<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. papain과 cystatin B 단지 (파란색) (노란색)의 3 차원 구조. 변이된 cystatin B 급 잔류물은 빨간색으로 표시됩니다. 1. Biacore 시스템을 사용하여 레이블이없는 상호 작용 분석의 원칙 Biacore 시스템을 사용하는 전형적인 레이블이없는 구속력이 실험에서는, 생분자은 &#39;리간드가&#39;센서 칩의 표면에 첨부되어 칭했다. 흐름 - 채널 시스템은 검색이 이루어지는 칩 표면 접촉에 &#39;analyte&#39;을 칭했다는 바인딩 파트너를, 제공합니다. analyte는 리간드에 바인딩하면 표면에서 질량을 축적의 결과 변화는 표면 plasmon 공명 (SPR)에 의해 감지됩니다. SPR 응답은 바인딩 analyte의 금액에 비례합니다. 바인딩이 실시간으로 측정되기 때문에, 운동 협회와 특정 상호 작용에 대한 해리 속도 상수가 결정하실 수 있습니다. 이 상수에서, 그것은 평형 분리가 상수로 친화력을 계산하는 것이 가능합니다. 그것은 안정된 상태 데이터 바인딩에서 친화력을 계산하는 것도 가능합니다. 유사한 방법론도 구체적으로 표면에 리간드에 바인딩 단백질의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 2. 단백질 - 단백질 상호 작용의 운동 특성을 분석 Biacore의 X100에는 운동 분석 단일 사이클 속도론을 사용하여 수행할 수 있습니다. 단일 사이클 속도론 실험에서 analyte의 농도 시리즈는 주사 사이에 표면을 재생하지 않고 하나의 분석주기에 주입합니다. 그것이 적합한 재생 조건을 찾기 어려운 경우 따라서, 단일 사이클 속도론은 운동 분석을 수 있습니다. 운동의 실험을위한 데이터가 수집되면, Biacore의 X100 평가 소프트웨어는 상호 작용 모델 데이터를 피팅하여 K, K D 및 K D의 값을 생성합니다. 3. 단백질 농도를 결정하는 방법 biomolecules 사이의 상호 작용을 분석하는 것은 자신의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 핵산을 다른 단백질로 단백질의 바인딩을 특성화하고, 작은 분자로하는 생화 학적 연구의 기초이며, 약물 발견을 포함하여 다른 많은 분야에서 사용을 찾습니다. 이 상호 작용하는 단백질 간의 상호 작용 반응 속도론의 정확한 측정을 위해 그것은 analyte로 사용되는 실험 예제에서 구체적으로 바인딩 단백질의 농도를 알고하는 것이 필수적입니다. 280과 같은 colorimetric assays의 분광 광도계 읽기는 브래드 포드의 시약을 고용 하나는 일반적으로 총 단백질 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 그러나, 단백질 불순물이 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 더 중요한 것은, 단백질 모두 활성 및 비활성 양식은 총 단백질 농도에 포함되어 있습니다. 특히 잘못된 접힘으로 인해 활성화되지 않을 수 있습니다 재조합 단백질의 경우, 그것은 샘플에서 구체적으로 바인딩 단백질의 비율을 결정하는 것이 중요합니다. Biacore의 X100에서 특정 바인딩 활동에 관련된 농도는 중 알려진 표준에서, 또는 더 최근에 소개된 방법론 교정 - 무료 농도 분석 (CFCA)를 사용하여 파생 교정 곡선에 바인딩 응답 수준 비교에 의해 결정하실 수 있습니다. CFCA은 표준에 의존하지 않습니다. 따라서, CFCA 표준은 보통 사용할 수없는 단백질의 돌연변이 형태를 연구의 경우에 특히 유용합니다. 칩 표면에 시료의 확산은 속도 - 제한 때 CFCA 실험에서 초기 바인딩 속도 조건 하에서 서로 다른 유량에서 측정됩니다. 초기 바인딩 속도 1,2에서 특정 바인딩 농도를 계산할 때 analyte의 확산 계수는 흐름 전지와 흐름 속도의 크기는 고려하고 있습니다. 동력학 실험에서 analyte의 농도는 운동 협회 속도 상수와 실험 데이터의 친화력의 계산에 사용됩니다. CFCA 및 Biacore 시스템의 운동 측정은 모두 같은 상호 작용의 속성에 의존하고 있습니다. 따라서 Biacore 분석에 의해 결정 특정 바인딩을 농도가 아닌 총 단백질 농도를 사용하면 결과의 신뢰성을 증가시킵니다. 4. Cystatin B와 Papain 간의 상호 작용을 특징으로 Biacore 분석을 사용 포유 동물 cystatin B는이 단백질은 주로 nons에 참여 papain과 같은 시스테인 proteinases, 주로 카텝신 B, H, K, L 및 S.의 가역, 경쟁 꽉 바인딩 단백질 억제제이다선택 세포내 단백질 저하. Cystatins는이 효소에 의해 부적 절한 proteolysis의 세포와 조직을 보호하기 위해 추정하고 있습니다. 그들은 또한 기생충과 바이러스로부터 시스테인 proteinases를 inactivate와 같은 전염성 대리인의 침략에 대항하는 방어에 참여할 수 있습니다. 또한, cystatins 자주 구조 기능 연구의 모델 효소로 사용되는 등 papain과 같은 몇 가지 식물 시스테인 proteinases을, 억제. 두 단백질 사이의 상호 작용이 억제 측면에서 N - 및 C - 말단까지 두 헤어핀 루프에 의해 제공됩니다, 소수성 연락처에 의해 지배되어 papain 3 보여줍니다과 cystatin의 B 복합의 입체 구조 ( 그림 1). 본 연구에서는, 우리는 소 cystatin를 사용하여 papain에 바인딩을위한 C - 터미널 종료하고 cystatin B의 두 번째 바인딩 루프의 중요성을 검토 papain과 상호 작용 분야에 포인트 변이를 포함하는 B 변종. 우리는 특정 바인딩을 사용하는 네 개의 cystatin의 B 변종의 농도뿐만 아니라 야생의 종류 단백질의 처음으로 결정합니다. 활성 cystatin B의 특정 바인딩 농도가 결정되면, 야생 입력하고 papain에 바인딩 cystatin B의 돌연변이 변종의 속도와 친화력 상수 Biacore X100를 사용하여 측정하고 있습니다. 5. 악기 및 시약 <ol><li> cystatin의 B 변종은 Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala 및 Cys3Ser는 등 이전 4 설명한 생산됩니다. 모든 뮤턴트 cystatin B.의 체인이 황을 통해 연결된 비활성 dimers의 형성을 방지하기 위해, 위치 3 세린에 시스테인의 추가 대체를 포함하는 </li><li> 이전 5 설명된대로 papain 대상도 준비가되어 있습니다. 이것은 S - (methylthio) catalytically 비활성 프로 테아제를 렌더링 활성 클레 프트에 Cys25에 연결된 methylthio 그룹을 가지고 papain (MMTS - papain). </li><li> Biacore의 X100 플러스 패키지 Biacore의 X100은 특정 바인딩 농도 및 바인딩 속도론을 측정하고 분석하는 데 사용됩니다. </li><li> MMTS - papain은 Biacore 아민 커플링 키트를 사용하여 센서 칩 CM5에 고정됩니다. </li><li> 실행은 25 ° C에서 수행하고, 버퍼 산도 7.4에서 0.01 M의 Hepes, 0.15 M NaCl, 0.0034 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 0.05 %의 폴리 솔 베이트 20입니다. </li><li> cystatin B의 각 변종 사이에 센서의 표면은 10 μl / 분 유동 속도로 30 초 동안 20 밀리미터 NaOH로 재생됩니다. </li></ol> 리간드 MMTS - papain의 6.Immobilization CFCA 분석을 위해 MMTS - papain의 공유 결합 첨부 파일 CFCA는 속도가 표면에 analyte 분자의 확산 (대량 전송 제한)에 의해 제한 조건에서 구속 률의 측정에 의존하고 있습니다. 이것은 리간드의 높은 고정 수준으로 선호합니다. MMTS - papain의 고정이 설정하고 Biacore의 X100 제어 소프트웨어의 고정 마법사를 사용하여 실행되었습니다. <ol><li> 10 μl / 분 유량 7 분 succinimide (NHS)와 carbodiimide (EDC)의 혼합물의 주입에 의한 유동 세포 2의 표면을 활성화합니다. 흐름 세포 1 참조 표면으로 사용하기 위해 수정되지 않은 남아 있습니다. </li><li> 5 μl / 분 유량에서 15 분 동안 산도 4.5에서 아세트산 나트륨 버퍼에 50μg/ml에서 MMTS - papain을 주사. </li><li> Ethanolamine 10 μl / 남은 활성 에스테르를 비활성화 분의 유량 7 분 동안 주입됩니다. </li></ol> 전체 커플링 절차에 따라서해야 ~ 유동 셀 2 고정화 3000 RU MMTS - papain. 운동 분석을 위해 MMTS - papain의 공유 결합 첨부 파일 동일한 절차는 유일한 차이점은 운동 분석, 고정 레​​벨이 확산에 의해 제한되는 바인딩 속도를 피하기 위해 낮은해야되는되는, 운동 분석을 위해 MMTS - papain을 immobilizing에 사용됩니다. 흐름 세포 1 참조 표면으로 사용하기 위해뿐만 아니라이 단계에서 수정되지 않은 남아 있습니다. <ol start="4"><li> 7.1에서와 같이 NHS과 EDC의 혼합물로 표면의 활성화 후, MMTS - papain은 50 초 동안 1μg/ml에 주입합니다. 그 후 표면이 단계에서 7.3로 ethanolamine의 주사로 드 활성화됩니다. </li></ol> 커플링 수준은이 절차 후 약 50 RU해야합니다. 7. CFCA 분석을 사용하여 결정 Cystatin B의 농도 <ol><li> CFCA 실험은 Biacore의 X100 플러스 패키지에 CFCA 마법사에 따라 설정됩니다. 약 10 NM 단백질은 유량 10 100 μl / 48초에 대한 중복의 분 주입니다. 표면은 각주기 사이에 20 밀리미터 NaOH로 재생됩니다. </li><li> 각각의 유량에 대한 빈 주사를 포함합니다. </li><li> 단백질 농도는 다음 일을 사용하여 데이터 바인딩 (그림 3)에서 결정됩니다Biacore의 X100 플러스 패키지 평가 소프트웨어의 E CFCA 평가 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 야생 형 cystatin의 B. 특정 바인딩 농도 데이터의 CFCA 분석의 결과는 10 및 100 μl / 분의 흐름 속도에서 얻은 sensorgrams에서 추출한했다. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="그림 3" /> 돌연변이의 그림 3. 농도는 280 측정 (N = 3) 및 CFCA (N = 2)을 사용하여 결정됩니다. 표준 오류는 오류 막대으로 표시됩니다. 어금니 흡수 계수는로 (6)에 설명된 계산했다. 두 가지 방법에 의해 결정 Cys3Ser/Leu73Gly 돌연변이의 농도 값에 큰 차이는 볼 수 있습니다. </li><li> CFCA하여 해당과 280 측정에 의해 결정 농도를 비교하면, 그것은 대부분의 경우 단백질이 Cys3Ser/Leu73Gly 변종에 대해, 완전히 활성화되어있는 동안, 활성 단백질의 분율은 (그림 3) 매우 낮은, 그 분명하다. 아래 표는 280로 전체 농도에 관한 cystatin의 B 변종의 활동을 보여줍니다. <table border="0"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> 280 (%)과 관련 CFCA </td></tr><tr><td> 와일드 유형 </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. Papain에 바인딩 Cystatin B의 속도론을 측정 <ol><li> CFCA 측정을 바탕으로, 2.5에서 cystatin의 B 변종의 각 40 NM에 이르기까지 두 배 농도 시리즈를 준비합니다. </li><li> 동력학 실험은 단일 사이클 접근 방식 Biacore의 X100에 반응 속도론 마법사를 사용하여 설정됩니다. 표면은 주사 사이에 생성하지만, 각각의 분석 사이클이 끝난 후 재생 솔루션으로 20 MM NaOH를 사용하지 않습니다. </li><li> 샘플을 포함하는 각각의 사이클이 버퍼 대신 시료의 주입 빈 사이클에 의해 둘러싸인되도록 실험을 설정합니다. </li><li> 자동으로 참조의 빈 subtractions을 수행하는 Biacore의 X100의 반응 속도론 평가 기능을 사용 1:1 상호 작용 모델을 피팅하기 전에 데이터를 빼서. </li><li> papain으로 cystatin의 B 변종의 바인딩을위한 얻은 실험 데이터는 그림 4에 표시됩니다. 아래 테이블은 협회와 해리 속도 상수와 운동 분석에서 얻은 평형 분리 상수를 각각 요약하여 보여줍니다. <table border="0"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> K (M -1 S -1) </td><td> K D (S -1) </td><td> K D (M) </td></tr><tr><td> 와일드 유형 </td><td> 1.8 X 10 6 </td><td> 0.41 × 10 -3 </td><td> 2.3 × 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1.1 X 10 6 </td><td> 1.7 × 10 -3 </td><td> 1.5 × 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1.1 X 10 6 </td><td> 23 × 10 -3 </td><td> 2.2 × 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1.7 X 10 6 </td><td> 12 × 10 -3 </td><td> 7.1 × 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0.9 X 10 6 </td><td> 0.53 × 10 -3 </td><td> 5.8 × 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. MMTS - papain에 바인딩 cystatin의 B 변종에 대한 운동 프로파일은 하나의 사이클 속도론을 사용하여 결정됩니다. Sensorgrams는 빈과 표시 기준에 검정 중첩 1시 1분 상호 작용 모델에 맞는 운동 데이터를 빼서. </li><li> 돌연변이의 연결 속도가 야생 유형 단백질 (그림 5, 상단 패널)의 비교되지만, 돌연변이의 해리 속도 상수는 평형 분리에 상응하는 증가와 규모의 가까이에 2 인분으로 높은 수 상수 (그림 5, 낮은 패널). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 속도와 친화력 상수의 계산은 CFCA에서 얻은 농도에 따라되었습니다. 변이와 연관된 K, K D 및 K D의 변화는 그래프에 묘사된 있습니다. </li><li> 샘플 농도는 실험 데이터에서 일정한 협회 속도의 계산에서 매개 변수이기 때문에, 그것은그것이 올바른 것이 중요합니다. 대신 CFCA의 280 측정에 따라 농도를 사용하면 Leu73 교체가 다른 cystatin의 B 변종보다 시간이 약 10 느린 협회에서 결과로 보인다 협회 속도에 대한 중요하다는 것을 결론으로 이어질 것입니다. 그러나, CFCA에 의해 측정 특정 바인딩 농도는이 경우에는 전체 단백질의 약 10 %입니다. 이것이 계정에 이것을 당하였을 때 그것은 Leu73 협회의 속도가 다른 변종의와 유사한 것이 분명해진다. 따라서, CFCA 따라서 상호 작용 메커니즘의 적절한 해석이 가능하기 K와 K D의 정확한 평가를 위해 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

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이 작품에는, 4 돌연변이와 야생 타입 cystatin B가 두 번째 바인딩 루프의 중요성을 평가하고 C - 터미널 cystatin B 및 papain 사이의 상호 작용에 대한 종료하기 위해 생산되었다. 이 연구는 장점과 구체적인 구속력 농도를 결정하고 구조 - 기능 관계를 이해하기 위해 단백질 단백질 상호 작용의 반응 속도론을 분석 Biacore X100을 사용 용이성을 보여주었다. 우리는 총 단백질 농도를 측정하는 것은이 경우에 구속력 친화력과 속도론의 결정에 중요한 측정 오류를 소개하고 바인딩 활동을 감소 단백질 변종을 공개하지 않는 것으로 나타났다. cystatin의 B 변종의 특정 바인딩 농도는 Biacore의 X100과 CFCA를 사용하여 결정됩니다. 운동 분석에 대한 입력으로 CFCA의 농도 측정을 사용함으로써 상호 작용 메커니즘의 오른쪽 해석을 수 있도록, 신뢰할 수있는 속도와 친화 상수 결과. K가에만 약간 영향을했습니다 반면 돌연변이의 감소 동질성은 거의 독점적으로 증가 K D 가치로 인해되었습니다. 이 문제는 두 번째 바인딩 루프 지역 및 C - 터미널 발현이 papain으로 억제제의 바인딩 속도에 대한 중요하지 않습니다는 것을 나타냅니다. 대신, 그들은 주로 복잡한이 형성되고 나면 억제제가 효소에 부착된함으로써 바인딩 친화에 기여한다.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

본 연구에서는, 우리는 Biacore의 X100을 사용하여 실시간으로 레이블이없는 분석하여 소 시스테인 프로 테아제 억제제의 cystatin의 B 및 papain (그림 1), 식물 시스테인 프로 테아제의 catalytically 비활성 형태 사이의 상호 작용을 탐험해보세요. papain과 상호 작용 분야에 포인트 돌연변이 여러 cystatin B의 변종이 생산됩니다. 각 cystatin의 B 변종을 위해 우리는 교정 무료 농도 분석을 사용하여 그 구체적인 구속력 농도 (CFCA)를 결정하고 결정으로 총 단백질 농도로 얻은 값을 비교<sub&gt; 280</sub&gt;. 그 후, papain로 바인딩 각 cystatin의 B 변종의 반응 속도론은 단일 사이클 속도론 (SCK)를 사용하여 측정됩니다. 우리는 심사 네 개의 cystatin B의 변종 중 하나가 바인딩에 대해서만 부분적으로 활성화되어 표시됩니다. CFCA에 의해 밝혀이 부분 활동, 협회 속도 상수에 상당한 차이로 해석 (<em&gt; K</em<sub&gt;</sub&gt;)와 선호도 (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), 총 단백질 농도를 사용하여 계산 값을 비교. 구조 기능 연구의 운동 분석과 함께 CFCA를 사용하면 신뢰할 수있는 결과를 얻기에 기여하고, 상호 작용 메커니즘의 오른쪽 해석을하는 데 도움이됩니다.

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

우리는 적용 레이블이없는 운동 특성을 통해 papain 여러 cystatin B로 돌연변이의 바인딩의 구조 - 기능 분석을위한 Biacore의 X100을 사용하여 단백질 상호 작용 분석. 보정이없는 농도 분석 (CFCA)는 표준 곡선을위한 필요없이 유지 바인딩 활동으로 단백질의 농도를 측정합니다. 우리는 CFCA의 운동 분석의 신뢰성을 증가하고 운동 상수가 안정적으로 재조합 단백질의 활동이 감소하더라도 확인할 수 있습니다 사용하는 농도의 확인을 보여줍니다.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

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Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

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비디오: The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

연구

생물학

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

올바른 조직에게 멀티 조직 블록마다 자리

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...