이 프로토콜은 최초의 정점 아웃 인 어 디쉬 모델을 설명하며 경구 투여를 위한 잠재적 치료제의 시험관 내 모델링을 설정할 때 기저 측면 아웃 엔터로이드 인-어-디쉬 모델에 비해 중요한 개선입니다. 이 방법을 사용하면 엔터 로이드의 정점 표면에 접근 할 수 있습니다. 화합물은 세포 배지에 첨가 될 수 있으며 화합물은 생체 내에서와 같이 정점으로 흡수됩니다.
잠재적인 경구 치료제를 테스트하기 위해 장 염증의 시험관 내 시스템을 구축하는 데 관심이 있는 연구자는 이 기술이 특히 유용할 수 있습니다. 다른 연령과 종에서 유래 한 조직은 추가 표준화가 필요할 수 있습니다. 따라서 환자는 극성 반전 시간을 설정하는 동안 필요할 수 있습니다.
3D 엔터로이드의 극성을 반전시키기 위해 확립된 3D 기저측 아웃 엔테로이드의 24웰 플레이트의 각 웰에서 미디어를 흡입합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 5밀리몰 아이스 콜드, EDTA 또는 PBS를 추가하고 P 200 피펫으로 5-6회 위아래로 피펫팅하여 기저막 추출물 또는 세포외 기질 돔을 기계적으로 부드럽게 방해합니다. 4 개의 우물의 내용물을 15 밀리리터의 연대기 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 8 밀리리터의 얼음처럼 차가운 EDTA 슬래시 PBS를 튜브에 첨가하십시오. 나머지 20 개의 우물을 같은 방식으로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도에서 회전 플랫폼 또는 셰이커에서 330RPM으로 1시간 동안 배양합니다.
배양 후 튜브를 원심분리하고 각 튜브로부터 상청액을 버린다. 펠릿을 5 밀리리터의 DMEM F12로 결합하고 세척하십시오. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거한 후 튜브에 무항생제 배지 12ml를 추가하여 세포 펠릿이 재현탁되도록 합니다.
피펫 500 마이크로리터의 엔테로이드 현탁액을 24 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰 내로 넣는다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 2-5일 동안 또는 엔테로이드가 극성을 바꿀 때까지 배양합니다. 기권 첫날, 24 웰 플레이트의 4 웰의 내용물을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
별도의 튜브에서 각 처리와 함께 원하는 모든 웰에 대해 반복하십시오. 튜브를 원심 분리하고 실온에서 알데히드 정착액으로부터 4 %의 300 마이크로 리터로 펠릿을 재현 탁하십시오. 30분 후 펠렛을 500 마이크로리터의 PBS로 세척한다.
튜브에 0.1 % 트리톤 X 100 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 섭씨 2도에서 8도에서 15분 동안 200RPM의 회전 장치 또는 셰이커에 놓습니다.
마지막 배양 후 PBS T에 500 마이크로 리터의 10 % NDS를 추가하고 실온에서 45 분 동안 배양합니다. 배양 중에 1 차 항체 용액을 준비하십시오. 다음날 펠릿의 크기에 따라 튜브에 250-500 마이크로 리터의 PBS T를 추가하고 섭씨 2-8도에서 1 시간 동안 200RPM의 회전 장치 또는 셰이커에 놓습니다.
200 마이크로리터의 2차 항체 용액을 첨가하고 어둠 속에서 섭씨 2 내지 8도에서 튜브를 배양한다. 다음날, 튜브를 회전시키고 100 마이크로 리터의 상청액을 제거하여 염색 된 정점 엔터 로이드를 장착하십시오. 나머지 100 마이크로리터의 상청액에 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 500 마이크로리터 튜브로 옮깁니다.
미니 원심 분리기에서 튜브를 20 초 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하고 펠렛을 실온의 100 마이크로리터에 재현탁시켜 원적색 핵산 염색한다. 20분 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고, 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.
2차 세척 및 원심분리 후 70 마이크로리터의 상청액을 제거하고 펠렛을 PBS의 나머지 부피에 재현탁시킨다. 이어서 세포 현탁액을 표지된 24 x 60 밀리미터 커버 슬립으로 옮긴다. 75마이크로리터의 마운팅제를 시편에 직접 바르고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.
어둠 속에서 밤새 경화 한 후 커버 슬립에 글리세롤을 얇게 바르고 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 부드럽게 제자리에 누릅니다. 탭하여 커버 슬립과 슬라이드 사이의 거품을 제거합니다. 커버 슬립을 어둠 속에서 실온에서 2시간 동안 방치한 후 컨포칼 현미경으로 20배 배율로 엔테로이드를 이미징합니다.
장내 치료의 경우, 텍스트 원고에 설명 된대로 24 시간 동안 접시 모델에서 정점 괴사 성 장염을 확립하십시오. 분석을 수행하기 전에 각 웰에서 100 마이크로리터의 배지를 제거하여 나머지 400 마이크로리터를 남깁니다. 400 마이크로리터의 세포 생존율 분석 시약을 각 웰에 추가합니다.
내용물을 플레이트 쉐이커에서 200RPM에서 5분 동안 격렬하게 혼합하여 세포 용해를 유도합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터를 96 웰의 투명한 바닥 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 나머지 600 마이크로 리터에 대해 반복하여 웰 당 4 개의 기술 복제를 만듭니다.
발광이 가능한 플레이트 리더를 사용하여 0.25밀리초 적분에서 값을 기록하고 처리 간의 상대 값을 비교합니다. 대조군의 대표적인 면역형광 염색은 내강을 향한 핵의 정점 국소화와 상피의 바깥쪽 가장자리에서 악당의 검출을 확인했다. 대조군과 비교하여 리포 다당류, 종양 괴사 알파 또는 저산소증 단독에 노출된 것은 전체 세포 형태 E-카드헤린 또는 악당 국소화 또는 형광 강도의 명백한 변화를 유도하지 않았습니다.
저산소증과 함께 리포 다당류 또는 종양 괴사 알파로 치료하면 상피 구조가 파괴되고 ECA 청력 및 악당 염색의 손실로 밝혀진 부착 접합부 및 브러시 경계 단백질 발현의 상당한 손실이 입증되었습니다. 정점 세포 생존율은 정상 또는 저산소 조건 하에서 결정되었다. 정상 조건 하에서 대조군과 비교하여 리포폴리사카라이드 또는 종양 괴사 알파는 엔테로이드의 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않았다.
그러나, 저산소증 단독에 비해 저산소증과 함께 리포 다당류 또는 종양 괴사 알파에서 생존력의 현저한 감소가 관찰되었다. 정점 아웃 인 어 디쉬 모델을 설정하는 동안. EDTA를 세포 현탁액에 얼음처럼 차갑게 유지하는 것을 잊지 마십시오.
이렇게 하면 극성 반전이 향상되고 모든 ECM이 적절하게 액화 및 제거됩니다. QPCR, RNA-seq, 웨스턴 블로팅 또는 장벽 투과성의 기능적 평가와 같은 다른 다운스트림 애플리케이션을 추가로 수행하여 저산소증에서 염증 신호 전달에 대한 반응을 특성화할 수 있습니다.
