우리는 Drs를 감사하고 싶습니다. bicelle 방법과 유용한 토론 박사 Aviv 파스에 대한 기술 전문 지식과지도를 제공하는 제임스 보위와 살렘 Faham. 우리는 실험 지원 르 뒤를 인정합니다. Rachna Ujwal 그러나이 작품을 지원하지 않았 MemX Biosciences LLC에서 금융 관심이 있습니다. 이 작품은 NIH (RO1 GM078844)에서 부여에 의해 일부 지원되었다.

I) bicelle 형성하는 지질의 준비 : Bicelle 기반 결정은 네 가지 기본 단계 (그림 2)로 구성되어 있습니다, II) bicelle 매체에 단백질을 정제의 결합, 3) 결정화 실험 (수동 또는 robotically) amphiphile 혼합 및 IV) 시각화, 크리스탈 추출 및 냉동. 이 단계는 아래 자세히 설명되어 있습니다 1. Bicelles의 준비 amphiphile 조합 및 농도의 넓은 범위 : Bicelles은 지질의 다양한 형태하실 수 있습니다. 따라서 초기 구성 기반의 이전 성공에 (표 1) 권장 조건은 -입니다. 중 (아래 시약의 표 참조) premixed 즉시 사용 제제와 같은 상업적으로 구입하거나 설명된대로 연구실에 준비할 수 CHAPSO bicelle 제제, : 가장 성공적인 혼합물은 DMPC입니다. 2.8:1 어금니 비율 CHAPSO 혼합물 :이 운동을 위해 우리는 35 % DMPC 1 ML를 준비합니다. <ol><li&gt;을 0.26 g DMPC (미스터 677.9 g / 몰), 0.09 g CHAPSO을 (씨 630.9 g / 몰)가 체중 및 1.0 ML의 최종 볼륨 탈이온수를 추가합니다. <ul type="disc"><li> bicelle 비율과 함께 -40 % 10 % 사이 다를 수 있습니다 DMPC : 2.6-3.0:1 (표 1)에 이르기까지 CHAPSO 어금니 비율. </li><li> 참고 : bicelle 농도가 더 어려워 그것이 높은 솔루션 점도에서 발생하는 지질을 분해하는 것입니다 높은. 그러나, 집중 bicelle 제제는 단백질 농도가 낮은 경우 유리한 수 있습니다. </li></ul></li><li> 동질적인 솔루션을 얻을 수있는 지질을 용해하는 것이이 단계 bicelle 방법에서 가장 많은 시간 소모하고, 상당한 노력이 필요합니다. DMPC 때까지 다음 단계를 통해 사이클은 완전히 혼합입니다 <ol><li> 혼합물을 따뜻한 ~ 40 ° C 물 목욕이나 인큐베이터와 ~ 1 분 와동을 사용합니다. <ul type="disc"><li> 참고 : 자세한 사이클이 수행 있기 때문에, 혼합 온난 화의하면 젤 같은 죄수가 발생합니다sistency은 어려운 와동 제공하고 있습니다. </li></ul></li><li> 몇 분 동안 얼음과 와동에있는 혼합물을 좋았어. 냉각 와동하는 것이 쉽게 솔루션을 녹일 수 있습니다. <ul type="disc"><li> 참고 : 자세한 사이클이 수행되는 바와 같이, 혼합물이 냉각시 뿌옇게 될 수 있습니다. </li></ul></li><li> 지방질이 완전히 해소되기 전까지 (1.2.1 및 1.2.2) 위에 나열된 단계를 반복합니다. <ul type="disc"><li> 참고 :이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. CHAPSO 배합 : ​​Bicelle 형성은 DMPC의 위상 행동의 변화로 표시됩니다. 완료되면, 혼합은 또는 실온 이상의 맑은 젤 얼음에 점성 액체 것입니다. </li></ul></li></ol></li><li> bicelle 혼합물은 이제 사용할 준비가되고 장기 저장 (최대 5 년)을 위해 -20 ° C에 보관하실 수 있습니다. 인지질의 머리 그룹의 가수 분해의 위험 때문에, 그것은 오랜 시간 동안 실온에서 bicelles를 저장하는 것이 좋습니다되지 않습니다. </li></ol> 2. bicelles에 단백질의 결합 bicelles에서 얻은 대부분의 MP 구조 DMPC에 크리스털되었습니다 2-8%까지 CHAPSO bicelle의 농도가 8-12 밀리그램 / ML (표 1)의 단백질 농도를 사용합니다. 가능하면, 초기 화면 다음 지침을 사용해야하고 추가 농도는 최적화 단계에서 검사를하실 수 있습니다. LCP 방법에 비해 bicelles와 단백질 설립은 결정화 실험과 같은 날에 이루어져야 간단한 과정을 (그림 3)입니다. <ol><li> 맑은 젤로 위상 변화까지 실온에서 CHAPSO bicelle 혼합물 : DMPC를 해동. <ul type="disc"><li> 참고 : 여러 냉동 녹아서은 bicelle 행동에 영향을 미치지 않습니다. </li></ul></li><li> liquify과 동질적인 bicelle 위상을 다시하기 위해 간략하게 소용돌이에 얼음에 섞어 놓으십시오. 얼음에 배치하면 혼합물은 뿌옇게 될 수 있습니다. </li><li> 프톰이 시점에서 bicelle 혼합을 유지하고 얼음에 단백질 정화. 이것은 pipetting하는 것이 의무가 만드는 액상의 bicelle를 유지합니다. </li><li> 1시 4분 (V / V) 비율 정화 세제 - solubilized 단백질에 bicelle 혼합물을 추가합니다. <ul type="disc"><li> 예를 들면 : 100 μl 단백질 bicelle 혼합 20 μl bicelle와 80 μl 단백질을 혼합하여 얻을 수 있습니다. 단백질 농도가 15 밀리그램 / ML되고 bicelle 농도가 35 % 인 경우,이 12 밀리그램 / ML의 단백질 농도 7 %의 bicelle 농도와 bicelle - 통합 단백질 혼합물을 제공할 것입니다. </li></ul></li><li> 솔루션은 명확하고 균일한 될 때까지 부드럽게 내용을 pipetting 아래로 섞는다. <ul type="disc"><li> 참고 : 거품이 나타날 경우, 탁상 원심 분리기와 빠른 스핀 (30~60초, 13,000 RPM, 4 ° C)이 그들을 제거할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 단백질 INT의 완전한 결합을 촉진하기 위해 최소 30 분 얼음 혼합물을 품어O bicelles. 단백질 bicelle 혼합물 이제 결정화 실험을위한 준비가되었습니다. </li></ol> 3. 결정화 실험 설정 LCP 같은 다른 지질 결정화 기술은 매체의 높은 점도로 인해 전문적인 장비를 필요로 있지만 bicelles의 독특한 위상 동작은 로봇 (그림 3)를 포함하여 거의 모든 표준 결정화 형식의 구현을 허용합니다. 결정화 실험이 중 표준 상용 스크린을 사용하여 드롭 형식을 걸려거나 앉아 수행하실 수 있습니다. <ol><li> 결정화 로봇을 수동으로 트레이를 설정하거나 사용 여부, 얼음 단백질 bicelle 혼합물을 유지합니다. 이것은 단백질 bicelle 혼합물의 추위를 유지하고 솔루션의 점도가 최소 있는지 확인합니다. </li><li> 수동 결정화 실험 - 표준 피펫을 사용하여 단백질 bicelle 혼합물은 일반적으로 수행하는 것과 같은 방식으로 저수지 솔루션으로 혼합 수 있습니다가용성 또는 세제 - solubilized 멤브레인 단백질에 대한 에드. <ul type="disc"><li> 참고 : 실험 기간 동안 얼음에 단백질 bicelle 혼합 보관하십시오. </li></ul></li><li> 로봇 결정화 평가판 - 우리는 모기 결정화 로봇에 대해 이러한 시련을 맞게 있지만, 원칙적으로 (같은주의 사항 다음과 같은) 기술이 모든 결정화 로봇과 호환되어야합니다. 다음 도움말은 단백질 bicelle 혼합물이 냉각 유지하고 정확하게 로봇 pipetted 확인합니다 : <ol><li> Precool 얼음에 배치하여 단백질 bicelle 혼합물을 가진 접시. </li><li> 접시에 단백질 bicelle 혼합물을 피펫과 얼음의 번호판을 계속 진행합니다. 이 플레이트는 실행을 시작하기 전에 로봇에 갈 수있는 마지막 항목한다. </li><li> 모기 로봇의 플랫폼을 각각 3과 5에있는 저수지 트레이 및 결정화 뚜껑, - 설정합니다. </li><li> 플랫폼 4 단백질 bicelle 혼합물을 포함하고있는 접시를 놓고모기 로봇. 이것은 단백질 bicelle 혼합물이 로봇으로 뽑힐 수있는 마지막 보장하고 즉시 공개합니다. </li><li> 가열 및 증가 점도를 방지하기 위해 단백질 bicelle 혼합물로 저수지를 혼합하지 않습니다. </li><li> 여러 개의 스크린을 수행하면 바로 실행이 완료되면 즉시 냉각 얼음 bicelle 단백질 플레이트를 반환합니다. </li></ol></li><li> 드롭 볼륨과 비율 (단백질 : 저수지)는 종래의 결정화 실험에 관해서는 선택할 수 있습니다. bicelle 혼합 플러스 0.25 μl 저수지 : 예를 들어, 모기 로봇을 사용하여 초기 결정 실험은 0.25 μl 단백질을 사용하여 설정할 수 있습니다. </li><li> 20 챔버에있는 크리스탈 시련을 품어 ° C. bicelles의 위상 문제가 온도에 의존하기 때문에 온도가 좋은 심사 및 최적화 매개 변수입니다. <ul type="disc"><li> 높은 기온은 사전 구성의 이점을 가진 층상 단계 12 (그림 1), 유도레이어에있는 단백질. 20 ° C 이하의 온도가 상영 될 수 있지만,이 이후 C는 장시간 동안 침전에 lipids의 원인이 될 수 있습니다 ° 당신이 네 아래에 가지 말았어야 해. </li></ul></li><li> 전통적인 결정화 실험과 동일한 방법으로 bicelle 재판은 결정 모양과 성장을 정기적으로 모니터링해야합니다. 우리는 1 일 및 3 층 일 후 설치를 매주 검사 다음에 쟁반을 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 크리스탈 최적화는 정기적으로 그리드 심사, 첨가제 심사, 또한 온도 등을 변경 bicelle 비율과 단백질을 포함한 세제 기반의 결정에 사용된 방법을 사용하여 수행하실 수 있습니다 bicelle 비율은 다양 수 있습니다. 또한, bicelles은 단백질의 안정성이나 기능을 위해 필요할 수 있습니다 특정 lipids로 도핑된 수 있습니다. </li></ol> 4. 시각화, 크리스탈 추출 및 냉동 단백질 bicelle 혼합물로 결정 재판 이후<html> 단백질 세제 방울, 시각화 및 수정 추출과 비슷한 점도가 일상이고 전통적인 세트 업과 같은 수행됩니다했습니다. <ol><li> 시각화 : 크리스탈 자주 감지 정상과 편광에 따라 고품질의 조명을 필요로 LCP 미디어에 대조적으로, 시각화가 bicelles에 의해 방해하지 않습니다. 컬러뿐만 아니라 무색 단백질 크리스탈 방울 쉽게 표준 현미경과 특별한 장비가 필요하지 않습니다를 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li><li> Bicelles은 다른 lipidic 미디어처럼, 잘못된 반응의 높은 비율을 생산하는 경향이 있습니다. 자외선 현미경은 크게 소금 결정 (그림 4)에서 단백질을 구별에 도움이됩니다. </li><li> 추출 및 냉동 : 크리스탈 추출 및 냉동이 비교적 간단하고 주변 bicelle 미디어의 해산을 요구하지 않습니다. 또한, bicelle 단계 자체는 일부 중간 cryo - 보호 기능을 제공합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <html> NT &quot;&gt; 그것은 일반적으로 표시하고 자신의 최대 크기로 성장할 수 있도록 약 일주일 이상 결정 2-3 일 소요됩니다.이 bacteriorhodopsin 마우스 전압 - 의존 음이온 채널 1 (mVDAC1) 크리스탈 4,8의 경우했습니다 . 다른 멤브레인 단백질에 대한 그것은 크리스탈 성장을위한 몇 주가 걸릴 수 있으니 잘 첫 주 이상의 수정 시도를 계속 모니터링하는 것이 중요합니다. 다른 lipidic 미디어와 마찬가지로 bicelles가 결정 것으로 나타날 수 있습니다 형태를 형성하는 경향이 있습니다. 그것은 또한 소금과 세제 결정의 높은 비율로 이어질 것이 관찰되었습니다. 트립토판 형광을 감지 UV - 현미경 상당히 등 비 proteinaceous 잘못된 반응을 제거할 수 있습니다. 그림 4로 관찰 될 수있는 다른 결과를 구별할 수 있도록 표시하고 자외선에 많이 본 지질 형태, 소금과 단백질 결정을 보여줍니다. 83fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. Bicelle 도식. Bicelles 그러한 DMPC (파란색)과 같은 이중층의 소수성 가장자리를 보호 CHAPSO (녹색)로 amphiphile로 이중층 형성 지질 분자로 구성되어 있습니다. 온도가 증가되기 때문에, 디스크 같은 bicelles은 천공 층상 시트 12에 위상 변화를 받고있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> 그림 2. 네 가지 기본 단계를 개요 bicelle 결정화 방법 흐름도. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> 그림 3. 크리스탈 재판이 설정 설계도. 정화 세제 것은 - solubilized 막 단백질 직접 간단하게 함께 내용을 pipetting하여 얼음 bicelles와 혼합 수 있습니다. ~ 30 분, 결정화 실험을 위해 얼음에 단백질 / bicelle 혼합 잠복기 후로봇을 포함한 모든 표준 형식을 사용하여 설정할 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> 그림 4. 크리스털 재판의 시각화. 소금 전용 상태로 관찰 (A) 바늘 모양 결정의 보이는 이미지 (맨 위 패널)와 UV 이미지 (하단 패널). 없음 형광는 크리스털의 허위 긍정의 표시를 감지 수 없습니다. (B)로드 모양의 크리스탈이 MPD 상태 형성. 크리스탈은 약하게 fluoresced하지만 X - 선 회절을 사용하여 비 proteinaceous 것으로 발견되었습니다. (C) 크리스탈에 대해 사주 시련을 설정 후 관찰했다. 자외선 아래에서 강한 형광은 단백질 크리스탈 확인합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 번호 </td><td> 단백질 </td><td> 출처 </td><td> Bicelle 제제 </td><td> Concentrati 단백질에 </td><td> 세제 1 </td><td> 해상도 (A) </td><td> 참고 </td></tr><tr><td> 일 </td><td> Bacteriorhodopsin이 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8퍼센트 DMPC : CHAPSO (2.8:1) </td><td> 8 MG / ML </td><td></td><td> 2.0 </td><td> Faham과 보위, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8퍼센트 DTPC : CHAPSO (3시 1분) </td><td> 8 MG / ML </td><td></td><td> 1.8 </td><td> Faham 외., 2005 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> β2 - 아드레날린 수용체 / 팹 복합 </td><td> 호모 사피엔스 </td><td> 8.3 % DMPC : CHAPSO (3시 1분) </td><td> 10 MG / ML </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> 라스무센 외., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 전압 - 의존 음이온 채널 1 </td><td> 뮤스의 musculus </eM&gt; </td><td> 7% DMPC : CHAPSO (2.8:1) </td><td> 12 MG / ML </td><td> LDAO </td><td> 2.3 </td><td> Ujwal 외., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4.2 % DMPC, 5 % NM </td><td> 4 MG / ML </td><td> DDM </td><td> 1.9 </td><td> Luecke 외., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 장사 방형 프로 테아제 </td><td> 대장균 </td><td> 2퍼센트 DMPC : CHAPSO (2.6:1) </td><td> 9 MG / ML </td><td> Nonyl glucoside </td><td> 1.7 </td><td> Vinothkumar 2011 년 </td></tr></tbody></table> 막 단백질 정화에 사용 한 세제 보라색 ​​점막에서 2 기본 lipids는 정화 동안 함께 진행 될 수 있습니다 표 1. 막 단백질 구조의 결정화 조건을 요약 bicelles를 사용하여 해결.

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	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Bicelles는 세제로 solubilized 것처럼 행동하면서 기본 이중층 같은 환경을 제공하는 독특한 lipidic 미디어입니다. 어떤 학습 곡선 또는이 기법에 필요한 전문 장비가 없기 때문에이 속성은 bicelles에게 다른 지질 기반 결정화 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 일단 bicelles가 상업적 또는 실험실에서 준비 중 사용할 수있는, 그들은 결정화 실험은 거의 정확하게 표준 세제 기반 프로토콜과 수행에 ?...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

막 단백질 (MPS)는 이러한 모든 세포 organelles 주변 달리 스며들지 막 이중층에 걸쳐 특정 분자를 펌프 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을한다. 많은 인간의 질병 및 장애의 의원 결과의 함수에서 변경, 따라서 그들의 구조 복잡한 이해 생물 학적 연구를위한 중요한 목표 남아있다. 그러나, 의원의 구조 결정은 종종 자신의 소수성에서 형태소 분석 중대한 도전 남아있다. 의원은 이중층 내에 포함된 실질적인 소수성 영역을했습니다. 세제는 자주 다음 수용성 단백질과 비슷한 방식으로 조작할 수있는 단백질 세제 마이셀을 생성 이중층에서 이러한 단백질을 solubilize하는 데 사용됩니다. 전통적으로, 결정화 실험은 단백질 세제 혼합물을 사용하여 진행,하지만 그들은 종종 결정에 저항하거나 품질의 크리스털을 생산하고 있습니다. 이러한 문제로 인해 발생하는세제의 무능력이 적절하게 가난한 안정성과 이질에 발생하는 이중층을 모방합니다. 또한, 세제의 보호막은 MP의 소수성 표면은 크리스탈 연락처에 사용할 수있는 면적을 줄일 수. 회피 이러한 단점의 의원이 더 밀접하게 자신의 내생적인 환경을 시뮬레이트 lipidic 미디어에서 크리스털 수 있으며, 최근에는 MP의 결정화에 대한 드 노보 기술되고있다. Lipidic 입방 위상 (LCP)는 수성 채널 1의 상호 침투 시스템에 의해 3 차원 지질 이중층입니다. monoolein 선택의 지질이지만, 그러한 monopalmitolein 및 monovaccenin 같은 관련 lipids는 또한 LCP 2를 만들기 위해 사용되었습니다. 의원들은 세 차원과 공급 결정 핵의 확산 LCP에 포함됩니다. LCP의 큰 장점은 단백질이 더 네이티브 환경에 남아있다,하지만 방법은 높은 visc 포함한 기술적 단점을 가지고 있습니다osity (전문 apparatuses을 필요로하는)와 크리스탈 시각화 및 조작 3,4의 어려움. 때문에 이러한 기술적인 문제, 우리는 결정 - bicelles 5,6 (그림 1)에 대해 다른 lipidic 매체를 활용. Bicelles는 amphiphile (CHAPSO) 또는 짧은 사슬 지질 (DHPC)와 phosphatidylcholine의 지질 (DMPC)를 혼합하여 형성 지질 / amphiphile 혼합물입니다. amphiphile 분자 선 apolar 가장자리 bilayers와 세제 모두 유익한 속성을 제공함과 동시에 각 bicelle 디스크 내에 지질 분자는 이중층를 생성합니다. 중요한 것은, 그들의 전이 온도 아래 단백질 bicelle의 혼합물은 감소 점도를 가지고 결정화 로봇과 bicelles 호환 만들기, 세제 - solubilized 의원과 비슷한 방식으로 조작됩니다. Bicelles가 성공적으로 여러 멤브레인 단백질에게 5,7-11 (표 1) 구체화하는 데 사용되었습니다. 이 성장 컬렉션단백질의 prokaryotic과 진핵 소스에서 알파 헬리컬 및 베타 시트 의원 모두 crystallizing에 대한 bicelles의 다재 다능한이 보여줍니다. 때문에 이러한 성공과 높은 처리량 구현의 단순의 bicelles 모든 멤브레인 단백질 crystallographer의 아스날의 일부가되어야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 bicelle 방법을 설명하고 표준 로봇을 사용하여 의원을 정화의 높은 처리량 결정화 실험을 설정하는 데 필요한 단계별 절차를 제공합니다.

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

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Research

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Biology

23.6K 조회수.  University of California Los Angeles. Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합...

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

연구

생물학

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...