저자는 그들의 지원과 방향에 대한 스크립스 연구소의 박사 Sheng 딩과 북경 대학의 박사 Hongkui Deng 감사하고 싶습니다.

1. MEF 피더 플레이트의 준비 <ol><li> culturing의 ES 세포 전에 하루의 해동 한 병을 조사 E14.5 CF - 1 MEF의 피더 세포 (ES 세포를 해동하는 방법에 대한 절차를 참조). </li><li> 10000 세포의 밀도에 플레이트 MEF 피더 셀 / 물론 12 잘 플레이트 인치 37 ° C와 5% CO 2 밤새 세포를 품어. MEF 세포 미디어 : DMEM 10 % ES - PBS, 1X 및 1X 글루타민이 아닌 필수 아미노산과 보충. </li></ol> 2. 마우스 ES 세포 자기 갱신의 유지 관리 <ol><li> 트립신을 사용하여 ES 세포를 분리합니다. / 잘 성장 미디어에 이전에 준비 MEF 피더 플레이트 (마네의 멤은 15 % KSR, 4 MM의 L - 글루타민, 0.1 MM 아닌 필수 아미노산과 1X BME와 보충)에 50,000의 세포 밀도에 씨앗 세포가 SC1과 보충 원하는 농도에서 (우리는 100 nm의, 300 NM, 1 μm의 사용). 우리는 또한 1,000 μ / 평범한의 ML과 보충했습니다 잘 긍정적인 컨트롤을 추가했습니다. 37 ° C와 5% CO 2 밤새 세포를 품어. </li><li> 문화 37 세포 ° C와 5% 각 구절에서 3~4일에 대한 CO 2. 새로고침 미디어마다 48시간. </li><li> 패시지 세포 초기 시딩 밀도로 유사한 밀도를 유지하는 트립신과 1시 10분에서 1시 15분까지. 5 구절 후, 세포가 immunocytochemistry를 사용하는 전형적인 pluripotency 마커의 표현에 대한 검사 수 있습니다. </li></ol> 3. Pluripotency 마커 Immunocytochemical 시험 <ol><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 20 분 정착액 500 μl와 세포를 수정. </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 상온에 한 시간 동안 500 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다. </li><li> 특정 차 항체 250 μl (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 그리고 우리가 다음 dilutions에서 Nanog, Sox2, SSEA1, 그리고 Oct4를 사용)으로 세포를 품어 </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> (우리가 1 1:2000과 동키의 알렉사 플루어 ® 488과 안티 - 토끼 복합에서 알렉사 플루어와 안티 - 마우스 복합 ® 555 당나귀를 사용하여 빛으로부터 멀리 보관, 상온에서 두 시간 동안 이차 항체 250 μl와 세포를 품어 : 2000). </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 마지막으로 씻어 DAPI를 (최종 농도가 1 μg / ML) 추가하고 핵을 시각화하기 위해 5 분 알을 품다. </li><li> 형광 현미경으로 세포를 분석합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 1. 형태 결과 : 마우스 ES 세포 (ESC R1)가 undifferentiated 상태에서 자기 갱신을 유지하기 위해 난생 또는 SC1 중의 면전에서 MEF 피더 세포에서 성장했다. 두 번째 통로 후, 차별화는 평범한 또는 SC1 (대조군)하지 않고 세포에서 관찰 될 수있는 5 구절 후 본질적으로 아무런 undifferentiated 식민지는 관찰되지 않았습니다. 난생 (긍정적인 제어) 처리 식민지는 5 세포 통로를 통해 undifferentiated 상태에 있었다. 300 NM 또는 100 nm의의 농도에서 SC1로 치료 세포도 다섯 구절 후 undifferentiated 남아 그러나, 세포는 네 번째 통로 후 1 μm의 SC1 경험이 세포 죽음으로 취급. (애플 리케이션 노트 그림 2) 표 1은 형태학의 관찰을 요약한 것입니다. 2. Pluripotency 마커 표현 5 구절에 대한 유지 마우스 ES 세포는 SSEA1, Oct4, Nanog와 Sox2에 대한 고정 및 immunocytochemistry에 의해 조사되었다. 마커 표현이 평범한 유지 세포와 유사했다. (애플 리케이션 노트의 그림 3과 4) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 난생 또는 SC1 유지 세포의 형태론 비교. 형태에 차이는 관찰되지 않았습니다. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="그림 2 및 3" /> 그림 2와 그림 3 : Nanog, SSEA1, Sox2, 그리고 SC1 또는 평범한 (애플 리케이션 노트의 그림 4) 유지 ES 세포의 Oct4 염색법. SC1 유지 전지는 평범한 유지 세포와 유사한 pluripotency 표시자 표현을 보여줍니다. 표 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> 대조군 </td><td> 평범한 긍정적인 제어 </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 NM </td><td> SC1 100 NM </td></tr><tr><td> 첫째 패시지 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 둘째 패시지 </td><td> 어떤 차별 형태 </td><td> 일반 ES 셀 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 셋째 패시지 </td><td> 차별화된 세포의 대부분 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 넷째 패시지 </td><td> 아무 ESC 식민지 없음 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 세포 죽음은 관찰 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 다섯째 패시지 </td><td> 차별 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 세포 죽음은 관찰 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 Stemgent 고용하고 있습니다.

작은 분자 SC1은 마우스 ES 세포에서 undifferentiated 상태와 자기 갱신을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 안된 세포 라인에 사용하기 전에, 그러나, 그것은 최적의 농도를 결정하기 위해 titrated해야합니다. 예를 들어, 마우스 ES 세포 라인 ESC R1 세 농도를​​ 테스트. 100 nm의 300 나노미터 농도가 마우스 ES 세포를 유지 수 있었던 것은, 그러나, 1 μm의 농도가 독성이되었다. SC1 또한 피더 무료 조건에서 사용할 수 있습니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

마우스 배아 줄기 (ES) 세포는 통상 자기 갱신을 유지하기 위해 백혈병 억제 팩터 (난생)와 양식입니다.<sup&gt; 1</sup&gt; 그러나, 난생는 고가이며 LIF/JAK/STAT3 경로의 활성화가 절대적으로 자동 갱신 상태를 유지하기 위해 필요하지 않습니다.<sup&gt; 2</sup&gt; SC1 작은 분자는 평범한하는 경제적인 대안이있을 수 있습니다. SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다.<sup&gt; 3</sup행동의 메커니즘&gt; 그림은 자기 갱신의 근본적인 분자 메커니즘을 연구하기위한 유용한 도구합니다. 여기 SC1의 존재에 culturing 마우스 ES 세포에 대한 절차를 설명하고 그들이 난생의 부재에서 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여줍니다. SC1과 교양 세포는 평범한와 유지 세포에 비해 유사한 형태를 보였다. 모두 다섯 구절 후 일반적인 마우스의 형태를 ES 전시. 전형적인 pluripotency 마커의 표현은 (Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 SSEA1) SC1의 존재에서 다섯 구절 후 관찰되었다. 또한, SC1은 마우스 ES 세포에 대해서는 명백한 독성을 발생하지 않습니다.

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The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다. 우리는 난생의 부재에서 마우스 ES 세포 자기 갱신을 지원 SC1의 기능을 테스트하고 SC1은 마우스 ES 세포 배양의 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여주었다.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

the-use-sc1-pluripotin-to-support-mesc-self-renewal-absence

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

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