, 단일 억제제 (PD0325901)를 사용 하 여 2에서 사용에 비해 중간에 DMSO의 입력된 금액 감소 (PD0325901/CHIR99021) 셀에 피해를 감소 시킨다.

<table><tbody><tr><td>fetal bovine serum Australia source</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>DMEM/high glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>penicillin streptomycin solution</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Component of mouse ES cell medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Cells rinse</td></tr><tr><td>trypsin</td><td>Hyclone</td><td>SH30042</td><td>Cell dissociation</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>Sigma</td><td>48722</td><td>Dishes coating</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>small-molecule chemical for cell culture</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>small-molecule chemical for cell culture</td></tr><tr><td>vitamin C</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&amp;nbsp;</td><td>XW00508171</td><td>small-molecule chemical for cell culture</td></tr><tr><td>Ultra Bioscience water purification systemr</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>Ultra water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Cell freezing medium</td></tr><tr><td>centrifuger</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>DNA and protein extraction</td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Component of RIPA buffer</td></tr><tr><td>PMSF Protease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>Component of RIPA buffer</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Component of RIPA buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Component of RIPA buffer</td></tr><tr><td>Genomic DNA Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>Genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Determination of DNA concentration</td></tr><tr><td>calf intestinal phosphatase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290</td><td>DNA digestion</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303</td><td>DNA digestion</td></tr><tr><td>snake venom phosphodiesterase I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>DNA digestion</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>filtration of digested DNA</td></tr><tr><td>1290 UHPLC system</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>1290</td><td>UHPLC separation</td></tr><tr><td>G6410B triple quadrupole mass spectrometer</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>G6410B</td><td>MS/MS analysis</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18 column</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td><td>colume for UHPLC separation</td></tr><tr><td>5-methylcytosine</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&amp;nbsp;</td><td>standard 5mC</td></tr><tr><td>5-hydroxymethylcytosine (standard)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M295900</td><td>standard 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14 antibody</td><td>bioworld</td><td>BS7634</td><td>Western blot analysis-primary antibody</td></tr><tr><td>Dnmt3a antibody</td><td>bioworld</td><td>BS6587</td><td>Western blot analysis-primary antibody</td></tr><tr><td>Dnmt3b antibody</td><td>abcam</td><td>ab13604</td><td>Western blot analysis-primary antibody</td></tr><tr><td>Dnmt3l antibody</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>Western blot analysis-primary antibody</td></tr><tr><td>Dnmt1 antibody</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>Western blot analysis-primary antibody</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tubulin antibody</td><td>bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>Western blot analysis-primary antibody</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>Western blot analysis-secondary antibody</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG</td><td>abcam</td><td>ab6789</td><td>Western blot analysis-secondary antibody</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>reverse transcription system</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>RNA reverse transcription</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit</td><td>Cells Biolabs, Inc.</td><td>CBA-302</td><td>&amp;nbsp;alkaline phosphatase staining analysis</td></tr><tr><td>mouse ES cells: WT, 129 SvEv</td><td>Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td><td></td><td>cell strain of mouse ES cells</td></tr><tr><td>microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>cells observation</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>statistical analysis</td></tr></tbody></table>

an alternative culture method to maintain genomic hypomethylation of mouse embryonic stem cells using mek inhibitor pd0325901 and vitamin c

배아 줄기 (ES) 세포 (endoderm, mesoderm, 또는 ectoderm), 3 개의 세균 층의 구분을 하 고 재생 의학에 대 한 많은 계보를 생성할 수 있습니다. ES 세포 문화에서 체 외에 는 오랫동안 광범위 한 관심사의 주제. 마우스 ES 세포 혈 청 및 백혈병 금지 요인 (LIF)에서 유지 관리 하는 고전적인,-포함 하는 매체. 그러나, 혈 청/LIF 조건 하에서 세포 형태학 및 pluripotency 관련 유전자의 식 프로 파일에서이 표시 하 고 준 상태에서 주로. 또한, 교양된 ES 세포 전시 글로벌 hypermethylation 하지만 순진한 ES 세포는 안 세포 질량 (ICM) 및 원시 생식 세포 (PGCs)의 글로벌 hypomethylation의 상태에 있습니다. ICM과 PGCs의 hypomethylated 상태 그들의 pluripotency와 밀접 하 게 연결 됩니다. 마우스 ES 세포 문화 방법 개선, 최근 DNA hypomethylated 만능 상태를 유지 하기 위해 두 개의 작은 분자 화합물의 선택적으로 결합 된 사용률을 기반 하는 새로운 방법을 개발 했습니다. 여기, 우리는 비타민 C (Vc)의 공동 치료를 제시 하 고 PD0325901 마우스 ES 세포에서 5 일에 5-methylcytosine (5mC)의 약 90%를 지울 수 있습니다. 생성 된 5mC 콘텐츠는 PGCs에 비교. 기계 조사 보여준다는 PD0325901 최대-조절 억제 Dnmt3b Prdm14 식 (de novo DNA methyltransferase) 및 Dnmt3l (Dnmt3b의 공동 인자), 드 노 보 5mC 합성을 감소 시켜. Vc는 모두 수동 및 활성 DNA demethylations의 참여를 나타내는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) Tet1 및 Tet2에 의해 주로 촉매 변환 용이. 또한, Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포 균질 형태학 및 만능 상태를 표시합니다. 샨 다, 우리 소설과 화학 시너지 문화 DNA hypomethylation 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수를 달성 하기 위한 방법을 제안 합니다. 작은 분자 화학 종속 메서드 혈 청 문화, 그리고 균질 ES 세포 연구에 대 한 추가 임상 응용 프로그램 생성을 보유 약속의 주요 단점을 극복 했다.

Vc/PD0325901 synergistically 마우스 ES 세포의 글로벌 삭제를 유도 한다. 혈 청에 마우스 ES 세포 pluripotent ICM 세포와 PGCs DNA 메 틸 화의 글로벌 삭제 표시 하 고 hypomethylated 상태가 그들의 pluripotency9,10에 밀접 하 게 연관 DNA hypermethylation 전시.
이전에 우리와 다른 Vc Tet 중재 5mC demethylation<sup clas...

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An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

an-alternative-culture-method-to-maintain-genomic-hypomethylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K 조회수.  Chinese Academy of Sciences. 우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

비디오: An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

연구

발생학

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

This protocol provides a method for the collection of mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) derived from serum (fetal bovine serum, FBS)- and feeder (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)-free conditions for a cell-free approach. It may be applicable for the treatment of aging and aging-associated diseases.

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all females are heterozygous for X-linked gene expression. One of the key regulators of XCI is Xist, which is essential for the initiation and maintenance of XCI. Previous studies have identified 13 trans acting X chromosome inactivation factors (XCIFs) using a large-scale, loss-of-function genetic screen. Inhibition of XCIFs, such as ACVR1 and PDPK1, using short-hairpin RNA or small molecule inhibitors, reactivates X chromosome-linked genes in cultured cells. But the feasibility and tolerability of reactivating the inactive X chromosome in vivo remains to be determined. Towards this goal, a Xist&#916;:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp mouse model has been generated with non-random XCI due to deletion of Xist on one X chromosome. Using this model, the extent of inactive X reactivation was quantitated in the mouse brain following treatment with XCIF inhibitors. Recently published results show, for the first time, that pharmacological inhibition of XCIFs reactivates Mecp2 from the inactive X chromosome in cortical neurons of the living mouse brain.

Here, we describe a protocol to generate a viable female murine model with non-random X chromosome inactivation, i.e., the maternally-inherited X chromosome is inactive in 100% of the cells. We also describe a protocol to test feasibility, tolerability, and safety of pharmacological reactivation of the inactive X chromosome in vivo.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

유전학

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

생물학

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...