탁상형 원심분리는 확장하기 어려운 개방형 수동 프로세스입니다. 당사의 프로토콜은 중간엽 줄기 세포(MSC)의 해리, 세척 및 수확을 한 번의 실행으로 닫고 자동화하는 방법을 보여줍니다. 설정은 간단합니다.
전체 공정은 cGMP 등급 시설의 생물 안전 캐비닛 외부에서 수행 할 수 있습니다. 폐쇄형 자동 셀 처리는 위험에 노출될 수 있는 수동 처리 단계를 줄이고 cGMP 준수를 가능하게 합니다. 이 방법은 다층 배양 시스템에서 확장된 다른 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
역류 원심분리 시스템을 사용하면 다양한 응용 분야에 대한 모든 프로토콜 단계를 수정할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 싱가포르의 스타 인 Bioprocessing Technology Institute의 줄기 세포 바이오 프로세싱 그룹의 직원 과학자 인 Alan Lam 박사가 될 것입니다. 일회용 역류 원심분리 키트 조립을 시작하려면 이미지에 설명된 대로 튜브 용접을 통해 일회용 키트를 일회용 PVC 이송 백과 연결합니다.
그런 다음 생물 안전 캐비닛 내부에서 합류, Wharton's Jelly 유래 인간 중간엽 줄기 세포 또는 Wharton's Jelly HMSC가 포함된 10층 다층 플라스크를 맞춤형 튜브 어셈블리에 부착합니다. 맞춤형 튜빙 어셈블리가 있는 부착된 10층 배양 용기를 벤치로 옮기고 일회용 키트의 라인 E에 용접합니다. 또한. 멸균 샘플 포트를 고유량 일회용 키트의 라인 G에 용접합니다.
다음으로, 수확 라인 H를 50 밀리리터 주사기가 장착 된 멸균 루어에 연결하십시오. 기기 실행을 설정하려면 기기 후면의 토글 스위치를 사용하여 기기를 켜고 제공된 USBC 케이블을 사용하여 노트북을 기기의 USBC 포트에 연결합니다. 바탕 화면이나 시작 메뉴에서 Counterflow Centrifuge 그래픽 사용자 인터페이스 또는 GUI 소프트웨어를 실행하고 로그인합니다.
그런 다음 기본 시작 페이지에서 Select a protocol 버튼을 클릭하여 프로토콜을 로드합니다. 그런 다음 기기의 파란색 잠금 해제 버튼을 누르고 유리 도어를 열어 조립된 일회용 키트를 역류 원심분리 시스템에 로드합니다. 10겹 다층 플라스크를 비스듬히 배치한 상태에서 버블 센서 스트립의 튜브 포트와 가장 잘 정렬되는 순서로 가방을 옷걸이 후크에 걸어 놓는 것으로 시작합니다.
두 개의 키트 위치 버튼으로 키트를 정렬합니다. 연동 펌프 주위의 펌프 튜브를 늘리고 흰색 전구 모양의 커넥터를 제자리에 누릅니다. 역류 원심분리기 챔버 캐리어의 은색 레버를 들어 올려 원심분리기 챔버를 부착하고 레버를 수직 위치로 되돌려 고정합니다.
키트의 각 포트에서 버블 센서 스트립을 따라 트랙으로 튜브를 누릅니다. 도어 걸쇠를 눌러 도어를 닫습니다. GUI에서 시작 버튼을 누르십시오.
체크리스트가 나타납니다. 처음 네 항목은 기기 검사이고 마지막 두 항목은 사용자 검사입니다. 이 시점에서 가방과 연결부가 키트 이미지와 일치하고 수동 클램프가 열려 있는지 확인하십시오.
확인을 눌러 프로토콜 입력 화면을 표시합니다. 데이터 입력 또는 수확량 대화 상자 값을 45밀리리터로 설정하고 확인을 누릅니다. 기기의 녹색 시작 버튼을 눌러 프로토콜 실행을 시작합니다.
초기 프라이밍이 완료되면 사용한 매체가 폐기물 봉투로 완전히 펌핑되었는지 확인하십시오. 워크플로 테이블에 표시된 일시 중지 단계에서 다층 플라스크를 들어 올리고 흔들어 버퍼를 모든 트레이에 균등하게 분배합니다. 완료되면 다음 단계를 위해 10층 다층 플라스크를 원래 그리기 위치에 다시 놓습니다.
단계 20 및 23에서, 트립신 처리된 세포가 중간 백으로 완전히 옮겨졌는지 확인한다. 단계 25에서 중간 백을 수동으로 잘 혼합합니다. 단계 26에서, 2밀리리터 루어 주사기를 사용하여 샘플링 포트를 통해 샘플링한다.
단계 29 및 30에서, 유동화된 세포층의 안정된 형성을 확인한다. 여기에 표시된 유동 세포층과 같아야 합니다. r에서 실행이 완료됩니다.amp 정지 단계, 역류 원심분리 시스템의 모든 핀치 값이 자동으로 닫힙니다.
프로토콜 실행이 완료되면 기기의 파란색 잠금 해제 버튼을 누르고 유리문을 엽니다. 핸드 캐리 튜브 실러를 사용하여 수확 라인을 무균 밀봉하고 농축된 세포 수확물로 채워진 밀봉된 주사기를 세포 계수 및 냉동 보존을 위해 생물학적 안전 캐비닛으로 조심스럽게 옮깁니다. 레버를 사용하여 챔버를 다시 분리합니다.
전구 커넥터를 피팅에서 당겨 빼내고 키트를 조심스럽게 들어 올려 생물학적 위험 백에 폐기합니다. 에탄올 물티슈를 사용하여 기기를 청소하고 문을 닫습니다. 마지막으로, 기기 후면의 스위치를 끄기 전에 먼저 GUI 애플리케이션을 닫습니다.
Wharton's Jelly MSC는 혈청 함유 및 무혈청, 무이종 배지 모두에서 확장되었을 때 잘 증식했습니다. 그러나 무혈청, 무이종 배지의 세포는 혈청 배지의 15미크론에 비해 평균 세포 크기가 17미크론으로 약간 더 긴 섬유아세포와 같은 방추형 형태를 나타냈습니다. 세 통로에 걸친 두 매체 모두에서 Wharton's Jelly HMSC는 평방 센티미터당 약 23, 000 세포의 최대 세포 밀도와 34시간의 인구 배가 시간에 일관되게 도달했습니다.
입증된 역류 원심분리를 사용하여 Wharton's Jelly HMSC를 10층 배양 용기에서 확장했을 때 부피가 10배 감소하여 밀리리터당 530만 개의 세포에 달하는 세포 농도가 생성되었습니다. 이 프로토콜은 3개의 독립적인 실행에 대해 약 98%의 높은 세포 회수율과 약 99%의 높은 세포 생존율을 일관되게 달성했습니다. 두 가지 방법을 사용하여 수확한 Wharton's Jelly HMSC는 CD73, CD90 및 CD105 양성과 CD34 및 CD45 음성인 특징적인 표면 마커 프로파일을 나타냈습니다.
역류 원심분리로부터 수확된 세포는 수동 원심분리에 의해 수확된 세포와 비교하여 유사한 콜로니-형성 단위 섬유아세포 분석 또는 CFU 전위를 나타내었다. 두 방법 모두에서 세포는 지방 세포, 조골 세포 및 연골 세포로 분화하는 능력을 유지했습니다. 역류 후 원심분리 후 세포의 사이토카인 분비 프로파일은 역류 전 원심분리와 비슷하였다.
침대 설정을 참조하여 일회용 키트를 조립하고 이 Counterflow Centrifusion System Protocol Builder에서 교체해야 합니다. 최종 제품에서 잔류 불순물을 세척하기 위한 프로토콜은 사용자가 로트 방출 기준을 충족하도록 지원하기 위해 임상 적용에 사용될 수 있습니다. 대규모 처리를 위한 유체 이송 공정을 가속화하기 위해 외부 펌프를 사용하여 다층 플라스크에서 직접 수확하는 대신 트립신 처리된 내용물을 먼저 이송 백으로 이송할 수 있습니다.
