CACW는 의학 연구 협의회 (Medical Research Council) PhD 학생이 지원합니다. GMF는 부분적으로 Medical Research Council의 New Investigator Award (MR / N000609 / 1)와 Tenovus Scotland 연구 보조금으로 지원됩니다.

1. 작은 분자 키니 아제 억제 물 도서관의 분류 <ol><li> 228 개의 강력하고 선택적 인 키나아제 억제제 (http://lincs.hms.harvard.edu)의 표본 모음 인 하버드 의과 대학의 Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) 라이브러리와 같은 대중적으로 접근 가능한 키나제 억제제 수집 물의 억제제 라이브러리를 대조하십시오. , 및 단백질 키나아제 억제 물 세트 (PKIS), 산업 연구원 (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS)에 의해 조립 된 376 화합물 수집 13 . 또는 상업적으로 이용 가능한 화합물로부터 주문품 키니 아제 억제제 수집 물을 조립하십시오. 참고 : 우리 실험실에서는 51 개의 1 차 표적 키나아제를 대상으로하는 72 개의 강력하고 선택적인 툴 키나제 억제제를 수집했으며, 모두 상업적 출처에서 입수 할 수 있습니다. </li><li> 여러 농도에서 최적의 높은 처리량 처리를 위해 96- 웰 플레이트에 키나제 억제제를 조립하십시오 (1, 0.1 a0.01 mM). DMSO만을 함유하는 각 플레이트 대조구 및 대조군 인 PD173074 (FGFRi) 및 Ruxolitinib (JAKi)를 포함하며, 이들은 각각 순 진성 및 뇌하수체 성의 다 능성 상태를 촉진시키는 것으로 공지되어있다. 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어에 주석을 답니다. </li></ol> 2. 스크린 준비를위한 mESC 문화 조건 및 절차 <ol><li> 10cm 플레이트에 0.1 % (w / v) 젤라틴 5 ML을 추가하여 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 요리를 준비하고 5 분 실온에서 부화. 흡 인물 젤라틴을 2 분 동안 건조시킨다. </li><li> 100 ng / mL GST-LIF, 10 % 태아 송아지 혈청 및 5 % 녹아웃 혈청을 함유하는 표준 mESC 배지 ( 재료 표 참조)에서 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 37 ° C 5 % CO 2 에서 모든 표준 mESC 라인을 배양하십시오. 바꿔 놓음. 1 일 5 ~ 1시 10 분 희석으로 매일 매 80 % confluency에서 매초 및 통로 mESC를 교체하십시오. </li><li> 통과 mESCs, 미디어를 대기음과 5 ML으로 씻어f 인산 완충 식염수 (PBS)를 함유한다. </li><li> mESC의 플레이트 당 1 ML 트립신 - EDTA (0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA)를 추가하고 37에서 품어 ° C 10 분. </li><li> 5 분 1,200 rpm으로 mESC 미디어와 원심 분리기 4 ML의 Resuspend의 trypsinized 세포. </li><li> 철저히 하나의 세포 현탁액을 생성하는 위아래로 pipetting mESC 미디어 5 ML에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 10 μL 세포 현탁액과 10 μL의 Trypan Blue (0.4 %)를 결합하여 세포를 계수하십시오. 세포 계수 챔버에 넣거나 hemocytometer와 가벼운 현미경을 사용하십시오. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 0.1 % 젤라틴 코팅 96 웰 플레이트, 최종 볼륨 100 μL에 3 X 10 3 mESC를 시드하십시오. </li><li> 다중 채널 피펫을 사용하여 1 : 100 희석액 (1 μL 억제제를 100 μL 배지에 첨가)에 키나제 억제제를 적용하십시오. 부드럽게 혼합 방지제와 세포 현탁액에 미디어를 피펫, 그럼 세포가 균등 분배 acro 보장하기 위해 1 시간 동안 조직 문화 후드에 정착 수 있습니다도금 표면. 매체를 바꾸지 않고 48 시간 동안 배양 세포. 참고 : 1 / 0.1 / 0.01 mM의 스톡 플레이트는 각각 최종 저해제 농도가 10 / 1 / 0.1 μM이됩니다. off-target 효과를 최소화하면서 1 차 타겟 키나아제의 효과적인 억제를 보장하기 위해 1 μM의 최종 농도에서 스크린을 시작하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 키나아제 억제제 스크리닝 분석 <ol><li> 멀티 채널 흡인기 및 피펫을 사용하여 200 μL PBS로 96 well mESC 플레이트를 세척하십시오. </li><li> 용해 버퍼 (20 MM 트리스 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA, 1 % NP - 40 (V / V), 0.5 % 나트륨 deoxycholate (W / V), 10 MM β - glycerophosphate , 10 mM 피로 인산 나트륨, 1 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 완전한 프로테아제 저해제 칵테일 정제). </li><li> V-bottomed 96- 웰 플레이트에서 30 분 동안 1,500 xg에서 원심 분리하여 추출물을 명확히하십시오. </li><li> 100㎕의 상청액을 nitrocel에 고정시킨다.96- 웰 진공 도트 블롯 매니 폴드 (blank dot manifot)를 사용하여 1 ㎛ 막에 코팅 하였다. </li><li> 멤브레인을 건조시키고 Ponceau S 40 mL로 얼룩을지게하여 일관된 이동을 보장합니다. </li><li> 멤브레인을 TBST로 씻고 TBST / 3 % (w / v) 우유로 차단하십시오. </li><li> TBST / 3 % (w / v) 분유에서 1 : 1,000 (v / v) 희석하여 Nanog 및 Dnmt3b 항체를 밤새 품는다. </li><li> TBST에서 3x10 분 동안 세포막을 씻고 1 : 10,000 (v / v)의 TBST / 3 % (w / v) 묽게 희석 한 2 차 항체 30 mL에서 배양하십시오. </li><li> 디지털 면역 블 롯팅 이미징 시스템을 사용하여 개발하십시오. 참고 : 가능하면 Nanog 및 Dnmt3b를 검출하기 위해 정량 형광 면역 블로 팅을 사용하십시오. 그러나, 형광 immunoblotting에 의해 Dnmt3b에 대한 배경 신호가 너무 높습니다. 따라서, 800 nm 형광 항 - 토끼 (Nanog) 및 항 마우스 -HRP (Dnmt3b) 2 차 항체가 사용된다. </li></ol> 4. 선천성 만능 혈압 조절제로서 스크리닝 데이터 및 억제제의 검증 <ol><li> Immobotting 분석 소프트웨어를 사용하여 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 정량화하고 값을 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어로 가져옵니다. DMSO 대조군과 비교하여 모든 시료에 대해 Nanog : Dnmt3b 비율을 계산하십시오. 또한, 키나아제 저해제가 mESC 생존력을 변경하여 Nanog : Dnmt3b 비율에 영향을 미치지 않도록 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 결정하십시오. </li><li> Nanog : Dnmt3b 비율을 사용하여 순전 한 다 분화능 (Nanog : 대조군보다 높은 Dnmt3b 비율)과 primed pluripotency (Nanog : 대조군보다 낮은 Dnmt3b 비율)를 촉진하는 억제제를 확인하십시오. 제어 값으로부터 2 배 편차로 컷오프를 설정하고 전체 Nanog + Dnmt3b 신호를 생성하는 키나아제 억제제를 걸러냅니다(높은 Nanog : Dnmt3b 비율) 및 프라이밍 된 (낮은 Nanog : Dnmt3b 비율) 다 능성 상태를 안정화시키는 키나아제 저해제의 높은 신뢰도 목록을 생성하는 DMSO 대조군 값의 50 %. </li><li> 2 mL 배지에서 6 well 당 2 x 10 5 세포에 mESC를 접종하여 키나아제 억제제를 검증하고 배지 교환없이 48 시간 동안 1 μM에서 키나제 억제제를 첨가하십시오. </li><li> 용해 완충액에서 mESCs를 녹여 기존의 SDS-PAGE 면역 블로 팅으로 Nanog 및 Dnmt3b 발현을 분석합니다. </li><li> 또한 naive pluripotency marker 인 Klf2와 Klf4, Oct4에 대한 SDS-PAGE immunoblotting으로 히트를 검증하여 48 시간 동안 억제제를 투여 한 후에 다 분화능이 유지되도록 하였다. </li></ol>

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	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

저자는이 연구에서 발생하는 관심의 충돌을 선언하지 않습니다.

여기서 우리는 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는데 키나아제 신호 전달 경로의 역할을 조사하기 위해 널리 접근 가능한 방법을 제시한다. 이것은 ESC 분야의 중요한 질문을 다룹니다. 고 처리량 유전체학 및 전 사체 접근법이 순진 및 초벌칠 다 능성 상태의 주요 전사 조절자를 식별하기 위해 일상적으로 사용 되긴하지만, 다 능성 신호 전달 네트워크를 밝히는 것은 어려운 것으로 입증되었다. 우리는 이제 mESCs에서 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는 키나아제를 확인하기 위해 화학 억제제를 사용하는 유연한 전략을 제공합니다. 이것은 세포 신호 및 ESC 생물학을 연구하는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 간단한 장비, 시약 및 재료에 의존합니다. 이 플랫폼의 성공에 결정적으로 중요한 것은 naive 및 primed pluripotent states 사이의 전이를 정량화하기위한 견고한 분석법 개발입니다. 이 분석법을 확립하기 위해서는 세포 평판에 대한 상당한 반복적 인 변형이 필요했습니다주입 밀도, 억제제 배양 시간 및 면역 블로 팅 조건. 소분자 접근법은 치료 용 ESC 응용에서 합리적인 사용을위한 견인력을 얻고있다 15 , 16 . 소분자 스크리닝의 주요 장점은 효율적인 세포 흡수를 위해 도구 화합물이 설계 및 / 또는 변형된다는 것입니다. 형질 전환 효율은 제한적이지 않으며 렌티 바이러스와 같은 위험한 전달 시스템의 사용은 필요하지 않습니다. 또한, 저해제는 키나제 계열 ( 예 : Fgfr1-4, Jak1-3) 내에서 여러 isoform을 자주 억제하며 RNAi 및 CRISPR / Cas9와 같은 유전 / 게놈 간섭 기술을 방해하는 기능적 중복을 극복합니다. 보다 강력하고 선택적인 툴 화합물이 학술 및 의약품 발견 프로그램에서 모두 이용 가능 해짐에 따라, 잘 이해되지 못하고 잘 이해되지 않은 키나아제가 ESC 연구의 최전선에 밀려날 것입니다. 그러므로 우리는이 높은Roughput Screening 접근법은 핵심 ESC 규제 네트워크에 대한 새로운 연구 방법을 열어 줄 것입니다. 이 기술의 한 가지 사소한 한계는 가장 강력하고 선택적인 소분자 억제제조차도 생체 내 다수의 무관 한 키나아제 에 관여하고 억제한다는 것입니다. 그러나 점점 더 포괄적 인 키나아제 억제제 프로파일 링 데이터를 통해 키나아제 억제제의 기능 표적을 쉽게 확인할 수 있습니다 (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase - 억제제). 마지막으로 원칙적으로 우리 플랫폼은 고품질의 면역 블로 팅 항체를 사용할 수있는 소분자 채취 및 / 또는 세포 분석을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다. 이것은 pluripotency 규제에서 여러 규제 시스템의 연구를 허용하고 다양한 세포 프로세스를 수정 소분자 억제제의 식별을 용이하게합니다. 구체적으로, 우리는 에픽젠 (epigene)Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics)에 의해 개발 된 tic 프로브는 다 능성 전이의 새로운 조절 인자를 밝힐 잠재력을 가지고있다.

배아 줄기 세포 (ESC)는 다 기능성 1 ( pluripotency 1)으로 알려진 성체의 모든 세포 유형으로자가 갱신하거나 분화 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 최근의 증거는 &quot;순진&quot;과 &quot;감작&quot;다 분화능 (pluripotency) 2 라고 불리는 발달 적으로 구별되는 다 능성 (pluripotent) 상태가 있음을 나타낸다. Naive ESC는 이식 전 배아 3 에서 발견 된 것과 유사한 발달 상태를 나타낸다. 반대로, 뇌관을 앓고있는 다 능성 ESC는 다 분화능을 없애고 전문화 된 배아 계통으로 분화한다. 나이브 및 뇌하수체 다 분원성 상태는 별개의 유전자 조절 네트워크로 표시됩니다. naive pluripotency는 Nanog, Krueppel-like transcription factors (Klfs), Rex1 2 및 Esrrb와 같은 주요 다 능성 전사 인자의 발현을 특징으로한다 <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 6. 마우스 ESCs (mESCs)에서 primed pluripotency는 naive 마커의 발현 감소와 de novo DNA methyltransferase Dnmt3b를 포함한 특정 유전자 발현 시그니처를 특징으로한다. 생체 내 에서 뇌하수체 전립선 상피 줄기 세포 (epiSCs) 4 , 5 는 Epiblast 마커 Fgf5와 Brachyury 8 과 같은 계통 뇌관 류의 마커를 추가로 발현합니다. mESC는 in vitro에서 naive-primed pluripotent 전이를 조절하는 메커니즘을 탐색 할 수있는 다루기 쉬운 모델을 제공합니다. 백혈병 억제 인자 (LIF)와 태아 소 혈청 (FBS)에서 배양 될 때, mESCs는 naive 및 primed pluripotent states 9,10 사이에서 동적 전이를 겪는다. 순진한 유전자 조절 네트워크를 촉진시키는 LIF-Jak-Stat3 신호 전달 기능 11 </섬유 아세포 성장 인자 4 (Fgf4) Erk1 / 2 경로를 통한자가 분비 신호는 감작 된 상태로의 전환을 유도한다. 그러나, 독특한 pluripotent 상태를 지정하는 단백질 키나아제의 역할을 체계적으로 평가하는 것은 여전히 ​​어려움이 남아 있습니다. 여기에서 우리는 naive primed pluripotent transition의 키나아제 조절제를 목표로하는 작은 분자 스크리닝을 수행 할 수있는 정량 및 확장 가능한 플랫폼을 설명합니다. 우리는 단순한 mESC 배양 조건과 표준 시약, 재료 및 장비를 사용하여 키위 나제 억제제를 밝히고 유효성을 검증하며 지금까지는 미숙 한 다 분화능을 안정화시키는 능력을 인정받지 못했습니다. 또한, 우리는 epigenetic 레귤레이터를 목표로 신흥 억제제 도서관 등 다른 작은 분자 컬렉션의 심사를 포함하여,이 기술에 대한 잠재적 인 확장 응용 프로그램을 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;mESC media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td><td>MRC-PPU reagents and services</td><td></td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Final: 10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TC materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo</td><td>25300054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powder</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western Blotting&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &amp;micor;M&amp;nbsp; Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratory Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

배아 줄기 세포 (ESC)는자가 증식하거나 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있습니다. 이는 다 분화능 (pluripotency)으로 알려진 현상입니다. 독특한 &quot;다발성&quot;상태가 &quot;순진&quot;과 &quot;뇌하수체&quot;다 분화능으로 묘사되었습니다. 순순한 뇌쇄 전환을 제어하는 ​​메커니즘은 제대로 이해되지 않았습니다. 특히, 우리는 키나아제 기능을 탐색하기위한 고품질의 도구 화합물의 이용 가능성이 증가 함에도 불구하고 순진하고 뇌척수가있는 다 능성 상태를 명시하는 단백질 키나아제에 대해서는 잘 알려지지 않고있다. 여기, 우리는 마우스 ESCs에 naive primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 확장 가능한 플랫폼을 설명합니다. 이 접근법은 단순 세포 배양 조건 및 표준 시약, 재료 및 장비를 사용하여 다 능성에 대한 지금까지 인식되지 않은 영향으로 키나아제 저해제를 밝혀 내고 유효성을 확인합니다. 우리는이 기술에 대한 잠재적 인 응용을 토론합니다. 여기에는 다른 작은 분자의 스크리닝점점 정교한 키나아제 억제제 및 후성 유전체 툴 화합물의 출현 라이브러리와 같은 컬렉션.

여기에 제시된 절차 ( 그림 1 )를 사용하여, 우리는 mESC pluripotency를 조절하는 것들을 확인하기 위해 228 개의 강력하고 선택적 인 kinase 억제제의 LINCS 라이브러리를 스크리닝한다. 라이브러리는 mESC에서 1 : 100 희석 및 최종 스크리닝 농도에 대해 0.1mM의 농도로 제조된다. 48 시간 후, mESCs를 용해시키고, Nanog 및 Dnmt3b 발현의 정량적 도트 블롯 분석을 위해 추출물을 준비 하였다 ( 도 2 , 상단). 다른 스크리닝 농도의 결과는 간결함을 위해 여기에 표시되지 않습니다. Nanog : 각 키나아제 억제제 및 화합물에 대해 Dnmt3b 비율을 결정하고 2x 차단을 적용했습니다 ( 그림 2 , 하단). 대조군과 비교하여 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호는 억제제 등급에 중첩되어 있으며 중요한 MESC 독성을 나타내는 억제제의 트리 이미 징을 허용하기 위해 0.5x 차단을받습니다. 순진균을 안정화시키는 키나제 억제제를 선택하십시오te는 기존의 Nanog / Dnmt3b 면역 블로 팅을 사용하여 검증됩니다 ( 그림 3 ). 이들 억제제의 일차 키나아제 표적은 표 1 에 제시되어있다. 우리는 또한 감작 된 상태를 안정화시키는 억제제를 확인하기위한이 스크린의 적용 가능성을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> 그림 1 : naive primed transition을 조절하는 kinase inhibitor 스크리닝 워크 플로우. mESC를 1 μM의 최종 농도로 228 화합물 키나아제 억제제 라이브러리로 처리 하였다. 용 해물을 준비하고 immuno dot-blot 분석을 위해 nitrocellulose membrane으로 옮겼으며 Nanog와 Dnmt3b 수준이 결정되었다 (그림은 Williams et al . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">알을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a><html> 이 그림의 arger 버전. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> 그림 2 : Naive primed pluripotency 스크린 분석 및 억제제 확인. (Top) 대표적인 Nanog 및 Dnmt3b 면역 도트 블롯 이미지. (아래) 각 키나제 억제제에 대한 Nanog 및 Dnmt3b 값을 DMSO 대조군에 대해 측정하고, Nanog : Dnmt3b 비 및 총 상대 Nanog + Dnmt3b 신호를 측정하고 억제제를 DMSO 대조군과 비교하여 평가 하였다. Nanog : Dnmt3b 비율을 DMSO 컨트롤 위 또는 아래의 2 배 임계 값 이상으로 변경시키는 것으로 밝혀진 억제제는 순진 또는 뇌졸중 만능 분화 촉진제로 확인되었습니다. DMSO 대조군보다 2 배 낮은 역치는 mESC 생존율을 저해하는 선별 억제제로 설정되었다. 추가 검증을 위해 선택된 억제제가 강조 표시됩니다. (그림은 Williams et al., 14 ).s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> 그림 3 : 선택된 히트 화합물의 확인. mESCs는 1 μM AZD4547 (선택적 FGFR 억제제) 또는 그림 2의 화면에서 확인 된 표시된 억제제로 치료했다. Nanog : Dnmt3b 수준은 표준 SDS - PAGE 및 immunoblot 분석에 의해 결정되었습니다. 상대적 Nanog : Dnmt3b 및 Nanog + Dnmt3b의 수치는 아래 표에 나와 있으며, 순진한 다 능성 상태를 안정화시키는 억제제는 녹색으로 강조 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td colspan="2"> 1 차 대상 </td><td> 다른 목표 </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> 렉 </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR 및 TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> 도표 1 : 선정 된 명중 화합물 및 그들의 1 차 키니 아제 표적.

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A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K 조회수.  University of Dundee.  여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다. 

비디오: A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

연구

발생학

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

생화학

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

생물학

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

면역학 및 감염병학

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...