. 2,007 Greber 외에 발표된대로 Activin에게 엘리사 프로토콜을 설정하기위한 박사 보리스 Greber에 대한 특별 감사합니다. 우리는 그래픽 개요를 준비하기위한 부인 모니카 Shevack들에게 특별히 감사를드립니다. 우리는 촬영 전, 동안의 모든 도움과 귀중한 제안 박사 Heiko Fuchs 매우 감사하고 있습니다. 우리는 MEFs와 CM의 지속적인 공급을 유지하기위한 Adjaye 연구실, 특히 엘리자베스 Socha의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 우리는 또한 그들의 영구 지원 MPIMG의 동물 시설에서 우리의 동료를 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 맥스 플랑크 사회와 추진하는 사업 [BMBF, 보조금 번호 0315717A] ERASysBio의 파트너 + EU FP7의 방어율-NET 플러스 체계 하에서 지원 계​​획.

1. 마우스 배아의 섬유아 세포의 절연 (MEFs) 다음 두 단계는 아닌 무균 조건 하에서 수행됩니다. <ol><li> 경추 탈구하여 13 또는 14 dpc (일 이후 coitum)에서 임신한 쥐 (CF1, 할렌, 미국)를 희생. </li><li> 자궁 뿔을을 해부, 짧게 칼슘 2 + MG이없이는 PBS를 포함 팔콘 튜브에 70% (V / V) 에탄올과 장소에 린스 + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> 다음 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행하고 멸균 악기를 사용하고 있습니다. <ol start="3"><li> 배양 접시에 자궁 뿔을를 삽입하고 태반과 태아의 SAC에서 각 배아를 구분합니다. </li><li> 머리와 붉은 장기를 해부, PBS로 씻고 깨끗한 배양 접시에있는 모든 배아를 넣습니다. 잘게 그것 피펫 것이 가능하게됩니다 때까지 멸균 면도날을 사용하여 조직을 말하다. </li><li> 0.05 %의 1 ML 추가 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Gibco, Invitrogen), inclu배아 당 DNase I (USB)의 딩 100 Kunitz 단위. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브에 조직을 전송 37시 15 분 동안 품어 ° C. 부화의 각 5 분 후, 철저하게하고 아래로 최대 pipetting하여 세포를 떼어 놓다. </li><li> 신선한 MEF 매체의 1 볼륨에 대해 추가하여 트립신을 Inactivate. MEF 문화 매체 (부품, 미디어 500 ML을 모든 구성 요소 및 필터를 섞어) : 450 DMEM의 ML, FBS 50 ML (10 % (V / V)), 200 MM L-글루타민 (1 / 100 (V / V)) 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신의 5 ML (1 / 100 (V / V)). </li><li> 5 분, (300 XG) 저속으로 세포를 원심 분리기, 신중 따뜻한 MEF 매체에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. </li><li> 플레이트 약 2 시간에 대해 0.2 % 젤라틴 (소 피부 타입 B, 시그마에서 젤라틴)로 코팅 각 T150 (TPP) 플라스크에 3-4 배아 것과 같습니다 세포의 수. 섬유아 세포 (P0, 통로 0) 젤라틴 코팅 flasks에 첨부할 수있는 기능을 가지고있는 유일한 세포입니다. </lI&gt; <li> 이상적으로, 세포는 24 시간 후에 80-90% 지류이며,이 단계에서 P0 세포의 주요 부분은 향후 사용을 위해 냉동 있습니다. </li><li> P3 또는 P4까지 P0 세포의 나머지 T150 플라스크 (들)을 확장한 다음 inactivate과 모이통는 hESCs를 replate하거나 에어컨 매체 (CM)을 생산로 사용합니다. </li></ol> 2. 불활 성화 및 도금 MEFs (피더 셀 준비) 모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 이루어졌습니다. <ol><li> 적어도 2 시간을위한 RT에서 0.2 % 젤라틴 및 부화와 코트 T150 flasks합니다. </li><li> mitomycin PBS에서 C (1 밀리그램 / ML)와 필터를 희석. </li><li> MEFs에서 미디어를 대기음 및 CA 2 + MG 2 +없이 PBS로 씻는다. </li><li> 10 μg / MEFs에서 mitomycin C의 ML을 포함하는 매체의 장소 20 ML. </li><li> 37에서 2 시간 동안 품어 ° 매체를 포함하는 mitomycin C와 C 그리고 PBS, trypsinize, 원심 분리기 (300 XG에서 5 분)과 따뜻한 매체 resuspend 세포로 두 번 씻는다. </li><li>56.000 세포 / T150 flasks의 cm 2의 농도에서 세포와 접시를 카운트하고 다음 6 일간 CM 제작을 위해 사용합니다. </li></ol> 3. 에어컨 매체 (CM) 준비 모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 이루어졌습니다. <ol><li> hESC 매체 (어 .. 무조건 중간) (0.5 ML / cm 2)와 MEF 매체를 교체 56.000 세포 / ㎝ 2의 밀도에 inactivated MEFs을 도금 후 일 4 NG / FGF2의 ML과 갓 보충. </li><li> 24 H 보육 후에 피더 flasks에서 CM을 모아서 4 NG / 모이통에 FGF2의 ML을 포함하는 신선한 hESC 매체를 추가하십시오. </li><li> 다음 6 일간이 절차를 반복합니다. 매일 저장소는 -20 ° C.에 CM을 수집 </li><li> 육일는 중간 및 필터 (코닝, 0.22 μm의, PAS)의 모든 aliquots를 섞어 후에. -80에서 50 ML aliquots 및 매장 만들기 ° C. </li><li> Matrigel에서 성장 hESCs에 추가하기 전에 추가 4 NG / FGF2의 ML과 CM을 보완. &lt;/ 리&gt; </ol> 4. 에어컨 미디어를 Activin 측정 (엘리사) 15 <ol><li> 모든 샘플 및 시약 실내 온도로 와요. </li><li> microplate에 추가, 1 % BSA와 PBS에 (인간 \ 마우스 \ 쥐 Activin MAb, R &amp; D 시스템) 항체를 캡처 (100 μl / 음)와 RT에서 밤새 품어 희석. </li><li> 24 시간은 블록 (1 % BSA / PBS 300 μl / 잘) RT에서 1 시간 동안 후 PBST (0.05 % 십대 초반 20과 PBS) (물론 300 μl /)와 우물 세 번 씻어 후. </li><li> 이 시간에는 Activin을 7 dilutions (30 NG / ML보다 농도 이하) 및 빈 샘플을 포함하여 (R &amp; D 시스템) 표준 곡선, 준비합니다. Activin의 선형 작동 범위는 0.25 사이 및 32 NG / ML입니다. </li><li> 우물 (물론 100 μl /)를 표준 및 샘플 중복을 넣고 RT에서 2 시간 동안 알을 품다. </li><li> 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으십시오. </li><li> 보조 (biotinylated) 항체 (인간 / 마우스 / 쥐 Activin MAb, R &amp; D 시스템을 Biotinylated) (0을 추가합니다.25 μg / ML 1% BSA / PBS) 및 RT에서 2 시간 동안 알을 품다. </li><li> 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으, Streptavidin-HRP를 (1 % BSA / PBS, R &amp; D 시스템에 희석) 추가하고 RT에서 20 분 동안 품어. </li><li> 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으, 기판 솔루션을 100 μl (Quantikine, R &amp; D 시스템)을 추가하고 어둠 RT에서 30 분 동안 품어. </li><li> 각도에 스톱 솔루션의 100 μl (Quantikine, R &amp; D 시스템)을 추가하고 가볍게 섞는다. </li><li> 물론 각각의 광학 밀도를 결정하기 위해 540 또는 570 nm의 파장에서 보정과 450 nm의까지 세트 Microplate 리더 (분자 소자 스펙트럼 최대 250 글로벌 의료 계측, 주식, 미네소타),. </li></ol> 5. 대표 결과 분리 절차의 전반적인 체계는 그림 1에 표시됩니다. hESCs 서로 다른 조건에서 배양해 hiPSCs의 전형적인 형태는 그림 2에 표시됩니다. 의 형태<html> MEFs 및 CM을 준비하는 데 사용 inactivated 피더 세포는 그림 3에 표시됩니다. 일반적으로 세포는 24 시간 이후 고립 합류 및 동결하거나 확장할 준비가되어 있어야합니다. 그러나, 가끔 합류 문화를 취득하기 전에 2-3일 걸릴 수 있습니다. CM은 통로 4, 늦어도의 세포에서 준비되어야한다. 일차 전지에만 노화의 발병 전에 4-5 구절에 대한 확장시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다. 시토킨, Activin는 pluripotent 세포 14 undifferentiated 성장 지원을위한 피더 세포에 의해 분비 가장 중요한 요소로 간주됩니다. CM에를 Activin 수준의 측정은 (그림 4) MEFs의 품질을 모니터링하는 매우 편리한 정량 분석이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> 그림 1. MEFs 격리 절차의 개략도 표현. ontent &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> 그림 2. (A) 피더 세포, (B) 시설 매체 및 (C) 정의된 매체의 면전에서 배양해 undifferentiated hESCs의 전형적인 형태. (D, E) 피더 세포의 면전에서 배양해 hiPSCs의 전형적인 형태. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> 그림 3. 마우스 배아의 섬유아 세포의 전형적인 형태 (MEFs). () 항로 0 (P0) 도금 / 절연 이틀 후에, 56.000 세포 / ㎝의 밀도에서 (B) inactivated 피더 계층 2. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> 그림 4. 효소 결합 면역 분석 (엘리사) 기반 시설 매체 (CM) 홍보에를 Activin의 농도의 측정CF1 마우스 변형에서 파생 마우스 배아 섬유아 세포와 epared. CM는 6 일 동안 수집된 후 풀링된되었다. CM &quot;1&quot;과 CM &quot;2&quot;미디어 무조건 미디어 보시죠의 다른 일괄 처리를 참조하십시오. 에어컨 프로세스의 함수가 MEFs, Activin에 의해 매체로 분비를 Activin되면서, 음 거의 탐지가있다.

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Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 제시 MEFs 절연 절차는 hESCs과 hiPSCs을위한 표준화된 문화 조건의 설립을 가능하게합니다. 또한 피더 세포에 의해 시토킨 생산을 평가하는 데 사용 엘리사 기반 시스템은 MEF-파생 에어컨 미디어의 품질에 유용한 지표입니다. 지원 섬유아 세포를 제공하는 마우스 변형 (CF1)의 정기 점검은 문화 미디어의 배치 - 투 - 배치 변화를 방지하는 데 필요합니다. 더욱이, 그것은 동시에 세포의 일관된 품질을 얻기 위해 여러 생쥐에서 배아를 분리하는 것이 좋습니다. 물론 갓 격리 MEFs는 P0과 P1에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 또한 inactivated MEFs는 세포 배양을위한 요구 사항에 따라 적절한 양의 aliquots에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 보통 약 250.000 세포 문화 hESCs 및 IPS 세포에 6 - 잘 접시의 한 우물로 도금한다. 설립 및 최적화 방법은 정기적으로 diffe 간의 다양성을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다실험을 임대.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM (높은 혈당) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 필터 시스템 </td><td> 코닝 </td><td> 431,097 </td><td> 500 ML, 0.22 μm의, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> 마네 DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> 마네를 빼앗아음 교체 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> 베타 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> 로슈 </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> 기본 Fibroblast 성장 팩터 </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin 항체 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> / 인간 / 마우스쥐 Activin MAb </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 얇은 홍채 가위 </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 엑스트라 파인 Graefe의 집게 </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse 고정 집게 </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells

일반적으로 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 1 가변 조건 하에서 배양해 수 있습니다. 그러나 culturing위한 효과적인 시스템이 이러한 세포를 확립하는 것은 쉽지 않다. 문화 조건 hESCs과 hiPSCs의 pluripotency 수여 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 최적화 및 문화 방법의 표준화가 중요합니다. hESC 라인의 설립이 먼저 피더 세포와 태아 소 혈청 (FBS) 함유 배지 2로 MEFs를 사용하여 설명되었다. 다음으로, FBS는 hESCs 3의 증식을 향상 녹아웃 혈청 교체 (KSR)과 FGF2,로 대체되었습니다. 마지막으로, 공급기 - 무료 문화 시스템에 Matrigel 코팅 접시에 culturing 세포를 활성화 KSR-포함된 에어컨 매체 (매체가 MEFs에 의해 조건) 4. 그 후, hESCs 문화 조건은 화학적 defin에 피더 무료 문화쪽으로 이사5-7 에드 조건입니다. 또한, 외부의 무료 구성 요소를 사용 병원균과 동물 단백질 배양 방법에 의한 잠재적인 오염을 피하기 위해 8 설립되었습니다. 향상된 상태를 얻으려면 마우스 피더 세포는 인간 세포 라인 (예 : 태아의 근육과 피부 세포 9, 성인 피부 세포 10, 포피의 섬유아 세포 11-12, amniotic mesenchymal 세포 13)로 대체되었습니다. 그러나 인간의 포피 fibroblast 파생 피더 레이어를 사용하여 undifferentiated hESCs을 유지의 효율성은 14 Activin의 분비의 낮은 수준으로 인해 마우스 피더 세포의 그만큼 높은 아니다. 분명히, 마우스 및 인간 피더 세포에 의한 성장 인자의 생산에 분명 차이가있다. 마우스와 인간 피더 세포 transcriptomes의 분석은지지와 비지지 세포 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 외인성 FGF2는 maintai 데 중요hESCs과 hiPSCs의 자기 갱신을 닝과 Tgfβ1, Activin와 피더 세포의 괴물 (BMP 길항제)의 표현을 규제하는 핵심 요소로 확인되었습니다. Activin은 OCT4, SOX2 및 hESCs 15-16의 NANOG의 표현을 유발을 보여줘왔다. 장기적인 문화의 경우 hESCs 및 hiPSCs들은 undifferentiated 상태를 유지하기 위해 mitotically inactivated MEFs이나 Matrigel - 코팅 접시에 MEF-CM (MEF-에어컨 중간)에서 피더없는 조건 하에서 재배 할 수 있습니다. 그들이 직접 hESCs의 성장에 영향을 미칠 이후 두 문화 조건의 성공은 완전히 피더 세포의 품질에 따라 달라집니다. 여기서는 마우스 배아 섬유아 세포의 격리와 문화 (MEFs)에 대한 최적화된 방법이 갖추어진 매체 (CM)과 미디어 사이를 Activin의 수준을 평가하는 효소 결합 면역 분석 (엘리사)의 준비를 제시.

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Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

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Biology

90.4K 조회수.  Max Planck Institute for Molecular Genetics. 마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

연구

생물학

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

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The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...