우리는 형광 단백질을 인코딩 플라스미드 DNA를 제공하는 마이크 W. 데이비슨 (플로리다 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 건강 부여 GM72048 (전자 파동 탐색)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 형광 단백질 비말 샘플 준비 형광 단백질 비말 샘플은 물에 단계에 거주하는 형광 단백질과 1-octanol/water의 에멀젼으로 구성되어 있습니다. 이 유제는 현미경의 응용 프로그램에 대한 현미경 슬라이드와 22mm 광장 커버 유리 사이에 끼워 넣으면됩니다. <ol><li> 형광 단백질 비말 샘플을하기 전에 현미경 슬라이드와 커버 안경은 소수성 요원과 함께 세척 및 코팅해야합니다. </li><li> 아세톤 5 분 세탁하여 유리를 청소하고 공기에 의해 건조에 둡니다. (선택, 유리 청소 후 최적의 코팅 결과를 얻기 위해 플라즈마 클리너에서 30 초 동안 처리 수 있습니다.) </li><li> 이 솔루션에서 2 분 동안 배양 아세톤 및 코팅 유리의 2 % methyltrimethoxysilane 솔루션을 준비합니다. 코팅 후 용액에서 유리를 제거하고 공기에 의해 건조에 둡니다. 그런 다음 스프레이 용기에서 70 % 에탄올로 씻어 다시 건조에 둡니다. (선택,이 시점에서 유리는 ° C가 covalently 유리에 코팅을 연결하는 80에서 1 시간 동안 구운 수 있습니다.) 코팅 유리는 적어도 한 달 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 형광 단백질은 E.에서 그의 6 태그 단백질로 정화 아르 대장균 1. 정화 단백질의 흡광도 스펙트럼을 측정하고 인트 버퍼 (150 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL 산도 8, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 ~ 0.1의 광학 밀도 주식 희석을 준비, 0.1 % 소 혈청 알부민을 포함 (BSA) . 또한 15 ML 원뿔 관 1 - octanol과 인트 버퍼의 1:1 혼합물 10 ML을 준비하고 적극적으로 섞는다. 혼합 휴가 후 상 분리가 완료될 때까지. 상단 단계 1 - octanol입니다. (주의 : 1 - octanol이 강한 냄새를 가지고 있기 때문에 그것은 1 - octanol과 접촉 제공 모든 폐쇄 폐기물​​ 컨테이너를 사용하는 것이 중요합니다.) </li><li> 유제 피펫 45 μl 1 - octanol과 microfuge 튜브 5 μl 형광 단백질을 만들 수 있습니다. 유제의 형성을 시작하고 다음 sonication 욕조에서 30 초 동안 튜브를 sonicate하여 손가락으로 튜브를 몇 번 누릅니다. 에서는 한편 코팅 현미경 슬라이드를 유리 준비 커버. sonication 후 유제 완전히 뿌연해야합니다. 즉시 코팅 현미경 슬라이드에 튜브의 중간에서 sonication 피펫 4 μl 유제 후 코팅 커버 유리 커버. </li><li> 절차가 완료되면 제대로 유제는 현미경 슬라이드 및 개체 유리 사이에 균등하게 분산합니다. 분 이내에 샘플 직경 변화와 함께 ~ 10 μm의 두께의 형광 방울을 구성, 안정되어야합니다. 가장 큰 방울은 샘플의 중심 가까이에 있으며 작은가 가장자리쪽으로 더 있습니다. </li></ol> 2. photoconversion 실험 설정 다음 절차는 형광 단백질 photoconversion 실험을 설정하는 일반적인 전략이다. 이 절차는 라이브 세포뿐만 아니라 단백질 투석을 위해 적용할 수 있습니다. <ol><li> 다음 매개 변수는 photoconversion 실험을 설정하는 일반적인 출발점을 제공합니다 : 40x 1.3NA 기름 침지 목표 이미지 크기 = 512 X 512 픽셀 스캔 확대 = 4 픽셀 시간 = 6 μsec 살기. Z - 해상도 (핀홀 크기) = 3 μm의 </li><li> 이 초기와 photoconverted 형광에 대한 검색 채널뿐만 아니라 &quot;photoconversion 채널&quot;을 구성합니다. 이 예제에서 우리는 오렌지로 붉은 photoconvertible 형광 단백질이다 mOrange2 단백질을 정화 사용합니다. 오렌지 수종은 561 나노미터 여기와 형광이 570 nm의와 630 nm의 사이에 수집된를 사용하여 감지됩니다. photoconverted 적색 종은 633 나노미터 여기와 형광이 640 nm의와 700 nm의 사이에 수집된를 사용하여 감지됩니다. &quot;photoconversion 채널&quot;은 488 나노미터 여기를 선택하고 490 nm의와 540 nm의 형광 사이에 수집하십시오. (참고 :. 이미징 photoconversion 채널 엄격하게 필요하지 않습니다) </li><li> 이미징 레이저 전원과 최적의 이미지 품질을위한 검출기 이득을 조정하기 위해 지속적인 검사와 함께 초기 형광을위한 채널을 사용합니다. </li><li> photoconversion 채널을 활성화하고 낮은 레이저 파워를 선택합니다. 이미지에게 시간 저속 시리즈를 시작하고 초기 형광 표백 중요한이 관찰 때까지 점차 photoconversion 레이저를 높일 수 있습니다. 초기 형광 약 75% 표백 때까지 스캔을 계속합니다. </li><li> photoconversion 채널을 비활성화하고 photoconverted 형광에 대한 검색 채널을 활성화합니다. 높은 검출기 이득과 낮은 레이저 파워 이미징을 시작하고 photoconverted 형광이 발견 될 때까지 점차적으로 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다. 일단 당신이 레이저 전원과 최적의 이미지 품질을위한 검출기 이득을 조정할 수 있습니다 photoconverted 형광을 감지. </li><li> 마지막으로 레이저 전원 사용photoconversion뿐만 아니라에 대한 photoconversion의 기간은 최적화해야합니다. photoconversion 레이저 전원을 늘리면, photoconversion의 속도를 가속 것입니다 그러나 너무 많은 레이저의 파워는 단백질 photobleach 것입니다. </li><li> 최적의 photoconversion 레이저 파워와 기간이 결정되고 나면,이 매개 변수는 표준 photobleaching 또는 FRAP 모듈과 &quot;photoconversion 채널&quot;더 이상 필요하지 않습니다를 구성하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. mOrange2 및 Dronpa와 함께 듀얼 - 프로브 광 하이라이트 때문에 붉은 이동 스펙트럼 특성, mOrange2 4 각 셀 (organelle) 인구의 선택적 하이라이트 수 있도록 듀얼 프로브 광학 하이라이트를 위해 녹색 형광 단백질 photoswitchable Dronpa와 함께 사용할 수 있습니다. <ol><li> 전지는 유리 바닥 MatTek 요리 재배 및 사전 표준 Lipofectamine2000 transfection 1을 사용 영상 24 시간 transfected 있습니다. </li><li> 로 제 2의 설명에 mOrange2 photoconversion에 대한 현미경을 설정합니다. </li><li> Dronpa의 photoswitching에 대한 현미경을 구성합니다. Dronpa 형광은 mOrange2 &quot;photoconversion 채널&quot;(단계 2.2 참조)를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. (참고 : 이미지 Dronpa에 사용되는 레이저 전원을 최소화, 너무 많은 레이저 전원이 Dronpa의 불활 성화를 일으킬 수 있기 때문에.) Dronpa의 photoactivati​​on에 대한 채널을 추가합니다. 우리는 photoactivati​​on 두 - 광자 여기 800 나노미터를 사용하지만, 또한 이것은 405 나노미터 여기를 사용하여 얻을 수 있습니다. 레이저 이미징에 필요한 전력, photoactivati​​on 및 Dronpa 형광 photoinactivati​​on를 결정합니다. </li><li> 주의 : mOrange2의 Photoconversion 및 Dronpa의 불활 성화 모두 488 나노미터 여기에 발생합니다. 때문에 mOrange2 photoconversion에 필요한 높은 레이저 전원 이것은 또한 Dronpa 형광을 inactivate 것입니다. 한편, Dronpa의 불활 성화는 훨씬 낮은 레이저 파워에서 이미 발생하고 상당한 mOrange2 photoconversion없이 수행할 수 있습니다. </li><li> mOrange2의 photoconversion 및 Dronpa의 photoswitching에 대한 매개 변수가 설정되면, 듀얼 프로브 광학 하이라이트는 다음 단계를 통해 이루어진다. 첫째, 낮은 전력 488 나노미터 여기로보기의 전체 분야에서 Dronpa 형광을 inactivate. 둘째, 관심과 높은 전력 488 나노미터 여기로 photoconvert의 mOrange2의 영역을 선택합니다. 마지막으로, Dronpa 형광을 활성화하기 위해 관심 영역을 선택합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 비말 샘플 준비.) 제대로 준비 비말 샘플. B) 샘플 코팅 현미경 슬라이드와 커버 유리없이 준비했습니다. C) 샘플 0.1 % BSA를 추가하지 않고 준비. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. mOrange2 단백질을 포함하는 mOrange2 photoconversion에 photoconversion 레이저 파워와 기간의 효력. 싱글 방울이 지속적으로 488 NM 레이저 파워의 다른 양의 사용 photoconverted되었습니다. photoconversion에 사용된 상대 레이저의 파워는 10 % (고체), 25 % (점선), 그리고 100 % (점선)되었습니다. A) 오렌지 형광 종. B) Photoconverted 적색 형광 종. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. mOrange2 및 Dronpa와 함께 듀얼 - 프로브 광학 강조. mitochondria에있는 핵 및 녹색 형광의 오렌지 형광을 보여주는 photoconversion 전에 mOrange2 - 히스톤 H2B 및 Dronpa - 미토을 표현) 세포. B) Dronpa 형광은 mOrange2의 최소한 photoconversion가 발생, 낮은 전력 488 나노미터 여기로 잠수를 탔다. C) mOrange2은 높은 전력 488 나노미터 여기로 적색으로 photoconverted되었습니다. D) Dronpa 형광 다시 800 nm의 2 광자 여기을 사용하여 전환되었습니다. 패널 차등 간섭 대비 이미지와 함께 형광 이미지를 오버레이합니다.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

정화 형광 단백질 비말 샘플 속도론 및 photoconversion의 속도론을 photobleaching 공부 예를 들어, 형광 단백질의 특성에 대한 photophysical 매우 편리한 샘플 형식입니다. 매우 작은 비말 볼륨 (~ 20 picoliter) photobleaching과 쿠베트 기반 시스템에서 수행하기 어려울 수 있습니다 photoconversion 실험, 용이하게합니다. 또한, 같은 비말 샘플이 이상적으로 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 현미경을 설정하는 ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

Photoconvertible 형광 단백질 (PC - 프레임)는 형광의 색깔이 특정 파장의 빛에 노출에 의해 변경될 수있다는 것을 의미한다 &quot;광학 형광펜&quot;기능이있는 형광 단백질의 클래스입니다. 광학 강조는 비침 투 형광 분자의 subpopulation의 마킹 수 있으며, 따라서 하나의 셀 또는 organelles를 추적하기위한 이상적입니다. 효율적인 photoconversion에 대한 중요 매개 변수는 강도와 photoconversion의 빛의 노출 시간입니다. 강도가 너무 낮으면 photoconversion 전혀 발생 느리거나되지 않습니다. 반면에, 너무 강렬하거나 너무 오래 노출이 단백질을 photobleach시키고 photoconversion의 효율성을 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜은 방법 PC - FP의 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 정제된 단백질 비말 샘플 준비를위한 절차를 설명합니다. 이 예제 형식은 현미경으로 형광 단백질의 photophysical 동작을 공부 매우 편리합니다. 둘째, 우리는 photoconversion에 대한 현미경을 구성하는 방법을 보여 단백질 비말 샘플을 사용합니다. 그리고 마지막으로, 우리는 mOrange2과 Dronpa와 함께 듀얼 프로브 광 하이라이트를 포함하여 살고 세포에 광학 하이라이트를 수행하는 방법을 보여줍니다.

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Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K 조회수.  Vanderbilt University. 이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.

비디오: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

연구

생물학

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...