전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

수년에 걸쳐 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위한 지지 층으로 사용되어 왔습니다. 이 방법은 또한 2D 결정화에 적용될 수 있습니다, 몇몇 일체형 막 단백질로. 그러나 지질 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다.

지질 단층은 공기 물 인터페이스에서 형성되어 지질의 극지 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지합니다. 그리고 지질 분할의 비 극성 아실 꼬리는 공기 물 인터페이스에, 이는 표면 장력을 깨고 물 표면을 평평하게. 전하 자연 지질 헤드 그룹의 독특한 화학 적 moieties 용액단백질에 대 한 친화성을 제공 합니다.

바인딩을 촉진하고 원칙적으로 2D 어레이 형성을 촉진합니다. 지질 단층상상에 형성된 모든 2D 결정은 지질 층의 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 된 EM 그리드에서 전자 현미경으로 쉽게 전달 될 수 있습니다. 우리는 극저온 전자 현미경 현미경 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론, 이 원고에서 기술했습니다.

지질 단층 준비. 지질 재고 제제는 9:1 부피클로로포, 메탄올에 ml 지질 혼합물 당 0.01 mg을 준비한다. 클로로폼 8.91 ml와 메탄올 0.99 ml, 0.1 ml 의 지질 용액 10 ml를 사용 하 여.

테플론 플레이트 준비. 메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다. 뜨거운 물로 15분간 씻은 다음 증류수로 헹구습니다.

테플론 플레이트를 건조한 상태에서 30분 간 건조시키고 사용할 때까지 진공 상태로 유지합니다. 버퍼 저장소에 지질 단층의 형성. 예상 작동 시간은 1시간 반이 소요됩니다.

페트리 접시에 1형 필터 용지를 놓고 필터 용지 위에 테플론 블록을 정렬합니다. 60 마이크로리터의 완충제로 테플론 플레이트의 우물을 채웁니다. 조심스럽게 드롭에 의해 버퍼 표면 드롭의 상단에 액체 혼합물을 추가합니다.

해밀턴 주사기를 사용하여 드롭당 마이크로리터 1개를 사용하는 것이 이상적입니다. 필터 용지에 증류수로 적시고 페트리 접시에 습도를 유지합니다. 60분 동안 실온에서 배양하면 클로로폼이 증발해야 하며 완충제 표면에 지질의 단층이 형성되어야 한다.

지질 단층상에 EM 그리드를 적용합니다. 예상 작동 시간 1 시간 반. 탄소 코팅 된 EM 그리드를 각 버퍼 저장소의 표면에 빛을 방출하지 않고 부드럽게 놓습니다.

조심스럽게 측면 주입에 단백질을 주입, 하나의 마이크로 몰러 주위에 잘에 최종 단백질 농도를 사용. 실온에서 60분 동안 배양하세요. 테플론 블록의 표면 위에 그리드를 올리기 위해 약 20~30마이크로리터의 완충제를 사이트 사출 포트에 부드럽게 주입한다.

이렇게 하면 핀셋한 쌍으로 그리드를 선택하고 물방울에서 수직으로 들어 올릴 수 있습니다. 대표적인 결과. EM 그리드에 증착된 지질 단층은 대조적 인 염색없이 전송 전자 현미경으로 시각화 될 수 있습니다.

단층의 존재는 해당 빔 경로에 있는 시편이 없는 영역과 대조차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 범위가 있는 지역은 엄호가 없는 그들 보다는 더 낮은 대비가 있습니다. 빈 구멍을 통해 전자 빔이 흩어져 있지 않으므로 더 밝은 조명을 보여줍니다.

결론적으로, 지질 단층 방법은 단순성 때문에 단백질 구조를 공부할 수 있는 기회를 제공합니다. 2D 결정화 과정을 용이하게 하기 위한 대안적 접근법을 제공할 수 있다.