달걀 캔들러를 사용하여 연필로 E14 또는 E15 배아 위의 공기 주머니 둘레를 추적하고 윤곽이 그려진 부분을 투명 테이프로 덮습니다. 구부러진 가위 또는 가는 가위를 사용하여 추적 영역 주위를 부드럽게 자릅니다. 배아막이나 혈관을 자르지 않도록 주의하십시오.
그런 다음 껍질의 상단 부분을 버립니다. 병아리 배아를 목을 베고 난 후, 차갑고 멸균 된 CMF 용액으로 10 센티미터 접시에 머리를 넣으십시오. 멸균 미세 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 피부를 벗겨내어 밑에 있는 경막을 드러냅니다.
뇌의 왼쪽과 오른쪽에 형성되는 두개골 뼈를 제거하십시오. 형성되는 두개골 뼈는 아직 뇌의 대부분을 덮지 않습니다. 가늘고 뾰족한 집게를 부드럽게 사용하여 뇌 중앙을 덮고 뇌막을 찢고 양쪽으로 껍질을 벗겨 뇌를 드러냅니다.
가늘게 구부러진 집게를 사용하여 뇌를 아래쪽 앞쪽에서 위로 떠서 구멍에서 부드럽게 빼냅니다. 뇌를 전뇌, 중뇌 또는 시신경과 소뇌의 세 가지 주요 부분으로 나눕니다. 미세한 집게를 사용하여 tecta에서 위에 놓인 pia mater를 제거하고 해부된 뇌 영역을 얼음 위의 작은 멸균 접시에 넣습니다.
뇌를 매립하고 자르려면 구부러진 집게로 시신경이나 전뇌 부위를 부드럽게 집어 들고 멸균 거즈에 살짝 두드려 여분의 액체를 제거합니다. 적절한 크기의 물체 주위에 알루미늄 호일을 형성하여 간단한 금형을 준비합니다. 여기서, 작은 직사각형 금속 진동 조직 슬라이서 블록이 물체로 사용됩니다.
멸균 이송 피펫을 사용하고 저융점 아가로스로 금형을 채웁니다. 뇌 부위를 빠르게 아가로스에 넣고 얼음 위에서 약 4-5분 동안 굳히십시오. 사파이어 나이프를 사용하여 진동하는 티슈 슬라이서의 섹션을 자릅니다.
멸균 주걱을 사용하여 트레이에서 슬라이스를 떠서 꺼냅니다. 주걱에서 섹션을 부드럽게 밀어내고 다른 멸균 주걱을 사용하여 멤브레인 삽입물에 밀어 넣습니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 세포 배양 인큐베이터의 멤브레인 삽입물에 뇌 절편의 6웰 플레이트를 놓습니다.
도금 다음 날, 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 삽입물 아래에서 배지를 흡입하고 멤브레인 삽입물 아래의 각 웰에 1밀리리터의 신선한 슬라이스 미디어를 추가합니다. 다음으로, GBM 세포를 뇌 절편에 도입하기 위해 5마이크로리터로 설정된 20마이크로리터 마이크로 피펫을 사용하여 배양 접시에서 1-여러 개의 스페로이드를 제거합니다. 스페로이드가 있는 배지를 원하는 뇌 절편으로 부드럽게 배출하고 스페로이드가 2-5일 동안 슬라이스에서 배양되도록 합니다.
배양 1주일 후 x 생체 광학 tectum 절편의 생존율 결과가 이 그림에 나와 있습니다. 비스벤지미드로 핵을 염색하고 라미닌으로 면역염색한 뇌 절편의 컨포칼 이미지는 다양한 구성으로 광학적으로 절편된 정상 혈관과 온전한 혈관을 명확하게 보여줍니다. 비스벤지미드로 SOX 2 전사 인자 및 총 핵에 대해 염색된 뇌 절편의 공초점 Z 스택의 최대 투영 이미지가 여기에 표시됩니다.
이러한 결과는 병아리 배아 뇌 절편이 약 2주 동안 막 삽입물에서 배양될 수 있고 정상적으로 보이는 혈관 및 전사 인자 발현으로 생존할 수 있음을 시사합니다.
