YS - T은 과학적 연구와 개발을위한 독일 - 이스라엘 재단 유럽 연구위원회 (ERC), 이스라엘 과학 재단 (ISF) (250/06), ISF - Bikura, 이스라엘 암 연구 기금 (ICRF), (GIF 지원됩니다 ), 미국 - 이스라엘 Binational 과학 재단 (BSF), 독일 - 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP), 그리고 과학 건강의 이스라엘 부처와 바 - 일란 대학에서 생명 과학의 제인 스턴 Lebell 패밀리 연구원입니다. YB는 Azrieli 활동의 수상 Azrieli 재단에 감사합니다.

사용 전지 시스템은 태그 살아있는 세포에서 mRNA를위한 MS2 반복 시퀀스를 포함하는 통합 유전자 구조를 포함해야합니다. 5 &#39;유전자의가 락 연산자가 포함되어 있습니다 (이 프로토콜에서 우리는 찬란 (그림 1A) 다음과 같이 DNA, RNA 및 단백질 수준 8 분류되는 안정 통합 β - 굴지의 유전자를 품고 인간 U2OS 세포 라인을 사용하여 lacO) 반복 - 이러한 유전자를 (DNA)에 태그를 사용함으로써 통합의 게놈 로커스를 확인하고 있습니다. 찬란 태그 락 억제 단백질 (LacI)는 lacO 반복에 바인딩과 DNA에 태그를합니다. mRNAs은 MS2 반복 (줄기 루프)에 바인딩 YFP - MS2 단백질로 추가됩니다. 유전자 제품은 CFP - 굴지이며, 따라서 유전자의 유도는 CFP - 태그 굴지의 cytoskeleton의 모양으로 발생합니다. 유전자 구조는 U2OS Tet - 온 안정 세포주에 transfected과 표현 Tet transcriptional 통제입니다. 1. 세포 도금 및 transfection : <ol><li> 48시간 전에 측정, 씨앗 ~ 2 * 10 유리 바닥 조직 문화 요리 5 셀 (14mm 유리 바닥 microwell (0.16-0.19 mm의 두께 35mm 배양 접시,. 캣 번호 P35G - 1.5-14 - C , MatTek, 애쉬 랜드, MA)). 50~80%의 합류에 도달하기 위해서는, 세포 매체 2ml를 추가합니다. </li><li> 24시간 실험 전에 transiently 태그 DNA와 mRNA에 대한 형광 마커를 표현하는 구성으로 세포를 transfect. FuGENE6 transfection 시약 (로체)를 사용하십시오. 사용되는 구성 : <ol type="a"><li> YFP - MS2 - NLS는 mRNA의 기록에 MS2 줄기 루프에 태그를합니다. 핵 지방화 시퀀스 (NLS)가 YFP - MS2 단백질에 대한 핵 항목 순서를 제공합니다. </li><li> 옵션 - 5 &#39;유전자의에서 lacO 반복을 바인딩되며 유전자 로커스 레이블을 것입니다 CFP - LacI 또는 RFP - LacI. 태그를 유전자 로커스는 FRAP 실험 동안 유전자를 추적 지원하지만, 필요하지 않습니다. </li></ol></li><li> 일시적 transfected 단백질 (주 참조)을 잘 표현을 얻으려면, 적어도 12 시간을위한 세포를 품어. </li><li> 실험 Tet - inducible CFP - 굴지의 유전자의 활성화를위한 세포를 1.5 μg / ML doxycycline (시그마)를 추가 12시간 전에 - 6. </li></ol> 참고 : * 그래서 배경 신호에 비해 전사 사이트에서 구체적으로 얻은 신호를 마스크하지 transfected 단백질의 매우 높은 표현 수준에 도달하지 않는 것이 중요합니다. 에 핵 수출 신호 (NES)를 추가 C), B) promotor의 강도 (예 : CMV는 L30 모터보다 강력한입니다) 변경) transfection과 실험 사이의 시간을 조정 : 표현의 레벨로 제어할 수 전체 셀에 YFP 신호를 배포하는 데 도움이됩니다 YFP - MS2 - NLS 단백질. * 측정에 사용 형광단이 선호 길이 인수를 통해 photostable되어야하므로 녹색 / 노란색 발광 fluorophores 붉은 fluorophores보다됩니다. 다른 fluorophores에 관한 정보는 심판이 10에서 찾을 수 있습니다. * 다른 빛을 채널 출혈을 통한하지 않는 것이 서로 확인합니다. 별도 마커의 각 레이블 표본을 포함한 사용 슬라이드는 각 슬라이드에 두 채널의 강도를 측정하고, 다음 출혈을 통해 계산합니다. 2. FRAP : 실험은 이미지를 획득하고 레이저 빔을 photobleaching 실적을 모두 할 수있는 모든 현미경을 수행할 수 있습니다. 일반적으로, FRAP 실험은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)로 수행됩니다. 그러나, 우리의 경우에는 이후 실험 (15-30 분) 비교적 긴이며, 우리가 핵 내에 작은 로커스를 따르고 있습니다, 그것은 모든 실험을하는 동안 초점에있는 유전자 로커스 / 전송 사이트를 계속 할 수 있어야 중요합니다. 이것은 시간 (4D)을 통해 3 차원의 빠른 영상을 필요로하고, 같은 인수 가격은 스캐닝 공촛점 현미경을 사용하여 얻을 수 어렵습니다. 따라서, 우리는 빠른 속도로 이미지를 수집할 수 있습니다 EM - CCD (퀀트 - EM, 로퍼)을 갖춘 넓은 분야 올림푸스 IX81 현미경 (63X 계획 - APO, 1.4 NA)에 내장된 3D - FRAP 시스템 (Photometrics)를 사용 (최대 30 이미지 / 초). 시스템은 샘플의 관심이 특정 지역 (ROI)에 photobleaching 수 있도록 카메라와 동기화할 수있는 405 나노미터와 491 nm의 레이저가 있습니다. 현미경은 람다 DG - 4 광원 (셔터) 및 Z - 축에 신속하고 정확한 이미지를 허용 XY &amp; Z 스테이지 (이전)를 갖추고 있습니다. 모든 장비는 통합 MetaMorph (분자 장치)에 의해 제어됩니다. 라이브 셀 실험은 살아있는 세포 챔버 시스템 (도카이)를 사용하여 2 ° C 5 % CO와 37 수행됩니다. <ol><li> 절차 : 30 분 실험 전에 가열 장치, 현미경과 레이저를 켜십시오. experi 동안온도가 일정하게 유지 필요 ment가, 그렇지 않으면 그것은 긴 획득 시간 동안 초점의 변화가 발생할 수 있습니다. 레이저 전원이 일관 전원 출력을 안정해야합니다. </li><li> 카메라와 함께 레이저를 동기화 : <ol><li> 세포를 (DIC를 사용)를 포함하지 않는 접시에서 지역을 검색합니다. </li><li> 실험에 사용되는 동일한 조명 채널을 사용합니다. 여기서 우리는 YFP 채널에 대해 491 nm의 레이저를 사용합니다. </li><li> 이미지의 중간에 레이저를 가리 킵니다. </li><li> 동기화 버튼을 클릭하십시오 (매크로를 제공)를 사용합니다. </li><li> 레이저와 카메라가 동기화되는 것을 보장하기 위해 현장에서 다른 장소를보십시오. </li></ol></li><li> 실험을 위해 좋은 후보 세포를 선택합니다. 우리가 안정적인 세포 라인에서 작동하지만, 우리는 모든 세포와 유사한 표현 수준을 가지고 것을 발견했습니다. 있는만큼 이후 완전히 복구할 수와 b)는 충분한 여유 YFP - MS2 세포에 단백질을 가지고, A) 확실한 YFP - MS2 - 태그 확산 YFP - MS2 배경 위에 전사 사이트를 전시 : 좋은 후보자는 세포 것입니다 (-; 왼쪽 셀에 표백을위한 좋은 후보 아니 두 세포를 비교 그림 1B에 예) photobleaching. </li><li> 적절한 측정 조건을 선택합니다. FRAP 절차는 여러 이미지의 습득을 필요로하고, 따라서 합리적인 노출 시간과 가능한 한 낮은 조명으로 사용 간의 균형을하는 것이 중요합니다. 높은 가벼운 수준 phototoxicity로 인해 세포에 영향을 줄 수 있으며 photobleaching하게됩니다. 그것은 다른 실험 사이 영상 매개 변수가 상수 유지하는 것이 좋습니다. 전지는 150 밀리초 노출 시간과 YFP 채널에서 몇 군데, 그리고 CFP - lacI (게놈 로커스)의 검출에 대한 CFP 채널 인치 아르 YFP - MS2 mRNA 신호 (옵션) photobleached 경우에도 CFP - LacI 태그 로커스를 따라하면 유전자의 검출이 가능합니다. 각 인수에 대한, 7 Z - 350 nm의 모든 조각을 촬영하고 있습니다. 활성화된 전사 사이트는 491 nm의 레이저를 사용하여 표백 있습니다. </li><li> 전체 실험을 수행하지만, 표백하지 않고. FRAP 실험은 정상 상태로 돌아갑니다 전사 사이트에 걸리는 시간을 측정합니다. 첫째, 우리는 활성 전사 사이트가 안정된 상태에서 기능하고 안정되어 있는지 확인합니다 싶어요. 따라서, 우리는 전사 사이트의 측정 농도는 실험 기간 동안 변경되지 않도록하기 위해 표백하지 않고 완벽한 FRAP 실험을 수행하지만. 우리는 또한 전체 이미지 시리즈로 인한 총 photobleaching을 측정하여 이미징 조건을 테스트하기 위해이 실험을 사용합니다. 엄지의 규칙으로, 전체 영화 photobleach는 초기 강도의 30 % 이상해서는 안됩니다. 이것은 첫번째 이미지 (비율이 0.7보다 큰되어야 함)으로 나눈 마지막 이미지에서 핵에 동일한 장소의 강도 비율을 사용하여 측정할 수 있습니다. </li><li> FRAP : 활성 전사 사이트에서 YFP - MS2 신호가 491 nm의 레이저를 사용하여 표백 있습니다. 6 미리 표백 이미지가 취득됩니다. 포스트 표백 이미지 3 시간 주파수의 순서 찾았 : 15 이미지를 매 3 초, 15 영상 매 6 초, 26에게 (또는 긴 실험 45) 이미지를 매 30 초. 인수 이미지 주파수의 변화는 신호의 변화가 적게 두드러진 때 끝 부분 가장 높은 강도의 변화 (초기 복구), 그리고 적은 이미지를 보여주 시대 더 많은 이미지를 얻기위한 수 있습니다. </li></ol> 주 :이 실험을한다는 점에서 &#39;일반&#39;FRAP과 다릅니다 전형적인 FRAP 실험은 세포의 다른 단백질의 이동성을 측정하는 반면 전사 사이트에서 mRNA의 * FRAP은 초기 mRNA에 YFP - MS2 단백질의 바인딩을 측정합니다. 따라서, YFP - MS2 단백질의 잘 퍼지는 수영장을 측정에는 관심이 없습니다. 표백 및 첫 번째 인수 이미지 사이의 시간이 비교적 긴 경우는 무료 YFP - MS2 단백질이 diffusing 수영장을 무시하는 것이 가능합니다. YFP - MS2 신호의 회복 (15-30 분) 상대적으로 길이 * 때문에 그것은 초점에서 전사 사이트를 유지하는 것이 중요합니다. 그 Z - 조각 일련의이 모든 시점에서 취득하는 이유입니다. 3. FRAP 데이터의 정상화 : 4D FRAP 데이터가 무료 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ를 (; NIH, 베데스다, MD 사용하는 분석이다 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). 다음은 ImageJ 소프트웨어를 통해 사용할 수 매크로와 분석을 수행하지만, 물론 자기 작성된 매크로가 생성하실 수 있습니다. <ol><li> Z - 스택 최대 자세한 분석을 위해 시간이 지남에 따라 2D 영화에 발생하는 모든 시간이 지점에서 예상하고 있습니다. </li><li> 전사 사이트는 각 프레임에 추적되고 의미 강도는 스팟 트래커 도구를 사용하여 측정됩니다. 11 데이터가 추가 분석을위한 엑셀 시트에 저장됩니다. </li><li> 때마다 포인트에 대한 관심 (ROI)의 다른 지역에서 평균 농도는 (ImageJ의 플러그인의 시간 시리즈 분석기를 사용하여) 다음과 같이 측정 :) 다시지상은 셀 = B (T) 이외의 투자 수익 (ROI)에서 가져옵니다. nucleoplasm의 B) 투자 수익 (ROI)하지만까지 가능한 표백제 사이트에서 = C (T). C) 전사 사이트 = S (T) (로 현장 추적기로 측정). </li><li> 이미징 동안 발생 photobleaching에 대한 데이터를 수정 : 다른 모든 측정에서 배경을 제거하고 표백제를 해결하십시오. SC (t)는 시간 t와에서 전사 사이트의 수정된 강도입니다 </li></ol> EQ. 1 : <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq1.jpg" alt="방정식 1" /><ol start="5"><li> 데이터를 정상화 : 먼저 정상 상태 (= &lt;Sc (pre-bleach)&gt;)에서 전사 사이트의 강도를 보여주는 사전 표백제 이미지의 평균을 계산합니다. </li></ol> 그런 다음 데이터를 정상화 : EQ. 2 <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq2.jpg" alt="방정식 2" /> 데이터는 적어도 10 실험을위한 표준입니다. 실험의 평균 때마다 점 (그림 1C)에서 오류 막대에 대한 표준 편차 (STD)를 계산합니다. 참고 : FRAP 분석 중에 YFP - MS2 단백질의 확산은 바운드 YFP - MS2는 mRNA에 높은 친화력과 관련되는 동안 매우 빠른 속도입니다 무료 nucleoplasmic YFP - MS2의 확산 속도 때문에 무시되었고, 전사에 다시 연결하지 않습니다 사이트입니다. 이것은 표백 후 첫 이미지를 분석하기 전에 제거되어야하는 이유입니다. 4. 수학적 모델을 사용하여 데이터를 분석 : 이런 종류의 데이터 집합에서 운동 매개 변수를 검색하기 위해, 우리는 이러한 종류의 데이터에 맞게 수있는 간단한 설명 모델을 사용합니다. 특정 모델의 자세한 설명이 여기에 5 읽을 수 있습니다. 모델은 그림 2A의 구조를 설명하는 다음과 같은 방정식을 포함 : <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq3.jpg" alt="방정식 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq4.jpg" alt="방정식 4" /> 모델 매개 변수를 가지고, 그것은 신장 속도를 계산 할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq5.jpg" alt="방정식 5" /> 우리는 버클리 마돈나 (사용 곡선 분석 <a href="http://www.berkeleymadonna.com">http://www.berkeleymadonna.com를</a> )로 이전 5 모델이지만 다른 옵션은 (MatLab, 가상 세포, COPASI 등) 사용할 수 있습니다. 데이터 모델에 맞게되었고 속도 상수가 추출되었다. 우리는 버클리 마돈나의 코드를 첨부합니다. 가장 우리가 안정된 상태를 계산하고 표준 모델에 표준 실험 데이터에 맞게 데이터에 맞게 순서를 유지해야합니다. 5. 대표 결과 : 우리는 높은 레이저 전원을 사용하여 활성 전사 사이트에 표시 mRNA 신호를 photobleached하고, 시간이 지남에 따라 YFP - MS2 신호의 복구를 따랐다. 전사 사이트에서 형광 신호는 mRNA 합성뿐만 아니라 사이트에서 발표 mRNA의 안정 상태의 속도론로 구성되어 있습니다. 표백하지 않고 시간이 지남에 따라 전사 사이트 강도를 측정하면이 유전자가 상대적으로 안정된 상태에서 현재는 것을 의미하는 &#39;상수&#39;신호를 (그림 1C, 붉은 점) 제공합니다. 이것은 새로 베꼈는데 mRNA에 축적되어 신호가 mRNA가 전사 사이트에서 출시되면 단풍 신호와 같다는 것을 의미합니다. photobleached 경우,이 시스템은 정상 상태에서 계속하지만 복구할 수있는 신호 걸리는 시간을 측정하는 현재이 가능합니다. 따라서, 형광의 복구 주로 효소의 신장 특성에 따라 달라집니다. 3D FRAP 시스템 FRAP 복구하는 동안 전체 3D 핵 볼륨의 인수를 허용함으로써 신호는 실험 중에 손실되지 않았습니다. 데이터에서 운동 매개 변수를 계산 들어, 표준 곡선은 미분 방정식을 기반으로하는 운동 모델을 설명하는 신장에 장착되어되었습니다. 간단한 ODE 모델을 사용하여 5 장점은 그것이 매개 변수에만 소수에 맞게 수있다는 것입니다 . 모델의 초기 단계 (진입점)은 즉 신장, 새로운 MS2 바인딩 사이트를 합성을 담당하는 프로세스입니다. 최종 단계 (종료 시점)는 nucleoplasm에 mRNA의 릴리스입니다. 모델은 복구 2 번 kinetically 해결의 구성 요소로 구성되어 곡선, 한 빠른 한 느린 기반으로합니다. 느린 구성 요소가 신장하는 동안 일시 중지 효소와 같은 모델로했다 반면 빠른 구성 요소, 연신율을 말합니다. 두 효소의 상태는 일시 중지하는 확률적 전환과 신장으로 모델링되었습니다. 우리는 느린 합성 속도 (2.5 분 누적 시간에 일시 중지)에 확률적 전환과 함께 3.3 KB / 분의 신장 속도를 나왔고이 모델에서 미분 방정식을 최적화. 모델링 THA 보여t 신장에서 일시 중지가 신장을 입력한 polymerases의 단 11 %에 영향이 전환. <table border="1"><tbody><tr><td> K 아웃 </td><td> 0.0112 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_in </td><td> 0.0015 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_out </td><td> 0.0067 </td><td></td></tr><tr><td> 신장 시간 </td><td> (K 아웃 + K pause_out) -1 </td><td> 56 초 </td></tr><tr><td> 일시 중지 시간 </td><td> (K pause_out) -1 </td><td> 2.5 분 </td></tr><tr><td> 일시 정지 확률 </td><td> (K pause_in) / (K + K pause_in는 아웃) </td><td> 11% </td></tr></tbody></table> 표 1. 모델은 매개 변수 테이블에 결과를. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. (A) 실험 전지 시스템은 생체내의 유전자 발현에 따라 사용됩니다. CFP - 굴지 유전자의 개략도 표현 건설. 5&#39; - 끝이 RFP - LacI (적색)에 의해 바운드 및 유전자 통합 사이트를 표시 아르 256 lacO 반복 일련의 포함되어 있습니다. 최소한의 CMV 프로 모터에서 Transcriptional 유도는 독스의 존재에 Tet - 반응 요소 (트레즈)에 반대 테트라 사이클린 transcriptional 활성제 (rtTA 또는 Tet - 온)의 결합에 의해 이루어진다. 베꼈는데 mRNA는 코딩 CFP - β - 굴지에 대한 순서 및 YFP - MS2 융합 단백질에 의해 구속 있으며 24 MS2 반복이 포함되어 있습니다. 3&#39; - 끝에서, 토끼 β - globin 엑손 - 인트론 - 엑손 모듈의 일부가 절단 - polyA 신호옵니다. 체계는 또한 RNA 폴 II에 의해 베꼈는데 새로 베꼈는데 mRNAs에 부착된 형광 MS2 단백질 (노란색)을 보여주는 연신율 분석을 설명합니다. (B) 활성 전사 사이트 (YFP - MS2, 오른쪽 셀)이 photobleached되었으며 형광 복구 추적 시간이 지남에 (하단에 프레임). 우리는 표백 (중간 라인) 및 비 표백 (결론) 활성 전사 사이트 모두의 형광 강도를 측정했습니다. 왼쪽 셀에 photobleaching 실험에 적합하지 않습니다. (C) 실험 측정 CFP - 굴지의 유전자 전사 사이트에서 수행. YFP - MS2 FRAP 측정 블루 복구 곡선에. 빨강, 안정된 상태에서 전사 사이트의 YFP - MS2 신호를 보여주는 동일한 실험에서 비 표백 세포에서. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 전사 사이트에서 YFP - MS2 분자로 표시된 mRNAs의 입구와 출구 속도론을 설명하는 모델 (A) 제도. (B) YFP - MS2의 FRAP 데이터 및 장착 시뮬레이션 (10 실험의 평균이 모델에 장착했습니다) . 적합의 계산된 residuals은 하단에 제공됩니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

살아있는 세포에서 효소 운동 활동을 측정하는 방법은 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 부분은 두 번째 부분에서 데이터가 ODE 모델을 사용하여 분석 반면, 측정 및 mRNA의 전사의 운동 데이터를 가져올 수있는 &#39;서부 유럽 표준시&#39;절차를 설명합니다. 5 연구의 숫자가 지금은 추출이 접근 방법을 활용해야 살아있는 세포 5, 6, 8, 12-14에서 전사 속도론. 이러한 연구 사이의 ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> FuGENE 6 transfection 시약 </td><td> 로체 </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

RNA 중합 효소 II (폴 II)의 transcriptional 활동은 역동적인 과정이므로 생체내의 transcriptional 프로세스의 속도론을 측정하는 것은 중요하다. 폴 II의 속도론이 생화 학적 또는 분자 방법을 사용하여 측정하고 있습니다. 1-3 최근에는 새로운 시각화 방법의 개발, 그것은 하나의 살아있는 세포에서 실시간으로 발생하는 등 전사에 따라 가능한되었다 4. 여기에 우리는 방법에 대해 설명합니다 특정 유전자 로커스 (DNA), 그 mRNA의 제품 및 최종 단백질 제품이 찬란 표시 및 생체내에서 시각 수있는 세포주를 사용하여 살아있는 세포의 특정 유전자에 대한 폴 II 신장 속도론의 분석을 수행할 수 있습니다. 5, 6 , 그것은 관심의 유전자에 mRNAs의 실제 전사를 감지할 수 있습니다. 7, 8 mRNA가 찬란 mRNA의 기록의 3&#39;UTR 24 MS2 줄기 루프를 포함하는 생체내에 태그 mRNAs위한 MS2 시스템을 이용하여 태그입니다 그것이 베꼈는데 그대로 mRNA를 레이블 YFP - MS2 코트 단백질에 대한 매우 구체적인 구속력이 사이트를 제공하는 반복은 9. 우리가 (FRAP) 메서드를 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하여 녹음의 속도론을 모니터링합니다. 녹음의 사이트에있는 YFP - MS2 - 태그 초기 기록을 photobleaching 후 시간이 지남에 따라이 신호의 복구를 수행함으로써, 우리가 새로 만든 mRNAs의 합성 속도를 얻는 5. 즉, YFP - MS2 형광 복구 생성을 반영 새로운 MS2의 형광 무료 YFP - MS2는 주변 nucleoplasm에서 입력 분자에 의해 초기 기록과 바인딩에 줄기 루프. FRAP 복구 곡선은 다음 녹음의 운동 시간 매개 변수를 검색하기 위해, 미분 방정식의 시리즈 공식 수학 기계론의 모델을 사용하여 분석하고 있습니다.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.4K 조회수.  Bar-Ilan University. RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

연구

생물학

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...