Quantifying the Endothelial Cell Network Formation After the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

기질 내피 세포 공동 배양을 확립한 후 정량화에 적합한 설정으로 형광 현미경을 사용하여 GFP huvec에서 GFP 신호를 획득합니다. 대비를 더욱 향상시키기 위해 같은 날에 획득한 모든 이미지를 사전 처리합니다. 피지 또는 이미지 J를 사용하는 경우 모든 향상된 GFP 채널 이미지를 동시에 열고 밝기 및 대비 메뉴를 엽니다.

중간 조건을 나타내는 이미지를 선택하고 자동을 선택하여 대비를 자동으로 조정합니다. 설정을 클릭하고 열려 있는 다른 모든 이미지에 전파를 선택합니다. 자동으로 선택된 범위가 현재 시점의 모든 이미지에 맞는지 여부를 시각적으로 평가합니다.

필요한 경우 범위를 수동으로 다시 조정하고 모든 이미지에 다시 전파하고 조정된 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 그런 다음 모든 이미지에 중간 흐림 필터를 적용합니다. 비닝을 통해 크기를 줄이고 정량화를 위해 폴더에 그레이 스케일 RGB 컬러 TIFF 파일로 저장합니다.

이 작업은 수동으로 또는 매크로를 사용하여 배치 모드로 수행할 수 있습니다. 이미지 J에 대한 혈관 신생 분석기에서 배치 프로세스 모드를 사용하여 생성된 모든 이미지를 분석한 다음 인식된 구조와 원본 이미지의 오버레이를 검사하여 정량화 결과를 검증합니다. 전처리 파라미터를 조정하거나, 원본 이미지를 재분석하거나, 알고리즘이 원본 이미지에 세포가 거의 또는 전혀 보이지 않는 인공 구조를 감지하는 경우 문제가 있는 영역을 제외합니다.

마지막으로, 각 샘플의 값에 분석 된 면적의 비율을 1 평방 밀리미터에 곱하여 얻은 값을 1 평방 밀리미터의 면적으로 정규화합니다. GFP huvec 네트워크의 정량화된 파라미터는 총 네트워크 길이가 FGF-2의 존재 하에서 가장 높았고 성장 인자의 부재 하에서 가장 낮았다는 것을 보여주었다. 네트워크에서 분기점을 나타내는 접합부의 수는 전체 길이와 동일한 추세를 따랐습니다.

반대로, 두 성장 인자 모두 고립된 세그먼트가 현저히 적어 성장 인자가 없는 상태보다 더 높은 상호 연결성을 나타냅니다.