저자는 원고의 중요한 검토를 제공하기 위해 박사 브렌트 해리스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NIH / NCI 부여 P30-CA051008에 의해 부분적으로 지원되는 롬바르디 종합 암 센터의 조직 병리학 및 조직의 공유 자원에서 수행되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

SPOT 1. 건설 <ol><li> 1 분 또는 완전히 용해 될 때까지 15 ML 원뿔 튜브 또는 2 mL의 미세 원심 분리 튜브와 소용돌이에 1 ml의 조직 마킹 염료에 소 혈청 알부민 (BSA)의 50 mg을 추가합니다. 참고 :이 프로토콜의 경우, 생화학 학년 BSA를 사용합니다. 다른 등급 및 순도가 테스트되지 않은 반면, 등급은 순도가 스폿의 성공에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. </li><li> 젤이 완전히 용해 될 때까지 10 초 단위로 30 %의 전력에서 전자 레인지에 15 ML 원뿔 튜브에 열 9 ml의 히드 록시 에틸 아가로 오스 처리 젤. </li><li> 하나의 15 ML 원뿔 튜브에 용융 처리 젤 염료 BSA 솔루션을 결합하고 피펫으로 잘 혼합. 솔루션을 소용돌이. </li><li> 몇 시간 동안 또는 고체 때까지 냉장고에 원뿔 튜브를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 원뿔 튜브에서 컬러 젤 플러그를 해제 길고 얇은 금속 주걱 또는 프로브를 사용합니다. </li><li> CU에 메스 또는 면도날을 사용하여겔은 5mm 두께의 부분으로 횡 플러그 t. 둥근 끝을 제거하고 폐기물 (그림 2A)로 처리. </li><li> 조직학 카세트의 평면 겔 플러그 부분을 놓고 1 시간 동안 70 % 에탄올을 잡아야합니다. 24 시간 동안 적어도 3 변경 사항을 70 % 에탄올 용액마다 2-4 시간을 변경합니다. </li><li> (1 시간마다 (예를 들면, 지방족 탄화수소 용액 3X를 비운 후 맑은 70 % 에탄올, 80 % 에탄올, 95 % 에탄올, 100 % 에탄올 (3X 변화) : 수동 에탄올 시리즈 (1 시간마다 통해 겔 부분을 처리 크실렌 대용품))이 프로토콜에서 사용 된, 크실렌은 수동으로 또는 조직에 processer)도 가능하며, 1 시간마다)을 위해 용융 파라핀 (3X로 침투. 주 : 100 % 에탄올 중의 전체 탈수 이전에, 염료는 자동 조직 프로세서에서 다른 조직이나 시약 액에 영향을 미칠 수있는 겔 플러그로부터 누출된다. 이러한 수동 재수가 좋습니다으로, 그러나 자동 처리 EQU입니다동맹 효과적인. </li><li> 방법론 (그림 2B)를 포함 표준 파라핀을 사용하여 임베드 여러 처리 젤 섹션. 블록 냉각 및 경화 후, 실온으로 올 수 있도록합니다. </li><li> 블록 (그림 2C) 소진 될 때까지 포함 된 젤 섹션에서 자리 코어를 제거하기 원하는 크기의 피부 펀치 바늘을 사용합니다. 하나의 블록은 20 × 2mm 2 코어를 제공 할 수 있습니다. 시원한 지역에서 코어를 저장합니다. 이 프로토콜에 피부 펀치를 사용하여이 그림을 참조하십시오, 1.5 MM (그림의 1D 및 2D) 또는 2mm (그림의 1B, 1C 및 2C). </li></ol> 2. 동양 비 배열 블록에 지점을 사용하여 <ol><li> 원하는 위치와 함께 내장 될 수있는 개별 조직편 모두의 아이덴티티 및 스폿의 위치를​​ 나타내는 조직 배향도를 만든다. 참고 : 조직의 방향도이 페이지를 포함하는지도 설명입니다식별자와 스팟의 위치에 표시된 모든 조직 조각의 A. 물리적 위치. 그것은 전자적으로 생성 할 수 있습니다 또는 손으로 그린​​ 수 있습니다. 이 그림은 가장 최종 제품을 사용하여 기술자 및 연구원에 맞는 어떤 방법을 사용하여 작성해야합니다. 샘플을 쉽게 현미경 분석에서 식별 할 수 있도록이지도는 연구자에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜에 사용 된지도는 손으로 그린​​되었다. 이는 조직의 각 부분과 스폿 그려진 실제 조직 블록 슬라이드와 같은 위치에있는 레이블이 조직 블록과 유리 현미경 슬라이드를 나타낸다. </li><li> 제대로 수익률을 자랑하는 처리 단계에 걸쳐 식별 유지 보장 정상적으로 조직편을 처리한다. 70 % 에탄올, 80 % 에탄올, 95 % 에탄올, 100 % 에탄올 (X3 변경), 지방족 탄화수소 류 (크실렌 대체) (X3 변화), 및 용융 된 조직 침윤 파라핀에서 :이 프로토콜의 경우, 1 시간 각각에 대한 조직을 처리 60 ° C (X3 변경). 참고 :LL 조직은 표준 조직학 실험실 절차에 따라 처리해야한다. 이는 각각의 실험 방법, 조직의 크기 및 종류에 가변적 일 수 있지만, 이것은 배향 수단으로 자리를 사용하는 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. </li><li> 조직의 방향도에 따라 할당 된 올바른 위치에 삽입 역에 조직 조각을 정렬합니다. 모든 블록에 자리하고 조직 조각을 준비하는 방법에 대한 기술자를 안내하는 기준으로 조직 방향 다이어그램을 사용합니다. 참고로 도면에 그려진 매립 기술자가 정확히 동일한 구성에 매립 스테이션 조직편을 매립 역 옆 방향 손으로 그린​​ 맵을두고 배치 된이 프로토콜. 이것은 모든 조직 조각이 최종 제품에서 올바르게 식별으로 유지. 이는 다중 조직 블록 성공적인 사용에 절대적으로 중요하다. </li><li> 모든 조직 조각이 블록에 포함되는 것보다 그 자리 코어 키가 있는지 확인. </li><li> 표준 삽입 방법을 사용하여 조직의 방향도에 따라 적절한 위치에 다음 조직 조각과 끝 (가로)에 지점을 포함시킵니다. 필요에 따라 파라핀이 자리 (들) (1-2 분) 이상 떨어지지 않을 정도로 응고 될 때까지, 집게로 똑바로 자리 (들)을 누르고 있습니다. </li><li> 표준 방법을 사용하여 그 자리에 절과 얼룩 파라핀 섹션. <ol><li> 섹션은 양전하를 띤 유리 슬라이드에 40 ℃의 물을 욕조에 떠 및 부착 할 수 있도록 허용 (충전되지 않은 슬라이드는 테스트되지 않았습니다). 적어도 20 분 동안 60 ° C에서 건조 오븐에서 슬라이드를 건조. </li><li> 다음의 시약을 통해 자동 염색기에서 슬라이드를 놓고 처리 : 크실렌 (크실렌 1-5 분, 자일 렌이, 3-2 분마다), 100 % 에탄올 (2 분), 95 % 에탄올 (약 1 분) 80 % 에탄올 (30 초), 70 % 에탄올 (30 초), 실행 수돗물 (2 분), 헤 마톡 실린 (1.5 분), 실행 수돗물 (3 분), 산 알코올 (1 분), 실행 수돗물 (2 분 ), BLuing 시약 (1 분), 흐르는 물 (2 분), 80 % 에탄올 (30 초), 에오신 (1 분), 흐르는 물 (10 초), 80 % 에탄올 (1 분), 100 % 에탄올 (3 변경 2 분마다), 자일 렌 (3 변경, 각각 30 초). </li><li> 매체를 장착 장착 커버 글라스와 슬라이드를 커버. 참고 :이 프로토콜에서, histotechnician 5 μm의 섹션에서 마이크로톰에 파라핀 블록을 절단. 우리는 자동 염색기를 사용이 프로토콜의 경우, 그러나 동일한 결과를 수동 염색을 통해 얻어 질 수있다. </li></ol></li></ol> TMAs 3. SPOT (수동 TMA 키트) <ol><li> 2.1에 설명하고 현장의 원하는 위치 (들)을 할당 등의 조직 방향 다이어그램을 작성합니다. </li><li> 삽입 역에서 녹은 파라핀와 TMA 금형을 입력합니다. 몰드가 냉각 될 때, 조직 배향 그림에 표시된 원하는 위치에서 TMA 몰드의 마진 단부에 스폿 (S)을 포함. 필요에 따라, 파라핀 하 때까지 똑바로 집게로 자리 (들)을 보유의 그 자리 (들) (1-2 분) 이상 떨어지지 않을 정도로 응고. </li><li> 제조업체의 지시에와 배열 마진 (그림 2D)의 자리 (들)의 위치와 관련하여 따라 TMA 코어를 조립, 표준 단면 및 염색 프로토콜을 따릅니다. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 단면과 염색 방법을 볼 단계 2.6를 참조하십시오. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

관광 명​​소의 성공적인 준비와 활용은 몇 가지 기술적 인 단계에주의 준수해야합니다. 히드 록시 에틸 아가로 오스의 녹는 천천히 낮은 열에서 수행해야합니다. 고온에서 빠르게 녹는 최적의 결과 미만의 아가로 오스의 일부 고장이 발생할 수 있습니다. 처리 조각으로 염료 함유 플러그를 절단 할 때, 각 부분의 두께가 4.5 mm 이상이고, 7 mm를 초과하지 않는 것을 보장한다. 그들은 두께가 균일?...

하나의 파라핀 블록에서 여러 개인에서 조직 샘플을 포함 할 수있는 능력은, 치료와 개인 사이에 쉽게 나란히 비교를 가능하게 슬라이드 사이의 변동성을 제거하고 절편과 표본을 염색의 비용과 작업 부하를 줄일 수 있습니다. 이러한 다중 조직 블록은 전형적으로 비 - 어레이 레이아웃 여러 개인의 조직을 포함하는 조직 마이크로 어레이를 하나 (TMA) 또는 파라핀 블록으로 제조된다. 샘플 정체성 유지는 여러 조직 분석의 성공에 매우 중요하다. 연구자들은 분석의 효율을 향상 슬라이드 사이의 변화를 줄이기 유용한 조직 자원을 절약하고, 시간과 실험 1의 비용을 줄이기 위해 자신의 개발 이후 TMAs 사용하고있다. TMAs의 올바른 방향 조직 코어 2-4 코어 기의 비대칭 배열 3,5- (예 contro 간의 공백, 행 또는 열을 포함하여 다양한 방법을 사용하여 달성 될 수있다치료 대 L), &quot;비콘&quot;코어 6, TMA 매트릭스 3 외부에 지정된 방향 코어. 이러한 방법 TMAs 잘 작동하지만, 대부분의 조직 코어가 시간이 지남에 소진 될 때 식별자가 혼동 될 수 있으므로 간격 및 공백 가치 TMA 코어 공간과 TMAs을 소비한다. 그들은 식별자로 균​​일 한 마이크로 어레이 코어 단단히 주문 패턴의 이상에 의존하기 때문에 또한 이러한 방법은 배열 형식없이 여러 조직 블록에서 사용하기에 적합하지 않다. 대부분의 비 배열 멀티 조직 블록이 수차의 랜드 마크로서 밖으로 서 만드는 구조적 배열 그리드를 표시하지 않습니다, 정의, 비 균일 한 조직을 수용해야합니다. TMA, 가장 큰 단점 중 하나를 사용하는 많은 장점이 있지만, 항상 크게 불균일 한 조직을 반영하지 않고 코어의 작은 크기이다. 비 배열 다중 조직 블록 t 많이 제공그는 TMA의 장점,하지만 더 큰 조직 샘플, 또는 동물 연구에서 전체 기관을 포함한다. 하나의 코어를 사용하여 조직 마이크로 어레이는 관심의 단백질을 기반으로 전체 조직 섹션과 일치를 변화하고 많은 사람들이 증가 일치 7-11 여러 코어를 필요로한다. 때문에 복잡성과 일부 바이오 마커 표현형의 이질적인 특성으로 TMAs는 여전히 불충분 할 수있는 코어도 많은 수의 (&gt; 10)을 사용하여 분석 8 마이크로 어레이 이외의 방법이 필요할 수 있습니다. 또한, TMA 건설은 기술적으로 까다로운 시간이 소요, 그리고 조직 Arrayer에 대한 초기 비용 및 투자 또는 액세스가 필요합니다. 비 배열 된 다중 조직 블록은 상당히 적은 시간과 노력으로 어떤 기본 실험실하여 이루어진 어레이 허용하거나 비용을 절감하고 분석을 단순화하기위한 수단으로 이상 조직을 요구하는 연구를 위해 유효한 대안이 될 수있다. 비 배열 멀티 조직 블록 마찬가지로 신뢰할가 필요하거나ientation 마커 샘플 ID를 추적하는, 그러나, 이들 마커의 개발이 제한되어왔다. 조직의 방향을 설명하는 문헌의 대부분은 잉크 (12) 조직을 문신 개별 조직 조각을 삽입에 대한 올바른 생리 학적 방향에 초점을 맞추고, 사전 처리 (13)에 한천 - 젤라틴의 조직을 미리 포함하고, 노치 (14) 또는 봉합사 (15)과 특정 조직을 표시 . 기능하지만, 이러한 방법은 그들의 한계에 다 조직 블록 마커로 적합하지 않습니다. 봉합 신속 통해 구분되며, 각 섹션에 표시되지 않을 수 있습니다. 처리 및 매립시 올바른 방향으로 조직을 유지 할 수 있습니다 한천, 젤라틴을 사용하여 기술을 사전 포함하지만, 파라핀 블록과 슬라이드에서 여러 샘플을 구별 할 수있는 시각적를 제공하지 않습니다. 조직에 노치 또는 염료 분석을 복잡하게하거나 중요한 형태 학적 정보를 폐색 수 있습니다. 또한, 조직의 정체성비 배열 다중 조직 블록 비대칭 배열로 조직 조각 매립 통해 유지하지만, 이것은 3 이상의 조직편 필요하고 조직 분석을위한 최적 배열에 대한 허용하지 않을 수있다. 표본 방향 태그 (SPOT)은 명확하게 멀티 조직 블록 조직을 식별 할 수있는 쉽고 저렴한 방법으로 개발하고 기존의 방향 방법에 비해 많은 혜택을 제공하고있다. 그 자리는 하이드 록시 에틸 아가로 오스 처리 젤 및 조직 마킹 염료, 구성 및 파라핀 (그림 2C) 침투 작은, 다채로운, 핵심입니다. 그 자리 코어는 멀티 조직 파라핀 블록에서 하나의 조직에 옆에 끝에 임베디드 블록에서 모든 섹션에 밝은 색깔의 점으로 나타납니다 - 명확 블록 및 섹션의 올바른 방향을 나타내는, (그림 1A D) 쉽게 조직을 식별합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

다중 조직 파라핀 블록 효율성 실험 균일 성 및 감소 된 비용과 시간과 높은 처리량 분석을 제공한다. 조직 마이크로 어레이는 다중 조직 파라핀 블록의 대부분을 구성하지만, 점점 연구자 기획 및 장비에 상당한 투자없이 조직 마이크로 어레이의 많은 장점을 제공 할 수있는 다수의 개인들로부터 더 큰 조직을 포함하는 비 - 배열 된 블록을 사용한다. 어떤 다중 조직 분석의 중요한 구성 요소는 각각의 조직을 식별하는 데 사용되는 배향 법이다. 방법은 적절한 방향 및 다중 조직 블록 조직의 식별을 유지하기 위해 존재하지만, 대부분은 배열 내의 유용한 공간을 소모 할 수 있고, 비 배열 블록에 적합하지 않은 및 / 또는 표준 조직학 실험실에서 제조하기가 어렵다. 표본 방향 태그 (스팟) 명확하게 파라핀 블록과 모든 조직 섹션 FO에서 볼 수있는 간단하고 저렴한 비용으로 방향 도구입니다배열 및 비 배열 레이아웃으로 R 신뢰성 시험편 식별. 그 자리는 조직에 대한 직접 수정을 필요로하지 않는 비 배열 블록에 대한 기존의 방향 방법에 비해 이점을 제공하고 조직 조각의 배치의 유연성을 허용한다.

그 자리는 모두 파라핀 섹션 라운드, 파라핀 블록에 밝은 색깔의 점 (그림 1A 및 2D)으로 표시하고 H &amp; E 또는 IHC 염색 과정을 통해 유리 슬라이드에 남아 있습니다 (그림의 1B - 1D 및 2D를). 이 명백한 시각적 보조 모두 각각의 조직 조각을 식별 histotechnician 및 연구원과 histotechnician으로 통신을 단순화는 현미경에서 슬라이드에서 데이?...

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

시편 오리엔테이션 태그 (SPOT)의 목적은 다중 조직 파라핀 블록에서 개별 조직 식별에 도움이되도록 배향 수단으로서 기능하는 것이다. 이러한 프로토콜은 일반적인 저가의 조직 학적 물질에서 쉽게 구성 및 파라핀 블록 및 섹션에서 신뢰할 수있는 시각적 마커 역할을하는 방법을 보여줍니다.

올바른 조직에게 멀티 조직 블록마다 자리

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K 조회수.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  시편 오리엔테이션 태그 (SPOT)의 목적은 다중 조직 파라핀 블록에서 개별 조직 식별에 도움이되도록 배향 수단으로서 기능하는 것이다. 이러한 프로토콜은 일반적인 저가의 조직 학적 물질에서 쉽게 구성 및 파라핀 블록 및 섹션에서 신뢰할 수있는 시각적 마커 역할을하는 방법을 보여줍니다. 

비디오: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

랫 중심에 엔지니어링된 조직의 주입

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

쥐의 눈물샘을 조작

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

출생 후의 쥐의 청각 수포의 해부 : 중이의 뼈와 조직 학적 분석의 분리

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...