표준 샘플 준비로 인해 미세 결정의 X선 회절 실험 중에 좋은 신호 대 노이즈를 달성하기가 어렵습니다. 이 프로토콜은 제어 된 방식으로 형성 된 결정의 배경 소스를 줄이는 것을 목표로합니다. 펀치 동결 로봇 과 극저온TEM 그리드의 사용은 마이크로 결정을 반복적으로 조작하여 주변 액체 볼륨을 줄이고 시료의 신속한 유리화를 제공하는 강력한 플랫폼을 제공합니다.
그리드를 처리하는 데 필요한 손재주도 전통적인 크리스탈 수확에 필요한 것과 유사합니다. 또 다른 중요한 요소는 시료 사용량을 줄이는 핵심인 결정화 솔루션을 사용하여 초기 블로팅 파라미터를 결정하는 것입니다. 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 자동 플런지 냉동고를 설정하고 식힙니다.
사용하기 직전에 글로우는 15밀리암페어 전류와 0.39 밀리바 압력으로 25초 동안 극저온TEM 그리드를 배출한 다음, 광선 배출 그리드를 덮인 페트리 접시에 보관합니다. 샘플 챔버의 상대 습도를 90%로 설정하고 블로팅 시간을 5초로 설정합니다. 플롯팅이 완료된 후 플런지 냉동고가 자동으로 샘플을 급락하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
결정화의 씰을 잘 열고 저수지를 엽니다. 낙하의 부피를 유지하기 위해 수정 강하에 2~5마이크로리터의 마이크로리터를 빠르게 첨가합니다. 나중에 사용하기 위해 저수지 용액의 10 마이크로리터를 0.5 밀리리터 튜브로 옮기고 결정화 가루가 건조되는 것을 방지하기 위해 우물을 재밀봉한다.
플런지 얼어붙은 집게를 사용하여 단일 글로우 방전 그리드를 선택하고 탄소 면이 블로팅 암에서 멀리 향하도록 계측기의 그리드를 로드합니다. 탄소 측이 블로팅 암에 직면하도록 그리드를 들고 있는 집게를 회전시다. 2.5 마이크로리터 파이펫을 사용하여 냉동TEM 그리드의 비지원 측에 두 개의 저수지 용액을 적용합니다.
블로팅 암에서 멀리 향하는 탄소 면으로 그리드를 회전시키고 저장소 액체를 그리드의 탄소 필름 지지측에 조심스럽게 적용합니다. 블로팅 공정을 시작하고 그리드 의 표면을 가로 질러 터지는 파도가 보일 때까지 탄소 표면에서 가져온 액체를 관찰하십시오. 터지는 파도가 보이지 않으면 블로팅 암이 그리드에서 후퇴하기 전에 블로팅 시간을 1~2초 까지 늘립니다.
결정화 플레이트를 광 현미경 아래에 놓고 대상을 시야 내에 잘 배치합니다. 플런지 냉동실에 신선한 광선 배출 그리드를 놓고 저수지 액체를 이전에 설명한 대로 그리드의 비지지측에 적용합니다. 플런지 냉동고의 샘플 포트를 향한 탄소 필름 지지측으로 그리드를 회전합니다.
결정화 플레이트에서 임시 씰을 껍질을 벗기고 두 개의 마이크로리터에 설정된 파이펫을 사용하여 결정화 방울을 반복적으로 흡입합니다. 흡량제 마이크로크리스탈 슬러리의 2개의 마이크로리터를 플런지 냉동고로 옮기고 모든 샘플을 극저온TEM 그리드의 탄소 측에 적용한다. 블로팅을 시작하고 터지는 물결을 관찰한 다음 즉시 급락 동결을 시작합니다.
액체 에탄에서 액체 질소에 침지된 그리드 박스로 그리드를 신속하게 전송합니다. 그리드를 얼린 후 플런지 냉동고를 재설정하여 액체 에탄에서 급락한 그리드를 철회합니다. 플런지 냉동고에서 그리드를 들고 있는 집게를 제거하고 그리드를 가벼운 현미경 아래에 놓습니다.
미세 한 초점을 조정 하 고 그리드에 걸쳐 결정의 밀도 평가. SEM에서 극저온TEM 그리드를 로드한 후 샘플을 정렬하고 전자 빔을 켭니다. 처음에는 45X 배율로 전체 그리드를 평가하고 이미지를 기록한 다음 개별 결정이 명확하게 관찰될 때까지 개별 그리드 사각형을 자세히 검사하기 위해 배율을 높입니다.
그리드 주위를 이동하고 스틸 이미지를 캡처하여 그리드가 평평하고 탄소 지원 필름이 대체로 손상되지 않도록 합니다. 크리스탈을 둘러싼 유리화 액체의 좁은 후광이 있는 수많은 단일 결정이 있는지 확인하고 구멍은 탄소 지지 필름에 표시됩니다. 그리드의 이미지를 관찰하고 캡처하는 동안 유리화 된 액체의 큰 영역이 없거나 육각형 얼음이나 표면 얼음이 그리드 에 흩어져 있지 않으며 결정이 겹치지 않고 지지 필름전체에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
큰 발포 드워에서 샘플 카트리지에 적재된 필요한 수의 VMXm 샘플 홀더를 식힙니다. 샘플 로더의 샘플 위치 위에 액체 질소를 추가합니다. 마이크로크리스탈로딩 그리드가 포함된 그리드 박스를 샘플 로더의 그리드 박스 오목으로 신속하게 옮기고 뚜껑을 약간 풀고 뚜껑을 느슨하게 하고 회전할 수 있도록 뚜껑을 열짝 풀수 있습니다.
그리드 상자에서 그리드를 들어 올리고 그리드를 회전하여 그리드를 샘플 홀더에 평평하게 놓습니다. 미리 냉각된 순환 도구를 그리드 개구부그리드 위에 신속하게 배치하고 버튼을 눌러 서클립을 설치합니다. 액체 질소를 샘플 홀더 위에 약 1.5센티미터 추가합니다.
VMXm 샘플 집게를 사용하여 로드된 샘플 홀더를 조심스럽게 들어 올려 샘플 카트리지에 다시 넣습니다. 카트리지의 뚜껑을 교체하여 카트리지 상단의 핀이 뚜껑의 구멍과 결합되도록 합니다. 냉동TEM 그리드에 준비된 미세 결정의 스캐닝 전자 현미경 사진은 최소한의 배경 분산을 보였다.
그리드는 여분의 액체로부터 자유로웠으며 크리스탈을 둘러싼 좁은 액체 후광이 관찰되었다. 다발성 결정은 덩어리뿐만 아니라 개별적으로 관찰되었다. 약간 더 큰 인슐린 결정은 또한 고립 된 결정과 함께 일부 응집을 보였다.
매우 큰 미세 결정도 냉동TEM 그리드에 성공적으로 장착되었습니다. 탄소 지지 필름의 구멍이 선명하 게 표시되어 강한 블로팅을 나타냅니다. 많은 샘플은 미세 결정의 블로팅 시간과 농도의 변화로 인해 추가 최적화가 필요했습니다.
결정으로 과부하된 그리드는 블로팅 효율을 줄이고 여러 격자를 단일 회절 이미지에 기록했습니다. 점성이 높은 결정화 솔루션의 짧은 블로팅 시간은 지나치게 젖은 시료를 초래할 수 있습니다. 점도 결정화 용액이 낮을 경우 짧은 블로팅 시간이 되면 그리드의 한쪽에서 미세 결정을 훔치는 결과를 초래합니다.
최적의 시료 준비를 통해 VMXm의 모든 기능을 활용하여 높은 신호 대 잡음 비율로 가능한 최고 해상도의 고품질 X-ray 회절 데이터를 수집할 수 있습니다. 결정화 솔루션의 초기 블로팅을 결정하는 것은 최소한의 샘플을 사용하는 데 핵심적인 것입니다. 샘플이 매우 제한된 경우 밀도 평가를 건너뜁니다.
궁극적으로 희석된 시료를 갖는 것이 좋습니다. 이 견본은 이제 마이크로 ED의 앞에 VMXm Beamline, 마이크로 결정 전자 회절, 또는 집중된 이온 빔 밀링에서 엑스레이 회절 실험을 위한 준비가 되었습니다.
