편광에 민감한 이광자 현미경 시스템을 구축하고 정렬한 후 표시된 회로도 표현에 따라 비정질 폴리머에 구현된 플루오레세인과 같은 등방성 참조 샘플로 광학 정렬 품질을 테스트합니다. 이렇게 하려면 여기 레이저를 켜고 제로 반파장 플레이트에 대한 참조 샘플의 360도 극좌표 그래프를 측정합니다. 샘플 평면의 X축과 Y축에 대응하도록 반파장 플레이트 각도를 조정하고, 두 광 다이오드가 두 광자 여기 방출 성분의 유사한 강도를 수집하는지 확인합니다.
샘플을 분석하려면 이 구형 시편이 있는 유리 슬라이드를 압전 스테이지에 장착하고 커버 슬립이 포함된 슬라이드의 면이 높은 개구수 이멀젼 대물렌즈를 향하도록 합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 테이프로 고정합니다. 다음으로, 현미경 손잡이를 사용하여 X, Y 및 Z 위치를 조정하여 용액의 구형석에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.
특히 전체 구조의 중앙 영역에 초점을 맞추십시오., 구형 직경은 일반적으로 수십 미크론 범위에 있기 때문입니다. 그런 다음 이 구형석을 현미경 평면의 시야 중앙에 맞춥니다. 전체 구조물의 영역을 커버하도록 X 및 Y 방향의 피에조 스테이지 단계 수를 조정하여 XY 스캔의 크기를 결정합니다.
스캔 속도, 단계 크기 및 범위와 같은 Piezo Stage 매개변수를 조정하여 전체 구형석 영역을 덮습니다. 셔터를 열고, 포토다이오드를 켜고, X축과 Y축에 해당하는 여기 빔에 대해 선택한 스캐닝 영역의 모든 단일 단계에 대해 이광자 여기 형광 강도의 X 및 Y 방출 성분을 수집합니다. 그런 다음 이 구형 샘플을 스캔하여 이광자 여기 형광을 생성합니다.
샘플의 특정 지점에서 전체 편광 분석을 수행하려면 여기 빔을 끄십시오. 서브미크론 분해능으로 분자의 방향에 대한 정보가 필요한 이 구형석에서 선택한 위치에 해당하는 Piezo Stage의 특정 좌표를 취합니다. Piezoelectric Stage를 조정하여 시야를 표시된 X 및 Y 좌표의 중앙에 맞춥니다.
여기 빔을 켠 후 반파장 플레이트의 180도 회전을 켜서 이광자 여기 형광 방출의 X 및 Y 방출 성분에 대한 전체 360도 편광 분석을 수행합니다. 2PFM 래스터 스캔을 수행한 후 얻은 인슐린 구형석의 이미지는 구형석에 대해 보고된 것과 일치했습니다. X축과 Y축을 따라 샘플의 여기(excitation)에 해당하는 반파장판의 위치도 확인되었습니다.
극좌표 그래프는 선택한 다른 지점에서 전체 편광 분석을 수행하는 동안 변경되었습니다. 구형석 밖에서 PLO 그래프는 아티팩트와 무작위 신호 노이즈 스파이크의 모음처럼 보였습니다. X축과 Y축을 따라 고도로 정렬된 위치에서 적절하게 측정된 거짓말 탐지기는 형광단의 국소 방향과 조직에 따라 모양과 형상이 달랐습니다.
