에서 연방 기금, NCI와 도요 치료학 사이의 공동 연구 계약; OT에 미국 암 협회 기금 IRG 97-152-17이 작품은 부분적으로 NIH, 국립 암 연구소, 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다 계약 HHSN26120080001E에 따라 국립 암 연구소, NIH.

1. 셀 해물의 준비 이 프로토콜은 모든 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포 부착을위한 것입니다. 필요한 세포 수, 단백질 발현 수준에 따라 최저 많은 20의 x 10 6 세포 6 10에서 다를 수 있습니다. 예를 들어, HEK 세포에 과발현 GFP-STAT3의 해물는 1 ML의 용해 버퍼와 70 %에 가까운 자랄 때 10 ~ T75 플라스크에서 자란 세포를 처리하여 제조 하였다. 그러나이 해물는 MST의 실험 형광 최적의 수준을 제공하기 위해 150 배 희석했습니다. 세포 용해 프로토콜은 조사 대상의 속성과 단백질의 세포 내 국산화에 크게 의존한다. 세제를 사용하여 있기 때문에 단백질의 불안정성의 바람직하지 않은 경우, 초음파는 아래에 설명 된 최선의 선택이 될 수 있습니다. 다른 첨가물이 단백질 수정 반응을 방지하기 위해 용해 버퍼에 추가 할 수 있습니다 : EDTA는 인산화를 방지, 나트륨 바나 다트, 그래서 티로신 단백질 인산 가수 분해 효소를 억제DIUM 불화 빼앗아 / THR 인산의 억제제이다. <ol><li> 용해 버퍼를 준비합니다. 쉬운 추출 세포질 단백질에 대해 다음과 같은 구성은 잘 작동 : 25 MM 트리스 염산, 산도 8.0, 및 프로테아제 억제제 칵테일 2 개 mm AEBSF, 0.3 μM 아프로 티닌, 130 μM의 bestatin으로 구성된 100 배 (시그마 - 알드리치 P2714를 희석 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 14 μM E-64, 1 μM의 펩틴). 또한, 적은 수용성 단백질, 하나는 프로 테아 제 억제제 칵테일과 비 변성 세제 상업 RIPA 버퍼를 사용할 수 있습니다. 얼음에 버퍼를 유지합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS는 T75 플라스크 당 버퍼의 10 ML을 사용하여 간단히 세포를 씻으십시오. 5 분 얼음에 세포를 유지하거나 때까지 세포가 플라스크에서 분리 시작합니다. 필요한 경우 분리하는 세포 스크레이퍼와 세포를 긁어. </li><li> 10 ML 얼음 차가운 PBS와 prechilled 14 ML 둥근 바닥 원심 분리기 튜브로 전송에 세포를 resuspend. </li><li> 4에 400 ~ 600 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포 ° 5 분 C. 나는이 시점에서 몇 가지 플라스크에서 세포를 결합F가 필요합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 200 μL의 PBS 뜨는을 Resuspend 펠렛을 제거하고, 사전에 현탁액을 전송하면 1.5 ML 에펜 도르프 튜브를 냉각. </li><li> 지역의 과열을 최소화하기 위해 얼음에 세포를 유지합니다. 미리 냉장 팁 2-3 밀리미터를 사용하여 30 % 진폭에서 초음파의 배 10 초 펄스로 세포를 용해. 표면 아래 끝이 거품을 최소화 할 것. 대신에 30 분 동안 얼음에 세제가 들어 버퍼와 부화를 사용하는 경우이 단계를 생략합니다. </li><li> 생리 식염 농도 (100 mM의 NaCl을) 5 M NaCl을 사용하여 필요한 경우를 포함 할 해물 솔루션을 수정합니다. </li><li> 10 분 동안 4 ° C에서 약 26,000 XG에서 원심 분리하여 해물를 수집합니다. </li><li> 최적의 해물 희석 (아래 3 항에 설명) 한 적정 (사전 희석 해물 일반적으로 약 300 μL)에 필요한 해물의 양을 결정합니다. </li><li> 조사 대상 단백질 (-80 ° C, 대부분의 경우)에 적절한 온도에서 나누어지는 해물 및 저장. </li> &lt;/ OL&gt; 2. MST 버퍼 선택 및 준비 <ol><li> 단백질 - 리간드 상호 작용이 버퍼 상태에 따라 달라집니다 때문에, MST 버퍼 구성은 특정 시스템의 특성에 따라 선택됩니다. 적어도 두 개의 서로 다른 버퍼를 테스트하기 위해 일반적으로 유리하다. </li><li> 2 배 MST 버퍼를 준비합니다. 그리고 트리스 염산 (250 MM 트리스 염산, 산도 7.4, 750 MM의 염화나트륨, 50 HEPES (; 25 mM의 MgCl 2; 500 mM의 NaCl을 0.25 % NP-40 250 MM의 HEPES, 산도 7.4) : 우리는이 두 가지 성분과 좋은 경험을했다 mM의 MgCl 2, 0.05 % 트윈 - 20). BSA의 추가 (최종 바인딩 혼합물을 5 %)은 플라스틱 튜브와 유리 모세 혈관에 단백질의 부착을 방지 할 수 있습니다. NaN의 3 (0.5 mM의)도 미생물의 성장을 방지하기 위해 포함 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 최적의 해물 희석의 결정 <ol><li> 파장 LED 구동 소스를 선택 λ MST 기기에 = 470 nm의. </li><li> 세륨을 가진 모세 혈관을로드2 희석 MST 버퍼와 배 추출 것이다. </li><li> MST 기기의 제어 소프트웨어의 &quot;모세 혈관을 찾아&quot;작업을 수행합니다. 희석 해물에 최적의 형광 범위는 400 ~ 1,500 형광 단위에서이다. </li></ol> 4. 최적의 리간드 농도 범위의 결정 <ol><li> 리간드의 높은 농도는 예상 해리 상수보다 적어도 20 배 이상이어야한다. </li><li> 낮은 리간드 농도는 형광 단백질의 몰 농도 이하이어야한다. </li></ol> 리간드 농도 범위 추정을위한 NanoTemper 기술 농도 측정기 도구를 참조하십시오. 5. 셀 해물과 리간드 희석의 준비 <ol><li> 얼음에 0.5 ML의 LOBIND 원심 분리기 튜브의 필요한 숫자 (보통 10-16)와 튜브 랙을 배치합니다. 각 튜브의 바닥에 MST 버퍼의 피펫 25 μL. 먼저 욕조에 리간드 원액의 25 μl를 추가E (# 1, 리간드 높은 농도)와 튜브의 나머지 부분을 사용하여 리간드의 시리얼 두 배 희석을 수행합니다. 얼음에 리간드 샘플 랙을 유지합니다. </li><li> 해동 세포가 얼음에 천천히 해물. </li><li> 결합 반응에서 형광 표적 단백질의 최적 수준을 제공하기 위해 MST 버퍼와 세포 해물을 희석. 최종 단백질 농도는 예상 K D 이하에 가까워 야합니다. 그것은 최종 솔루션에 형광 카운트 필요한 번호를 얻기 위해 조정해야합니다. 해물에 GFP-STAT3 농도의 결정에 대해, 기기는 형광의 도움으로 보정 하였다. 해물에서 GFP의 몰 농도는 각각 형광 및 EGFP 양자 수율, 0.85 및 0.61의 비율을 사용하여 결정 하였다. 15 </li></ol> 6. 마이크로 Thermophoresis 바인딩 연구 <ol><li> MST 기기에 λ = 470 nm의와 LED 구동 소스를 선택합니다. </li><li> t의 장소 0.5 ML의 LOBIND 관리간드 시리얼 희석 샘플 튜브 건너편 우베 랙. 조심스럽게 각 튜브의 바닥에 세포 파쇄물의 15 μl를 추가합니다. 샘플의 손실을 방지하기 위해 튜브 벽을 만지지 않도록하십시오. </li><li> 세포의 파쇄와 해당 관에 높은 농도 (# 1) # 1 리간드 샘플의 15 μl를 추가합니다. 잘 섞어 피펫 팁을 변경합니다. 더 리간드가 포함되어야 한 최근 이미지, 제외 튜브의 나머지 부분이 단계를 반복합니다. </li><li> 마지막으로 튜브에 MST 버퍼 15 μl를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 튜브 # 1에서 바인딩 혼합물로 약 2 / 3의 첫 번째 모세관 채우기, 그것은 중심으로 솔루션을 이동하려면 기울 (용지함 입구에 가까운 위치)에 위치 # 1 모세관 트레이에 모세관을 배치 . 나머지 모세 혈관이 단계를 반복합니다. 모세관 끝은 더 이상 실험 왁스로 연결 할 수 있습니다. </li><li> MST 기기 내부의 트레이를 배치하고 기기의 도어를 닫습니다. </li><li> &quot;모세 찾기&quot;를 수행명령은 장비가 모세 혈관의 정확한 위치를 찾아 샘플의 형광을 측정하도록한다. </li><li> 형광 신호 강도에 따라 400-1,500 단위 간격으로 그것을 가지고 LED 전력 (10-100%부터) 조정합니다. </li><li> thermophoresis 실험을 수행 할 수있는 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 하나 이상의 IR 레이저 파워는 특정 시스템을위한 최적의 온도 구배를 찾기 위해 실험 선택할 수 있습니다. 측정의 재현성을 보장하기 위해 모세 혈관의 동일한 세트 2-3 실행에서 데이터를 수집합니다. 그것은 16 모세 혈관의 한 세트를 실행하는 데 10-12 분 정도 소요. </li></ol> 7. 마이크로 Thermophoresis 데이터 분석 <ol><li> 분석 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 프로젝트 폴더를로드합니다. 나타난 정보를 실행 뷰어에서 선택은 특정 IR 레이저 파워의 thermophoretic 곡선에서 수집. 이러한 IR 레이저 파워 등 다양한 조건에서 수집 된 모든의 thermophoretic 흔적을 여는 옵션이 있습니다, P LED가타워를, 온도, 농도, 등. 한 번에 한 다음 전원을 켜거나 전환하여 분석에 대한 곡선을 선택하면 (실험의 이름을 클릭). </li><li> 평가 점수 그래프 창에서 T-점프 thermophoresis 또는 thermophoresis을 선택합니다. 파란색과 빨간색 선이 올바르게 배치되었는지 확인합니다. 표준 편차와 평균 점수를 획득하려면 &quot;평균 사용&quot;또는 별도의 실행은 &quot;구별이 실행됩니다.&quot; </li><li> 해리 상수 맞는 플롯, 레이블 분자 농도 값 (맞는 윈도우 메뉴에서 &quot;농도&quot;광장 확인)를 입력하고 수정, &quot;평균 사용&quot;을 선택하고 곡선에 맞게. 의 표준 편차 K D 값은 별도의 정보를 팝업 창에 나타납니다. 힐 방법을 사용하여 착용감을 플롯하려면, 힐 방법을 &quot;평균&quot;을 선택한 후 곡선에 맞게. 의 표준 편차 EC 50 선호도 값은이 경우에 표시됩니다. 때 포화 K D 또는 언덕 &quot;국경&quot;의 기능도 활용 될 수있다바인딩 상태에 도달하지 않습니다. </li><li> 텍스트 파일의 평균 맞는 데이터를 저장하고 Excel로 전송할 수 있습니다. </li><li> 음모 F 규범 (정규화 된 형광), ΔF 규범 (다른 실험을 비교하는 경우 정규화 된 형광의 차이) 또는 부분 레이블 (적정) 분자의 농도의 함수로 (아래 식 참조) 바인딩됩니다. </li></ol> 분수 (복잡 분자의 비율) = (칼로리 (C) 언 바운드) / (바운드 - 언 바운드), 칼로리 (C)는 농도 C을 측정 thermophoresis 곳 바운드, 언 바운드 (분자가있을 때 언 바운드 상태에 대한 thermophoresis입니다 아니 복잡), 그리고 바인딩은 완전 구속 상태에 대한 thermophoresis입니다.

<ol>
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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 책의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해 나 정책을 반영하지 않으며, 상호, 상용 제품 또는 조직의 언급은 미국 정부의 보증을 의미하지는 않습니다.

단백질 발현 및 정제는, 그러나, 대부분의 현재 사용되는 방법으로 상호 작용 &#39;K D의 결정에 필요한 노동력 및 비용 단계입니다. MST의 응용 프로그램은 크게 상호 작용의 정량적 특성을 단순화하고 가속화함으로써 단백질 정제를 방지 할 수 있습니다. 그런 막 단백질과 전사 인자로하기 어려운 표현하고 정화 단백질의 경우 특히 중요한 이점을 제공합니다. MST의 주...

분자간 상호 작용의 유사성의 양적 특성은 생물 의학 연구의 많은 분야에서 중요합니다. 결합 상수 (K D) 해리뿐만 아니라 신약 개발에 필수적인뿐만 아니라 모든 생물 시스템의 모든 바이너리 상호 작용의 특성에 중요한 매개 변수입니다. 이러한 면역 침전 효모 두 하이브리드 화면 등의 단백질 - 단백질 상호 작용의 검출에 사용되는 생화학 적 방법은 궁합이 특정 복잡한 생체 내에서 주어진 조건에 따라 존재 여부를 정의하는 동안 얼마나 긴밀한 이러한 상호 작용이있다 우리에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 약물 발견 과정에서 바인딩 분석 개발이 필요하고 자주 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나입니다. K D 결정의 가장 일반적으로 사용되는 방법은 형광 편광, 1 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술이 방사성 바인딩, 3 등온 적정 열량계, 4 equilibri을 포함음 투석 (ED), 5 한외 여과 (UF), 5 원심 (UC). 6 그들 모두는 표적 단백질을 정제 상당한 양을 필요로합니다. 마이크로 thermophoresis (MST)은 미세한 온도 변화에서 분자의 방향 움직임을 감지 급속히 발전 방법입니다. 온도 변화에 따라 운동의 상대적인 변화에 생체 분자 결과의 수화 쉘의 변경 7. MST는 바인딩 친화력을 결정하는 데 사용되며 타겟 단백질에 형광 표지 단백질이나 형광등 리간드에 결합 리간드를 공부 적용되었습니다. 8 9 MST는 표면에 고정화의 필요 (고정 - 자유 기술)하지 않고 직접 솔루션의 상호 작용을 측정 할 수 있습니다. 변화의 크기가 크게 시스템에 따라 차이가 있지만 거의 모든 바인딩은, MST 신호의 변화에​​ 의해 동반됩니다. MST에 의한 분자 운동의 탐지를 위해, 그들은 형광해야NT. 방법이 주요 제한은 장점으로 전환 할 수 있습니다. 단백질은 모든 시스템에서 GFP 융합으로 표현되는 경우에만 형광 분자되며 따라서 세포 파쇄 또는 세포 표현의 자유 시스템에서 분리하지 않고 공부하실 수 있습니다. 최소한의 아티팩트 바인딩 상태를 허용 세포 용 해물의 생성은 중요한 과제입니다. 여기에서 우리는 많은 수용성 및 막 단백질에 사용할 수있는 세포 lysate를 준비하고 MST 실험의 프로토콜을 설명합니다. STAT 단백질은 세포 외 신호에 대한 응답으로 티로신 인산화에 의해 활성화 세포질 전사 요인을 잠재하고 면역, 조혈, 염증, 개발. 포유류의 10을 (를) 포함하여 많은 생물 학적 과정에 관여하는, STAT 가족은 STAT 1, 2, 3, 4로 구성 , 5A, 5B, 6. 활성화 된 모든 통계가 같은 DNA 서열에 결합하는 것으로 알려져 있습니다, 그래서 가스 모티브라고, IFN-γ 시퀀스를 활성화. 그러나 transcri다른 통계의 ptional 영향이 매우 다릅니다. 11 많은 병적 인 과정 및 17,000 출판물에 항복 광범위한 연구에 참여에도 불구하고, 서로 다른 DNA 시퀀스와 STAT 상호 작용의 K D가 결정되지 않았습니다. 가스 모티프의 변형에 대한 다양한 통계 만 상대적으로 선호도가 특징되었습니다. 단백질 발현 및 정제 11 어려움이 통계 &#39;DNA 결합 선택도 특성의 주요 방해물이다. 연구의 대부분은 티르 인산화 전사 인자에 대명사 &quot;활성화&quot;통계, 전사 조절에 비 인산화 통계 (U-통계)의 역할의 역할에 초점을 맞추고 있지만 급속히 부상하고있다. 12 그러나 이러한 메커니즘을 제대로 이해, 그리고 U-통계가 실제로 DNA에 결합 또는 다른 전사 인자와의 상호 작용을 통해 작동하는지 불분명합니다. 우리는 최근 U-STAT3는 DNA 순차적에 바인딩 할 수있는 것으로 나타났습니다더 높은 친화력을 가진 가스 모티브 다른 CES. 13 발견이 중요한 단백질의 생물학적 기능에 대한 우리의 이해에 상당한 영향을 미칠 수있다. 우리는 가스에 STAT3의 상대적 유사성을 결정하는 마이크로 thermophoresis을 적용 AT 풍부한 올리고 뉴클레오티드 S +100 (그림 4)가있다. 거의 동일한 프로토콜은 다른 STAT3 리간드 lipopeptide 억제제의 바인딩 K D 결정에 사용되지 않았습니다. 14 음성 대조군으로 사용 된 관련 전사 인자, GFP-STAT1에 바인딩 없음은 따라서 상호 작용의 선택성을 확인 감지 할 수 있습니다. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

단백질 상호 작용의 양적 특성은 특히 생명 과학, 신약 개발의 거의 모든 분야에서 필수적이다. K D 결정의 현재 사용 가능한 대부분의 방법은 시간과 비용이 많이 소모 될 수 있습니다 발생하는이자의 단백질을 정제에 대한 액세스를 필요로합니다. 우리는 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 마이크로 thermophoresis (MST)에 의한 결합력 결정을 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 비 변성 조건에서 GFP 융합 단백질 및 세포 용해의 발현을 포함한다. STAT3-GFP의 방법의 응용 프로그램이 일시적 처음으로 다른 시퀀스 올리고 뉴클레오티드를 잘 공부 전사 인자의 유사성을 판별 할 수 HEK293 세포에서 발현. 프로토콜은 간단하고 작은 분자, 펩티드, DNA, RNA와 단백질의 상호 작용을 공부 응용 프로그램의 다양한있을 수 있습니다, 및 Proteins.

올리고 뉴클레오티드에 바인딩 비 인산화 STAT3 단백질의 유사성을 측정합니다. STAT3-GFP를 발현 HEK293 세포는 DNA 결합 분석을위한 찬란 STAT3의 소스로 사용 하였다. 세포 용 해물은 RIPA 버퍼를 (20 × 10 6 세포 / ㎖)를 사용하여 제조 하였다. 결합 연구를 위해, 해물는 결합 반응 (20 NM)에서 형광 단백질의 최적 수준을 제공하기 위해 MST DNA-결합 버퍼 150X 희석 하였?...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

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30.3K 조회수.  National Cancer Institute. 마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

비디오: Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

연구

생물학

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...