본 연구는 DL과 NIA AG028455 및 DJM위한 NIA AG022385에 NIH / NIBIB R21EB008166에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리가 그들의 D282 종양 생쥐를 제공 프레드 허친슨 암 연구 센터에서 박사 제임스 올슨 감사합니다.

1 부 : 자석 안전 MRI 및 MRS 모두 극도로주의를 요구하는 강력한 자기장을 사용합니다. 예를 들어, 우리가 현재 작업에 사용했던 4.7 T 악기는 약 90,000 배 지구 자기장에게 자기장을 가지고있다. 높은 자기장은 MR 스캐너가 사용되지 않는 경우에도 항상 있습니다. 이러한 높은 자기장과 접촉에 와서 모든 금속 물체는 강력하고 빠르게 자석에 의해 매력을 것입니다. 실험 제목이나 연산자가 자석으로 비행 금속 물체의 발사 경로에있는 경우는 매우 위험합니다. 따라서, MR 실험을 수행 인원은 악기의 근접에 들어가기 전에 자신의 의복에서 어떤 금속 물체를 제거하고 또한 개체에서 무료로 주변 환경을 유지하기 위해 신중해야합니다. 자석 안전에 대한 더 자세한 정보는 문학 1 다음 웹페이지에 나타납니다 <a href="http://www.imrser.org/">http://www.imrser.org/</a> . 금속 재료의 존재는 상기 안전 문제를 일으킬하지만 영상 / spectroscopic 유물을 유도하여 실험 결과에 영향을 수 없습니다. 이미징 객체 근처 또는 내부 금속 재료 선물은 근처에 자기장을 변경하고 그래서 얻은 이미지 유물을 생성하거나 스펙트럼의 라인 너비를 확장 할 수 있습니다. 당신은 MR 절차에 대한 동물을 처리하는 경우 따라서, 자석 외부 지갑, 열쇠, 펜, 등등 두십시오. 2 부 : 마우스의 생체내 MRI에서는 수평 보어 자석에 MRI에 대한 동물의 준비 <ol><li> 모든 동물의 절차는 동물 취급의 종류를 실행하기 전에 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아야한다. </li><li> 우리는 MRI 실험 동물을 마취하는 isoflurane 증발 사용합니다. 동물의 마취는 그러한 avertin (2,2,2 - tribromoethanol 또는 TBE)와 마취제와 xylazine의 칵테일과 같은 다른 anesthetics에 의해 얻을 수 있습니다. 각 마취의 투여량 정보는 표 1에서 발견된다. </li><li> 플라스틱 백업 흡수 패드 (블루 패드 또는 척)과 일치 유도 챔버. 유도 챔버에 마우스 (또는 멀티 마우스 이미지에 대해 여러 쥐) 장소. </li><li> 0.8 1.5 L / 분에 isoflurane 기화기의 유량계를 조정합니다. 다음 isoflurane 기화기 2 약 3 분 4 %로 조정합니다. </li><li> 마취의 수술 비행기 (예 : 없음 발가락 핀치 응답)에 도달하면, 코 콘 (또는 마스크)에 삽입의 코를 가진 동물 소유자에 마우스를 놓으십시오. 머리 restrainer는 머리 이미징에 사용할 수 있으며 신체 소유자는 신체 이미지에 사용할 수 있습니다. </li><li> 동물의 소유자는 잠재적인 움직임을 방지하기 위해 사용됩니다 : 상업 소유자의 몇 가지 종류가 있습니다. 또한, 사용자 정의 설계 보유자는 실험 설정의 특별한 요구 사항을 수용하기 위해 조작하실 수 있습니다. 사용자 정의 설계 홀더 들어, nonmagnetic 자료를 사용할 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 이미징 기간 동안 0.4 0.8 ML / 분에 유량계를 조절하고 1.2 1.5 % isoflurane 기화기을 줄일 수 있습니다. 마우스 코 콘에서 오는 만료 가스 펌프 수집하여 내부 진공으로 제거됩니다. </li><li> 동물의 눈은 살균 안과 윤활 연고와 젖은 유지됩니다. 동물은 온수 순환 시스템 내에서 실험 기간 동안 35-37 ° C에 보관됩니다. 열원의 다른 종류의 같은 온수 패드와 radiofrequency (RF) 코일에 날려 온풍으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 동물 모니터링 시스템은 체온, 호흡 / 심장 사이클을 모니터하고, 이미지 인수와 함께 호흡 / 심장 게이팅를 동기화하는 장소이다. </li><li> 아가로 오스로 만든 표준 샘플 돌발 신호의 변화를 모니터링하는 동물 옆에 배치됩니다. 이 표준 한천 샘플은 다중 슬라이스와 멀티 포인트 화상 시간에 특히 유용합니다. 예상치 못한 신호 변화가 취득한 이미지 통에 감지되면, 예기치 않은 신호 변화와 슬라이스은 멸망하게 될 수 있습니다. 또한, 그 신호 강도는 포스트 - 이미지 분석시 표준 시료의 신호 변화에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> 안전하게 동물 소유자에 대한 동물 및 모니터링 구성 요소를 배치 후, RF 코​​일의 중심에있는 동물 홀더를 위치. </li><li> 자석 룸에 RF 코​​일을 이동하며 자석 안에 온수 순환 시스템에 RF 코​​일을 삽입합니다. 그림 2는 자석의 전면에서 관찰된 MRI 스캐너의 여러 구성 요소가 보어가 표시됩니다. </li></ol> MRI 실험 <ol><li> 1 H의 공진 주파수에 RF 코일을 조정하고 MR 스캐너에있는 조정 패널을 사용하는 50 옴에 코일의 특성 임피던스를 일치합니다. 이것은 신호 수신의 최적 조건을 달성하는 것입니다. 대부분의 인간의 MRI 스캐너를 제외하고 조정 / 일치하는 별도의 과정을 요구하지 않습니다MRS 절차 인치 </li><li> 단일 펄스 시퀀스를 사용하여 shimming 과정을 실시합니다. MR 신호는 환경 자기장의 균질성에 의존합니다. shimming 과정은 최대한 균질로 관심의 영역에서 자기장을 수 있습니다. 각 MR 스캐너는 빠른지도와 기울기 shimming 같은 자동 shimming 빠른 프로세스를 포함하여 shimming 프로세스를 수행하기 위해 자신의 방법이 있습니다. </li><li> 1 차원 이미지 프로필을 극대화하여 RF 펄스을 최적화합니다. 조직의 T 1 5 배 - 펄스 길이가 일정하고 약 3 충분히 TR (재활용 지연) 유지하면서 RF 펄스 파워는 못하였 느니라 수 있습니다. </li><li> 축, 코로나와 화살 이미지를 만드는 세 가지 직교 방향을 따라 이미지를 스카우트 취득. 빠른 이미지 수집 시퀀스 (즉, 기울기 반향이나 빠른 스핀 에코 영상 순서) 스카우트 이미지를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. 구입한 이미지는 이미지 비행기의 결정과 실제 영상을 위해 계획하는 데 사용됩니다. </li><li> 에코 순서를 스핀​​로 변경합니다. 적절한 순서 매개 변수를 선택합니다 : TR (재활용 지연)은 3-5 번 T 1과 같은 프로톤 밀도 또는 T이 가중 이미지로 완벽하게 편안한 이미지를 얻기위한 조직해야합니다. TE (에코 시간) 최초의 RF 펄스와 반향 신호의 중심 사이의 시간 기간입니다. TE 값은 표 2에 요약으로 이미지 명암에 따라 선택할 수 있습니다. 그 뒤쪽에 이종 이식 종양이있는 누드 마우스에 대한 T 1, T 2, T 2 *의 다른 휴식 효과를 인수 생체내 이미지 그림 2 보여줍니다. </li><li> T이 성능은 어느 multiecho 이미징 또는 여러 TE 값을 단일 에코 이미징을 사용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> 생체내에 MRI / MRS 실험 이후에, 동물은 복구 프로세스 전반에 걸쳐 모니터링해야합니다. MR 이미징 후, 동물은 RF 코​​일 밖으로 촬영하고 창구로 돌아왔을 때 완전한 복구를 보장하기 위해 모니터링됩니다. 열 손실 anesthetized 생쥐에서 빠른 속도입니다. 거즈 패드 또는 수건 및 / 그들을 덮고이나 동물이 마취에서 회복되기 전까지는 열원을 제공하여 동물 보온. </li></ol> 이미지 처리 <ol><li> 검토 MR 콘솔에서 이미지를 획득하고 후처리 컴퓨터에 선택한 데이터를 전송. </li><li> 우리는 일반적으로 ImageJ (사용 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/를</a> 이미지 분석). 이미지 분석 이미지 스케일링 / 필터링, T 1, T 2, 확산의 계산, 종양 부피 측정과 종양의 세분화를 포함합니다. </li></ol> 부 3. 수직 보어 자석에 마우스 Hindlimb 골격근에 대한 VIVO MRS에서 가역 국소 빈혈을 유도를위한 커프 구축 <ol><li> 12~15밀리미터의 ID로 다양한 약 5~7mm입니다 PVC 파이프 조각으로 시작합니다. 이 조각 및 스레드의 벽을 통해 작은 구멍을 드릴. </li><li> 그것이 (헬륨 풍선의 품질이 최고의 작품) 양쪽에 열려 있으므로 풍선의 한 조각을 잘라 버릴거야. PVC 조각을 통해 조각을 삽입하고 주변을 다시 포장 및 테이프는 PVC 조각의 외부 벽에 함께 끝납니다. </li><li> 풍선을 봉인하기 위해 포장을 축소 사용 튜브 주위에 끝납니다. 당신은 단단한 외벽과 내벽 팽창과 커프스 버튼이 있어야합니다. </li><li> 구멍과 PVC 조각의 가장자리 사이의 물질을 충분히 떠날 간병, 스레드 구멍 주위 수축 포장과 풍선의 영역을 잘라 버릴거야. PVC에있는 구멍에 비철금속 금속 (예 : 황동)의 1.5 cm 기사를 스레드. 이것은 수갑 급증 수 있습니다. 5 분 에폭시와 함께 그 지역을 봉쇄하라. </li><li> MRS 프로브의 RF 코​​일 옆에 자리에서 수갑 수정하고 외부 혈압계에 연결합니다. </li></ol> 정의 호흡 모니터 <ol><li> 우리는 제한된 공간과 자석의 구멍에 액세스할 수있는 호환되도록 만들어 사용자 정의 만든 호흡 모니터를 사용합니다. 몇몇 상업적인 모델도 있습니다. </li><li> 프로브에 공급 스트레치 방지 튜브의 끝 부분에 작은 풍선을 묶어. </li><li> 압력 변환기로 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. </li><li> 라인과 풍선 기포가 무료입니다하셔야합니다. 거품은 호흡에 의한 마우스 본체의 움직임에 의한 풍선의 압축에서 신호를 감쇠합니다. </li></ol> MRS 프로브의 마우스 위치 <ol><li> 5% Avertin (0.010 ML / G 체중)와 마우스를 마취. </li><li> 마취의 수술 비행기에 도달 후, 마우스 지원에의 뒷면에있는 마우스를 배치하여 MRS 프로브에 마우스를 위치. 마우스의 복부 측면에있는 유체 - 채워진 풍선을 플레이스와 마우스 지원 스트랩과 장소에서 보안. </li><li> 위치 마우스 및 MRS 프로브의 신체 지원합니다. </li><li> 허혈성 수갑을 채워 부인 코일을 관통 hindlimb을 당기세요. 다리가 만무로 코일 중심되어야가능한 채널. 이 배열은 마우스 본체는 (그림 3) 수직 구멍 자석 수평으로 위치 수 있습니다. </li><li> 강성 지원하는 다리를 녹화하여 자리에 다리를 수정. </li><li> 코일에 의해 샘플이 지역 이외의 hindlimb의 subcutaneously 열전대를 배치합니다. </li><li> 건조에서 눈을 방지하기 위해 안과 윤활 연고와 눈을 축축하게하다. 마우스 눈을 감아라과 프로브의 벽에서 마찰이나 자극을 방지하기 위해 얼굴. </li><li> 기타 모니터링 프로브는 실험의 구체적인 필요에 따라 추가할 수 있습니다. </li></ol> 부인 실험 설정 <ol><li> MRS 프로브에서 가열 요소에 공기 흐름을 연결합니다. </li><li> 35-37에서 다리의 온도를 유지하기 위해 VNMR 소프트웨어 변수 온도 제어 장치 ° C.를 설정 </li><li> 코일 주파수 및 1 H 31 P의 resonances 모두 부인 소프트웨어의 튜닝 패널을 사용하여 일치하는 임피던스 조정. </li><li> 1 H 분광법을 사용하여 관심있는 지역에서 B1 자기장의 균질성을 최적화하는 회로를 shimming 조정합니다. </li><li> 하나가 공짜 유도 붕괴 (FID) (90 시간)에서 최대의 신호를 얻을 수있는 RF 펄스 폭을 결정하는 31 P 주파수로 전환합니다. </li><li> 완전히 편안한 조건에서 ATP로 무기 인산염의 비율 (P I) 및 phosphocreatine (PCR)을 결정하는 소음이 완벽하게 편안한 스펙트럼 (FRS)에 높은 신호를 수집합니다. 이러한 스펙트럼은의 FID의 인수 사이의 시간 (TR)과 함께 90 시간을 사용하여 수집됩니다 약 5 배 PCR의 T 1 (20 초. 7 T). 이들은 MR 스펙트럼에서 PCR과 P I 수준의 부량 사용됩니다. </li></ol> 허혈성 실험 <ol><li> 간단한 허혈성 섭동는 동안 phosphocreatine의 변화를 측정하여 휴식과 최대한의 mitochondrial ATP 생산의 결정을 허용하고 즉시 국소 빈혈에 따라. </li><li> 45를 사용하여 여러 스펙트럼을 수집하는 설정 배열 ° 펄스 폭 (즉, 0.5 X 90 시간) 및 0.5x의 TR T 1 (~ 1.5 초).. 우리는 일반적으로 약 6 초 시간 분해능의 모든 스펙트럼 (VNMR 소프트웨어에 평균 수 (나) = 4) 4 FIDs를 수집합니다. 이번에는 해상도는 정확하게 휴식하고 최대한 mitochondrial ATP 생산을 결정하기 위해 충분하다. </li><li> 약 5 분 쉬고 스펙트럼를 수집합니다. </li><li> 10-12분 위해 270-300 mmHg로 수갑 찬하여 국소 빈혈을 유발. </li><li> 수갑 풀어 5 분 복구 스펙트럼을 수집합니다. </li><li> 프로브에서 자석과 마우스에서 프로브를 제거합니다. 마우스가 적절한 조건 하에서 마취에서 회복하도록 허용합니다. 실험 이후 일 반복 수 있습니다. 최종 분광 실험 마우스 다리 근육에 따라 HPLC에 의해 ATP의 농도의 분석을 위해 액체 N 2에서 제거하고 즉시 냉동 고정되어 있습니다. </li></ol> 데이터 분석 <ol><li> 데이터는 NMR 스펙트럼에 대한 몇 가지 스펙트럼 분석 프로그램 중 하나를 사용하여 오프라인 분석이다. 저희 연구실은 일반적으로 정상 부분을 quantifying에 대한 표준 2 jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml)에 맞게 사용합니다. </li><li> 3-5 여러 신문에 설명된대로 국소 빈혈 동안 초기 PCR 분석 요금은 normoxic 조건 mitochondrial ATP 생산의 척도입니다. PCR 회복 속도는 이전에 다음 ID로 4,6 설명한 방식에 따라 mitochondrial ATP 생산을위한 최대한의 용량을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig1.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig1tmb.jpg" alt="그림 1" /></a> 그림 1. 자석의 전면에서 볼 생체내 MRI 설정에서 낳았다. 설치 RF 코​​일, 동물 온난 화 시스템 (또는 온수 순환 시스템) 및 기울기 삽입으로 구성됩니다. 이러한 모든 구성 요소는 수평으로 자석에 삽입됩니다. 따뜻한 물이 자석 룸 밖의 물이 저수지에서 가열하고 Tygon 튜브 (녹색 테이프)를 통해 동물의 온난 화 시스템에 도입입니다. 실린더의 순환 후, 물을 가열하는 물이 저수지로 다시 온난 화 시스템에서 가져온 것입니다. isoflurane 관과 진공관이 MRI 실험하는 동안 마우스를 마취하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig2.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig2tmb.jpg" alt="그림 2" /></a> 그림 2 다양한 휴식 효과와의 뒤로 (화살표)에 이종 이식 종양 (D282 종양)와 누드 마우스에 대한 생체내 이미지 :. A. T 1 이미지 (TR / TE = 500/14.2ms) 정도. B. T 2 이미지 (TR / TE = 2s/40ms) 정도. 모두 T 1과 T 2 가중 이미지는 스핀 에코 시퀀스에 인수되었다. C. T이지도 DIF 인수 이미지를 4 세트로 처리20 일부터 80 MS에 이르기까지 ferent TE 값. D. T 2 * 무게 이미지 (TR / TE = 180/7.39ms, 플립 각도 = 20도)는 기울기 에코 시퀀스에 인수. 35 X 35mm 2 볼 분야는 모든 MR 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig3.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig3tmb.jpg" alt="그림 3" /></a> 그림 3. 다리와 수평 신체 홀더에 위치하고 마우스의 그림은 RF 코일의 확보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig4.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig4tmb.jpg" alt="그림 4" /></a> 그림 4. 생체내 31 P 스펙트럼 사람들을 국소 빈혈 reperfusion의 사이클을 통해. 데이터는 20 Hz에서 기하 급수 필터로 확대 7 T 수직 구멍 자석과 온라인에서 수집되었다. TR = 1, 나 = 4, 매 20 스펙트럼을 꾸몄다 있습니다. 표 1. 마우스 MRI / MRS를위한 마취의 투약. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 동물 종 </td><td> 마취제 대리인 </td><td> 복용량 (MG / injectables에 대한 ㎏) </td><td> 노선 </td></tr><tr><td> 마우스 </td><td> Isoflurane 가스 </td><td> 2-3 분 (유도)의 4.0 %, 지속적으로 다음 1.2-1.5 % (유지 보수) </td><td> 코 콘을 통해 흡입 </td></tr><tr><td> 마우스 </td><td> Avertin </td><td> 5 %, 10ml/kg 체중 </td><td> intraperitoneal (IP) </td></tr><tr><td> 마우스 </td><td> 케타민을 / Xylazine </td><td> 100 MG / kg, 10 MG / kg </td><td> IP </td></tr></tbody></table> 표 2. 휴식 weightings와 이미지 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 이미지 가중치 </td><td> TR (재활용 지연) </td><td> TE (에코 시간) </td></tr><tr><td> T1 </td><td> 단편 (T1 미만) </td><td> 단편 (T2 미만) </td></tr><tr><td> T2 </td><td> 길이 (3 ~ 5 회 T1) </td><td> 롱 (T2 정도) </td></tr><tr><td> PD (양성자 밀도) </td><td> 길이 (3 ~ 5 회 T1) </td><td> 단편 (T2 미만) </td></tr></tbody></table> T1 : 스핀 격자 완화 (또는 세로 휴식) 시간 T2 : 스핀 스핀 휴식 (또는 가로 휴식) 시간

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	<li>Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+safety+issues+in+magnetic+resonance+imaging:+state+of+the+art.">Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art.</a> Radiol Med. 112, 491-491 (2007).</li><li>Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectral+analysis+of+kinetic+data+using+natural+lineshapes.">NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes.</a> Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).</li><li>Amara, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+vivo:+spectroscopy+provides+window+on+cellular+energetics.">Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics.</a> Methods. 46, 312-312 (2008).</li><li>Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+measures+of+ATP+utilization+and+recovery+in+human+skeletal+muscle.">Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle.</a> J Physiol. 465, 203-203 (1993).</li><li>Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+coupling+in+vivo+in+mouse+skeletal+muscle.">Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).</li><li>Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+dependence+of+muscle+phosphocreatine+kinetics+on+oxidative+capacity.">Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity.</a> Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).</li><li>Sun, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+detection+of+gliomas+by+chlorotoxin-conjugated+superparamagnetic+nanoprobes.">In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes.</a> Small. 4, 495-495 (2008).</li><li>Marcinek, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mitochondrial+coupling+in+vivo+alters+cellular+energetics+in+aged+mouse+skeletal+muscle.">Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle.</a> J Physiol. 569, 467-467 (2005).</li></ol>

튜닝 / 일치와 shimming의 사전 취득 단계 높은 공간 해상도와 높은 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 취득하기 위해 중요합니다. 인간 동물 취급을 준수하고 모든 잠재적인 artifactual 측정을 방지하기 위해 신호 인수하는 동안 동물에 대한 안정적인 생리 상태를 유지하기 위해 동물의 모니터링 시스템과 동물 조건을 모니터링하는 것도 중요합니다. 프로토콜에서 설명한 절차가 확산, 관류 및 흐름 이미징 및 ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inova 200 MR scanner/4.7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Bruker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for mouse MRI</td>
</tr>
<tr>
<td>Inova 300 NMR spectrometer/7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Oxford</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for MRS of mouse skeletal muscle</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

noninvasive in vivo small animal mri and mrs: basic experimental procedures

작은 동물 자기 공명 (MR) 연구는 비침습 자연과 그것이 제공하는 생물 학적 정보의 풍부에 의해 현대 생물 의학 연구의 중요한 요소로 떠오르고있다. MR은 이온화 방사선을 필요로하지 않으며 noninvasively 다른 단층 또는 spectroscopic modalities에 비해 높은 해상도와 더 나은 신호 대 잡음 비율을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 noninvasively 휴식이 가중 취득 작은 동물 MR 영상 및 MR 분광법 (MRI / MRS)에 초점을 맞출 것이다<sup&gt; 1</sup&gt; H 마우스의 이미지 얻기<sup&gt; 31</sup마우스 근육의&gt; P 스펙트럼. 이 작품은 작은 동물 MRI / MRS의 모든 부분을 커버하려고 오히려 마우스 MRI / MRS 실험의 기본 절차를 소개하지 않습니다. 이 작품의 주요 목표는위한 기본 절차의 연구자 알려 드리고자합니다<em&gt; 생체내에</em작은 동물&gt; MR 실험. 목표는 MR이 아닌 MR 절차를 모두 완벽하게 통합되도록 자신의 연구가 아닌 MR 구성 요소에 대한 더 나은 계획 MR 필드에 연구원은 새로운 있도록 기본적인 실험 절차의 더 나은 이해를 제공하는 것입니다.

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Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

이 작품은 비침 투 작은 동물 MRI 및 MRS의 기본 절차를 설명합니다<em&gt; 생체내에</em&gt;.

비침 투 VIVO에서 스몰 애니멀 MRI 및 MRS : 기본 실험 절차

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

noninvasive-vivo-small-animal-mri-mrs-basic-experimental

Research

JoVE Journal

Biology

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

16.0K 조회수.  University of Washington. 이 작품은 비침 투 작은 동물 MRI 및 MRS의 기본 절차를 설명합니다 생체내에.

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

연구

생물학

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

의 합성<em&gt; 생체내에서</em&gt; MRI-감지 Apoptosis 프로브

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

닭 에이메리아 기생충의 핵 과 생체 내 전파

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

작은 크기의 텔레오스 모델 일본어 메다카(오리지아스 latipes)에서고나데토미및 혈액 샘플링 절차

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...