J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community&#8217;s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).

형질 시약 등의 폴리에틸렌 이민 (PEI) 1. 준비 <ol><li> H 2 O 100 ㎖에 PEI의 약 150 mg을 녹이고 </li><li> 솔루션은 분명해진다 완전히 용해 될 때까지 저어 때까지 염산을 첨가하여 pH를 7.4 솔루션을 조정합니다. 이것은 10 내지 60 분을 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 물을 첨가 할 수있다. </li><li> 때 분명, 5 ml의의 분량에 ° C의 냉동고에서 -80 멸균 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 PEI 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> 렌티 바이러스 입자 2. 생산 1 일 : <ol><li> 162cm 2 플라스크 또는 세포주 배양 배지에서 큰 페트리 접시 (10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민을 보충 보충 된 DMEM) 중 60 % -80 %의 컨 플루 분열 HEK293T 세포. </li></ol> 제 2 일 : <ol start="2"><li> 함께 추가하여 총 플라스미드 DNA의 45 μg의를 포함하는 DNA 형질 솔루션을 준비렌티 바이러스 포장 벡터 (7 pVSVg의 μg의; pRSV 레브의 5 μg의 13 pMDL의 μg의) 이해와 관심의 shRNA의 유전자를 코딩하는 렌티 바이러스 플라스미드의 20 μg의. DMEM을 사용하여 1 ml의 부피로 조정한다. </li><li> DMEM 930 ㎕의 1 ㎎ / ㎖ PEI의 90 μl를 첨가하여 형질 PEI 용액을 제조하고 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> PEI 솔루션 DNA 형질 솔루션을 추가합니다. 와동 번 반전 및 DNA 형질 감염을 첨가하여 실온에서 5 분 동안 배양하거나. </li><li> HEK293T 세포에 DNA 형질 감염 용액 2 ㎖ 드립 37 ° C에서 가습 된 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 배양한다. </li><li> 4 시간 후, PEI를 제거하기 위해 배지를 새로 고칩니다. 그것은 새로운 매체를 추가하기 전에 세포를 세척 할 필요가 없습니다. 참고 : 4 시간 이상 PEI가 세포 독성 및 배양 시간은 HEK293T 세포에 해를 일으킬 수 있습니다. </li></ol> 주 4 : <ol start="7"><li> 공중으로 교체새로운 문화 매체 rnatant. 뜨는 (바이러스 포함)을 유지; 이 단계 2.10에서 사용됩니다. </li><li> 15 ml의 플라스크에 뜨는을 넣습니다. 500 x g에서 5 분 동안 죽은 세포, 원심 분리기를 제거하십시오. </li><li> 큰 60 ML의 주사기를 사용하여 0.45 μm의 필터를 통해 뜨는을 밀어 넣습니다. 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다. </li></ol> 제 5 일 : <ol start="10"><li> 상층 액의 두 번째 배치를 수집; 단계 2.8-2.9에서와 같이 원심 분리기 및 필터. </li><li> 90 분 동안 초 원심 분리기에서 50,000 XG에서 단계 2.9 초 원심 분리기 튜브 2.10 원심 분리기에서 상층 액을 풀. </li><li> 매우 신중 초 원심 튜브를 함유하는 캡슐을 꺼내어 원심 튜브의 내측 방향을 기억하고, 층류 후드에 넣고. </li><li> 펠릿은 관의 상측에 이도록 신중 방식으로 초 원심 분리기 튜브 캔트 매체 유지 열기 캡슐. 바이러스 성 펠렛을 시각화하기 어려울 수 있기 때문에,에 무엇을 기억튜브의 측면은 펠릿 형성됩니다. 마이크로 피펫을 타고 초원 심 분리기 튜브의 바닥의 측면에 볼 수있는 불투명 한 갈색 펠렛을 선동하지 않도록주의하면서 매체의 마지막 비트를 제거합니다. </li><li> 10 mM의 니코 티나 마이드, 10 Chir99021 μM, 10 μM Y27632 8 ㎍ / ㎖의 폴리 브렌이 보충 된 organoid 배양액 500 μL이 펠렛을 재현 탁. 높은 역가의 바이러스가 직접 organoids를 transduct하는 데 사용되기 때문에이 매체의 재 부상은 중요하다. </li><li> 선택적 : -80 ° C에서 250 μL의 두 일괄 적으로 분주이 매체에 바이러스를 동결. </li></ol> Organoids 3. 렌티 바이러스 형질 도입 일 0 : <ol><li> 약 50 작은 organoids를 획득하는 것을 목표로, 새로운 우물에 전달 이틀 전에 organoids의 전체 0.95 cm이 잘 분할합니다. 이전에 발행 된 프로토콜 1 (그림 3A, B)에 따라 organoids 분할합니다. </li><li> 낭성 하이퍼 증식 소낭 (도 3c)을 얻었다 Chir99021 10 μM 및 10 mM의 니코 티나 배지를 organoid 보완. 참고 : 갓 분할 organoids가 Chir99021의 존재에서 재배되는 경우 낭성 납골당 가장 개발할 것입니다. </li></ol> 제 2 일 : <ol start="3"><li> 이에 P1000 마이크로 피펫으로 혼합물을 방해, 피펫 팅 및 마트 리겔 중간 아래로 수확 organoids. 15 ML 튜브의 혼합물을 놓습니다. </li><li> 원위 개구부가 용융하여 감소되어있는 파스퇴르 피펫을 이용하여 상기 방해. 원심 분리기 organoids는 100 × g에서 5 분 동안 펠렛. 참고 : 원심 분리기의 크기에 따라 다름, 다른 원심 분리 속도를 사용합니다. 그것은 organoids이 혼합물로부터 분리 파괴되는 정확한 속도를 찾는 것이 필요하다. </li><li> 상층 액을 제거하고 (0.25 % 트립신 유사) 미리 예열 1X 트립신의 500 μl를 추가합니다. 트립신에 organoids를 재현 탁하고 배양37 ° C의 물을 욕조에 3 분. </li><li> 세포주 배양 배지 3.5 ml를 첨가함으로써 트립신을 불 활성화 (DMEM은 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 글루타민). 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 매체의 약 20 μL에 펠렛을 떠나 뜨는을 제거합니다. 48 웰 플레이트에 잘으로 매체의이 마지막 소량 organoids을 전송합니다. </li><li> 단계 2.14, 재현 탁에 설명 및 3.10 단계로 계속 전달 매체에 높은 역가의 렌티 바이러스를 추가합니다. 낮은 전달 효율을 만나면, 3.9 단계를 첨가 할 수있다. 참고 : 효율적인 전달을 위해, 일반적으로 organoids 잘 하나에 높은 역가의 렌티 바이러스의 250 μL 중 하나 나누어지는을 추가합니다. 이 프로토콜의 단계 2에서 기재 한 바와 같이 한 번의 생산에서 수집 된 모든 렌티 바이러스의 50 %를 나타낸다. </li><li> 선택적 : (32)에 미리 예열 원심 분리기에서 48 웰 플레이트 포함 organoids를 넣어 spinoculation를 수행 전달 효과를 향상시키기 위해6; C와 1 시간 동안 600 XG에서 회전합니다. </li><li> 문화 인큐베이터에서 organoid 바이러스 혼합물을 넣고 전달을 할 수 있도록 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 선택적 : 추가로, 전달 효율을 향상 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 추가 3 시간 동안 organoids을 배양합니다. </li><li> organoids 펠릿 850 XG에서 5 분 동안의 microcentrifuge에 microcentrifuge 관과 원심 분리기로 전송, organoid 문화 매체의 1 ML을 추가하고 organoid 바이러스 혼합물을 재현 탁. </li><li> 상층 액을 제거하고 얼음처럼 차가운 리겔의 20 μL에 펠렛을 재현 탁. 이 따뜻한 될 때 물질이 굳어 있기 때문에, 여러 번에 대한 차가운 PBS로 pipetting에 의해 얼음 아래로 냉각되는 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 48 웰 플레이트에서 웰의 중앙에 방울을 넣어 고화 15 분 동안 37 ℃ 배양기에서 배양한다. </li><li> 15 분 후, 조심스럽게 organoid 보충 된 배양 배지 250 μl를 추가10 MM의 니코틴, 10 μM C​​hir99021 10 μM Y27632. 작은 혼란 organoid 조각은 24 시간 내에 작은 낭포 성 organoids에 형성 할 것이다. </li></ol> 제 5 일 : <ol start="16"><li> 매체 리프레쉬 선택 항생제 보충 (퓨로 마이신에 대해, 4 ㎍ / ㎖의 사용). </li></ol> 7 일 : <ol start="17"><li> 선택 항생제로 보충 표준 organoid 문화 매체에 대한 매체를 교체합니다. 참고 : 신진는 Chir99021 탈퇴 후 2-3주 완료됩니다. 선택 후, organoids는 선택 항생제없이 재배 할 수있다. </li></ol> 정량적 RT-PCR이나 마이크로 어레이 4. Organoid RNA 준비 <ol><li> RNA 준비 기간은 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용합니다. organoids에서 매체를 제거하고 직선 리겔 포함 organoids의 돔에 β-머 캅토 에탄올로 보충 버퍼 RLT 350 μl를 추가. materi를 재현 탁P1000의 마이크로 피펫을 사용하여 피펫 팅 RLT에 알. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 더 RNA 준비를 수행합니다. </li><li> 선택적 : 제조자의 프로토콜에 따라 50 μg의 총 RNA의 초기 입력을 요구 박수 피코 WTA 시스템을 이용하여 증폭 RNA 수율을 증가시킨다. </li><li> 선택적 : RNA 마이크로 어레이에 앞서 품질 관리, 제조 업체의 프로토콜에 따라 8.5 이상 (그림 5)의 RNA 무결성 번호 (RIN)을 목표로, 진핵 생물의 총 RNA 나노 칩을 사용하여 2100 bioanalyzer에 실행 샘플. </li></ol> 파라핀 퍼가기 및 면역 5. 처리 Organoids <ol><li> 이전 매립 organoid 개시 파라핀 액을 유지하는 70 ° C에서 구멍 인큐베이터 피팅 12mm 직경 유리관 알루미늄 블록을 미리 가온. </li><li> 그대로 포함 된 organoids를 떠나, 자란 organoids와 함께 하나의 잘을 가지고 매체를 제거합니다. </li><li> 1 ML을 추가4 % PBS에서 파라 포름 알데히드 직선에 잘 그리고 1 시간 어디서나 4 ° C에서 하룻밤을 수정합니다. </li><li> 얼음 차가운 PBS 1 ml로 파라 포름 알데히드를 교체합니다. 선택적 :이 단계 이후 4 ° C에서 1 주일까지 PBS에서 해결 organoids을 유지합니다. </li><li> PBS 1 ml의 고정 organoids를 재현 탁 유리 병에 넣습니다. </li><li> , organoids 1 분 동안 바닥에 침몰하자 PBS를 가만히 따르다 및 에오신 솔루션의 방울의 부부 매입 과정에서 organoids의 시각화를 가능하게 용해 된 70 % 에탄올로 대체합니다. </li><li> 실온에서 70 % 에탄올에 organoids를 남겨주세요. 30 분 후, 조심스럽게 때문에 약간 분홍빛이 도는 에오신 색의 눈으로 organoids를 시각화 할 수있는, 경사 70 % 에탄올을 제거합니다. 96 % 에탄올로 포함 솔루션을 교체합니다. </li><li> 단계를 반복 5.7, 다음 중 하나에 포함 솔루션을 교체 할 때마다. 70 % 에탄올, 90 % 에탄올, 96 % 에탄올, 100 % etha :이어서 다음의 솔루션을 통해 organoids 합격NOL, 100 % 에탄올, 크실렌, 크실렌. </li><li> 마지막 크실렌 세척을 가만히 따르다 및 튜브에 파라핀을 붓는다. 30 분 동안 70 ° C에서 미리 예열 알루미늄 블록에 즉시 튜브를 넣고 새로운 깨끗한 파라핀 파라핀을 교체합니다. </li><li> 큰 개방​​과 미리 예열 파스퇴르 피펫을 사용하여 파라핀 블록 금형에 오프 파라핀과 피펫 organoids을 붓고. 분젠 버너를 사용 파스퇴르 피펫을 따뜻하게 유지. 액체 파라핀의 작은 층에 파라핀 블록 금형의 모든 organoids를 놓습니다. </li><li> 가능한 많이, 가온 해부 바늘을 사용 파라핀 블록 금형의 중심을 향해 모든 organoids를 조작하려고. 분젠 버너를 사용 해부 바늘을 따뜻하게 유지. </li><li> 몰드 organoids의 지역화 양호한 경우에, 저온 금형 약간 파라핀 층 고화. </li><li> 상단에 더 파라핀을 부어 블록을 완료하고 표준 조직 학적 삽입 카세트를 추가합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents.">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin1,+a+novel+intestinotrophic+mitogen,+ameliorates+experimental+colitis+in+mice.">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids.">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis.">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li><li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer.">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

현재 비디오 기본 프로토콜은 장내 상피 및 정량 RNA 기술을 사용하여 면역 조직 화학 법 및 이들의 하류 organoids 분석 organoids의 렌티 바이러스 형질 도입을 설명한다. 렌티 바이러스 형질 도입은 종종 배양 플레이트에 부착 또는 부동 세포에서 수행된다. organoids의 입체 구조가 바이러스 입자가 침투하기 어려워 렌더링 그들을 이후 효능을 증가시키는 다수의 방법이 사용된다....

장 상피 세포는 암 줄기 세포에 대한 연구에서 폭 넓은 관심을 끌기가 발생했습니다 가장 빠르게 증식하는 신체 조직 중 하나입니다. 2009 년 기술은 3 차원 구조 (1)을 보존, 리겔에 소장 지하실의 오래 지속 문화를 생성하기 위해 출판되었다. 이러한 구조는, 장 organoids는 매체 BMP-시그널링 경로 저해제 소량 (노그)을 포함하여 정의 된 성장 인자의 수와 보충 둘러싼, 표준 기술을 사용하여 배양 할 수있다라고하고 1 (Rspo1)를 rspondin이 Wnt 신호 전달 경로 인핸서 및 표피 성장 인자 (EGF)는 모든 증식 2-4 장을 향상 알았다. Organoids는 줄기 세포 계층을 유지하고, 그들이 비 - 돌연변이 된 것을 특징 전통적인 암 세포주를 능가 INT 작은 초기에있는 모든 세포 계통 세포 내로 그대로 편광 전시 분화를 표시estinal 상피. 그들은 유전자를 운반하는 형질 도입 될 수 있거나 간섭 RNA 5 구축 때문에, 비용과 속도 측면에서 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 실험을 능가 특정 유전 적 요소를 연구하는 데 사용된다. organoids 형질 전환 발현은 뮤린 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터 -6,7- 하나를 사용하여 수행 될 수있다. 유사 분열 세포에 독점적으로 인해 8 열 변환 가능한 뮤린 레트로 바이러스의 제한, 렌티 바이러스 형질 도입 더 흔히 organoids 같은 감염하기 어려운 세포를 위해 사용된다. 바이러스로 형질 도입하고 안정적​​으로 발현하는 형질 전환 organoids 분석 및 면역 정량 RNA를 포함하여, 하류의 분석 다수 사용할 수있다. 이와 함께, 주 장내 상피 세포에서 organoids의 문화는 특정 실험실 요구 사항없이 구현하기 쉬운 일상적인 기술로 진화하고 있으며, 가전의 새로운 표준이되었습니다장 상피 세포에 대한 연구에서 LL 문화. 바이러스 성 전달 및 organoids 후속 다운 스트림 분석 기술은 수행과 우리가 배양 organoids의 렌티 바이러스 전달하는 방법을 보여주는,이 비디오 프로토콜을 생성 organoid 실험을 돕기 위해 지루한. 우리는 또한 수율을 증가 때문에 RNA 기술 또는 면역 조직 화학 염색을 이용하여 다운 스트림 분석의 성능을 향상시킬 수있는 방법을 올바른 처리 organoids의 보여줍니다. 설명 된 기술들은 또한 결장 organoids에 적용 할 수 있지만, 프로토콜, 소장 지하실에서 유래 organoids 독점적으로 사용 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Reagent</td>
			<td style="width:91px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Polyethylene imine</td>
			<td style="width:91px;">polysciences</td>
			<td style="width:103px;">23966-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">BE12-614F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Glutamin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">25030-024</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">matrigel</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">BD 356231</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Advanced DMEM-F12</td>
			<td style="width:91px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N2</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">B27</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-1G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Egf</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8045</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glutamax 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir 99021</td>
			<td>axon</td>
			<td>1386</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107689</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-007E</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">puromycin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P 7255</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8,057,400,250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ovation Pico WTA system</td>
			<td>NuGen</td>
			<td>3300-12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass vial conical 12mm x 75mm 5ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LSUKM12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin Yellowish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,159,350,025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Organoid 렌티 바이러스 전달 렌티 바이러스 입자를 사용 organoid 전달의 기술 이전 및 전달시 organoids의 올바른 취급에 따라 달라집니다. Organoids (도 3A) 배양했다가 단일 소낭 (도 3B)으로 파쇄 하였다. 이전에보고 된 바와 같이, GSK3 억제제 Chir99021의 존재 하에서 배양 한 이들 소낭은 낭성 지하실 9 (도 3c)을되었다. 이어서 organoi...

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A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.2K 조회수.  Academical Medical Center. In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Murine Intestinal Crypts 및 Single Stem Cell의 오가노이드 3D 배양

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

저자 스포트라이트: The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (오가노이드 연구를 위한 쥐 장낭화낭수에서 오가노이드의 3D 배양 및 단일 줄기 세포)  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...