멕과 빅토리아 정부 (VESKI 혁신 동지,이 작품에 대한 자금 지원은 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (WEHI에 독립적 인 연구소 인프라 지원 계​​획은 [IRIISS] 부여 멕과 MJC에 NHMRC 프로젝트 보​​조금 1,011,352)에 의해 제공된다; WEHI에 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원). 멕는 호주 연구 협의회의 엘리자베스 2 세 여왕 동지이다. EFXB는 멜버른 대학에서 노마 힐다 슈스터 장학금 프로그램의 지원을 인정합니다.

1. 복제 및 구조 설계 HindIII와 BamHI 제한 사이트를 (그림 1 참조)를 사용하여 pMM-펩타이드 벡터 (이 요청시 제공 될 수 있습니다)에 관심 시퀀스를 복제. 이중 좌초 된 DNA의 삽입은 다음과 같은 순서로, 통합해야 HindIII 사이트, CNBr의 절단에 대한 단일 메티오닌 코돈, E.를 순서를 코딩 대장균 코돈 최적화 된 펩타이드, 정지 코돈, BamHI 사이트입니다. 펩타이드의 다른 모든 methionines는 제거해야하고 또한 산성 조건에서 흘리고 될 것 같은 dipeptide 순서 ASP-PRO는 피해야한다. 독특한 시스테인 잔류 물은 최종 단지에 이황화 crosslink의 원하는 위치에 따라 각 펩타이드 순서로 소개하고, 다른 모든 cysteine​​s는 세린에게 변형해야합니다. 플라스미드은 선택 kanamycin 저항 카세트를 수행합니다. 2. trpLE - pepti의 표현드 퓨전 <ol><li> (0.1 MM CaCl 2, 2 MM MgSO 4, 3g / L KH 2 PO 4, 7.5 g / L 오세영 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 g / L NaCl, 화장 및 살균 필터 M9/Kan 최소한의 성장 매체 1g / L NH 4 CIA 같으니, 4 G / L 포도당, 50 MG / L kanamycin 황산). 불용성 물질과 살균 필터 오렌지 표면에 뜨는을 제거하려면 30 분, 원심 분리기에 대한 혼합 40 ML H 2 O에 1 타블렛을 분해 :.와 Centrum은 완전한 B-비타민과 추적 금속을 제공하는 아연을 보충 최대 2 주와 M9 4 ML / L를 사용하는을위한 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 재고 솔루션입니다. 참고 : 원하는 경우 15 N 강화 NH 4 CIA 같으니, 13 C-농축 포도당 또는 기타 안정적-동위 원소 - 라벨 전구체이 단계에서 M9 매체에 포함 할 수 있습니다. </li><li> 갓 변형 BL21 (DE3) 변형 E.에서 100 ML 스타터 문화의 예방 M9/Kan 매체에서 대장균. 200 rpm으로 흔들어와 37 ° C에서 하루 아침에 성장. </li><li> 다음날 아침, 스타터 문화의 OD 600 확인 -이 2 이상의 범위에 있어야합니다. Centrum은 - 보충 M9 매체의 1 L 총 볼륨에 100 ML 스타터 문화를 희석. , 2 L 당황 플라스크 (각 플라스크 500 ML 문화)로 분할하고 37 성장 ° C OD 600 0.6에 도달 할 때까지 140 rpm으로 흔들어. </li><li> 18 흔드는 온도를 설정 ° C와 문화가 유도되기 전에 완전히 냉각 할 수 있도록 1 시간에 떨고 계속 진행합니다. </li><li> (OD 600 = 1의 문화에서 50 μl의 이에 상응하는 금액)의 SDS-PAGE 분석을위한 사전 유도 샘플을 채취 한 후, trpLE - 펩타이드 융합의 표현을 유도하기 위해 0.1 mm까지 최종 농도에 IPTG 추가 할 수 있습니다. 18 ° IPTG 유도에 따라 하루 아침에 C/140 RPM (16-20 시간)로 성장하고 계속합니다. </li></ol> 3. 포함 바디 준비 및 니켈 매트릭스 바인딩 <ol><li> 최소한의 중간에서 하룻밤 표현 문화의 최종 OD 600 변수와 우입니다uld 2.5 및 5.0 사이. SDS-PAGE 분석을 위해 샘플을 채취 (OD 600 = 1의 문화에서 50 μl의 이에 상응하는 금액) 5,000 X g에서 20 분을 위해 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> Resuspend 세포 펠렛 50 ML의 용해 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL 산도 7.5, 20 MM β-ME, 0.2 M NaCl) 1 L 문화에서. 세포 현탁액은 나중에 처리하기 위해 냉동 보관하실 수 있습니다. </li><li> 5 분을위한 얼음 1 분과 휴식을위한 최대 출력에서​​ 얼음에 sonication으로 세포를 Lyse. 우리는 ½ 인치 높은 강도 교체 팁과 Misonix의 Sonicator 3000 (최대 출력 600w)을 사용합니다. sonication / 3주기위한 냉각을 반복합니다. </li><li> 20,000 XG 15 분 동안 원심 분리하여 불용성 포함 본체 (IB) 자료를 수집하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 가벼운 색의 세포 파편의 느슨한, 얇은 층은 울창한 IB 펠릿의 상단에 표시 될 수 있으며,이 방법은 부드러운 교반과 물이나 버퍼를 사용하여 씻겨 할 수 있습니다. 단계 3.3 및 3.4은 IB 분율의 순도를 향상시키기 위해 반복 될 수 있습니다 경우 desi붉은 색. 펠렛 및 표면에 뜨는 물질의 샘플이 포함 기관에 trpLE-TM 퓨전 현지화를 확인 SDS-PAGE 분석에주의해야한다. </li><li> 처리 문화의 리터 당 25-50 ML을 사용하여, 구아니딘 솔루션 (6 M 구아니딘 HCL, 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 200 MM NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 5 MM β-ME)에 IB 알약을 분해. 이 단계는 교반 및 비정기 온화한 sonication과 함께 몇 시간을 필요로합니다. </li><li> 75,000-100,000 XG에서 1 시간 20 ° C.에 대해 원심 분리하여 IB lysate를 삭제합니다 0.2 μm 막 통해 표면에 뜨는 및 필터를 가만히 따르다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 삭제 IB lysate, 또는 물과 구아니딘 솔루션에 equilibrated로 세척 된 니켈 친화 수지와 함께 안전하게 폐쇄 할 수있는 큰 그릇이 조화를 이루고 있습니다. trpLE - DAP12TM는 (그림 3, 차선 2) 여기에 표시된대로 비슷한 정도 표현 fusions을 위해 처리 문화의 리터 당 3-4 ML 해결 수지를 사용하십시오. 객실 t에서 밤새 잠복기에 의해 배치 바인드<html> 부드러운 혼합과 emperature. </li></ol> 4. 온 열 산화에 Crosslinking <ol><li> 전체 볼륨을 통해 유동 될 때까지 지속적으로 추가, 다공질 베드 지원 빈 중력 흐름 열에 IB의 lysate / 니켈 수지 정지를로드합니다. 수집하고 여전히 언 바운드 융합 단백질을 포함 할 수 있습니다 flowthrough을 따로 넣어. </li><li> β-ME 5 MM를 포함하는 우레아 용액의 5 침대 볼륨 (8 M의 우레아, 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 200 MM NaCl)과 중력 흐름에 의해 니켈 수지를 씻으십시오. </li><li> β-ME없이 우레아 용액의 5 침대 볼륨으로 다시 니켈 수지를 씻으십시오. </li><li> 20 μM CuSO 4, 글루타티온을 산화 두 음을 보충 된 우레아 용액의 5 침대 볼륨과 니켈 수지에게 세 번 씻으십시오. 이 세척 후, 열 배출구를 닫고 최대 이황화 결합 형성을 허용하도록 실온에서 30 분을 품다. </li></ol> 5. TFA의 용출 및 Quantitation 내용은 &quot;&gt;주의 : Trifluoroacetic 산 (TFA)은 피부와 가스와 접촉에 심각한 화상을 원인은 매우 자극 아르 집중 TFA는 눈 보호와 비 라텍스 장갑과 승인 된 화학 물질 퓸 배출 후드에만 사용되어야합니다 모든 화학 호환성을 확인하십시오.. 자료는 사용, 폴리 프로필렌은이 프로토콜의 모든 단계와 호환됩니다. <ol><li> 물 10 침대 볼륨으로 산화 우레아 용액을 깨끗이 씻어 열 콘센트에 진공 라인을 적용하여 열 침대를 건조. </li><li> 열 배출구를 닫고 단정 (99~100%) TFA의 1.5 침대 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 산에도 노출을 보장하고 5 분에 품다 할 수있는 작은 주걱으로 니켈 수지를 젓는다. 열 배출구를 열고 액체를 모두 밀어 필요한 경우 주사기 또는 압축 공기 라인 부드럽게 pressurizing, 산성 eluate를 수집합니다. </li><li> 깔끔한 TFA의 또 다른 1.5 침대 볼륨있는 산 용출 단계를 반복합니다. beade의 완전한 해체를 방지하기 위해이 단계에서 빠르게 작업D 아가로 오스 행렬. 단백질 수율은 맥주 램버트 방정식과 trpLE - 펩타이드 시퀀스의 이론적 몰 흡광 계수에 따라이 시점에서 결정될 수있다. trifluoroethanol의 TFA의 eluate (1시 20분에서 1시 50분까지) (TFE)의 샘플을 희석하고 빈과 같은 희석에 TFA / TFE를 사용하여, 280 nm의에서 흡광도를 측정합니다. </li></ol> 6. CNBr의 소화 주의 : 시안 브로마이드 (CNBr)는 매우 독성 만 승인 된 화학 물질 퓸 배출 후드에서 처리해야합니다. 안전 안경, 실험실 코트와 비 라텍스 장갑 등의 보호구가 절대적으로 필요합니다. CNBr는 습기에 반응하고 열기 전에 실내 온도에 가져해야합니다. 중화 / CNBr 오염 된 솔루션 및 자료의 폐기 방법에 대한 안내는 기관의 안전 사무소에 문의하십시오. <ol><li> 부드럽게 혼합하면서 물 dropwise 추가하여 80% 최종 TFA 농도에 산 eluate을 희석. 석출물 형태의 경우DD는 다시 단정 TFA의 작은 볼륨 (0.5-1 ML) 솔루션은 물 80 % 재 올바른 다음, 분명히까지. 액체 질소에 동결 즉시 샘플을 lyophilizing, SDS-PAGE 분석을위한 5 μl 미리 알림 견본을보세요. </li><li> 폐쇄, 사전 무게 튜브에 안전하게 독성 화학 물질을 체중 돌봐 또는 화학 퓸 후드 내부의 균형을 사용하여 약 0.2 g / ML에 CNBr 크리스탈을 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 섞는다. 플러시와 불활성 가스 (질소 또는 아르곤 스트림)에서 반응 용기를 밀봉하여 빛으로부터 보호, 실온에서 3-4 시간을 품다. </li><li> SDS-PAGE 분석을위한 5 μl 후 다이제스트 샘플을 가지고 고정 즉시 lyophilize. 예상 펩타이드 단지의 크기에 따라 3.5 kDa 이하의 분자량의 컷오프와 재생 셀룰로오스 투석 카세트 나 튜브 (셀룰로스 아세테이트이 집중 산성에 용해 됨)로 요약 반응을 전송합니다. 에 물 4 L로 하루 아침에 Dialyze화학 연기 후드는 TFA 농도를 감소하고 unreacted CNBr을 분해합니다. 야간 투석시 볼륨이 크게 증가 (만큼 3 배 두에로)에 대한 투석 카세트 나 튜브의 방을 둡니다. </li><li> 투석 카세트 나 튜브 (단백질의 대부분은 TFA 농도가 감소 할 때 침전 됨)에서 일시 중지 침전물과 dialyzed 반응 용액을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 정지 전송합니다. 고정 물과 CNBr / TFA의 흔적을 제거하는 lyophilize. 이 단계는 몇 일이 필요 할 가능성이 있습니다. 주의 : dialyzed 알림 반응과 투석 물을 모두 독성 및 적절한 예방 조치와 함께 처리 / 처리 된 것으로 간주 계속해야합니다. </li><li> 사전 유도하고 수확 단계, 포함 몸 표면에 뜨는 및 펠렛, TFA의 eluate 및 CNBr - 소화 물질의 문화의 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분석 될 수있다. 95 가열하여 샘플을 준비 Invitrogen NuPAGE LDS sampl에 ° C전자 버퍼. TFA의 eluate 및 다이제스트 샘플은 산화 crosslinking의 제품 식별 및 평가를 촉진하기 줄이고 비 절감 두 조건에서 준비되어야한다. </li><li> 가장 작은 다이제스트 제품의 최적 해상도 MES-SDS 실행 버퍼를 사용하여 12% NuPAGE 비스 - 트리스 사전 주조 아크릴 아미드 젤의 샘플을 분리합니다. </li></ol> 7. 이황화 - 가교 펩타이드 복합 단지의 반전 상 HPLC 정화 <ol><li> 예비 규모로 2-3 ML 단정 개미의 산성, 부하 (21.2 X 150mm)에 동결 건조 된 다이제스트 제품의 100 밀리그램까지 분해 애질런트 ZORBAX SB-300 용매의 C3 PrepHT 열 A (일반적으로 10~20%의 아세토 니트릴 5 0.1 % TFA와 물에 이소프로판올 -10 %). </li><li> 적어도 5 열 권 이상의 용매 B의 기울기 (0.1 % TFA로 아세토 니트릴 또는 이소프로판올)에 요약 제품을 Elute. 다른 펩타이드 시퀀스에 대한 최적의 기울기 조건의 선택에 대한 제안 토론을 참조하십시오. </li><li> 보세요SDS-PAGE 분석 및 동결 즉시 lyophilize 각 HPLC 분율 50-100 μl 샘플. HPLC의 용매의 제거는 빠른 것입니다 1-2 시간에 완료해야합니다. </li><li> 더 환원제와 Invitrogen NuPAGE LDS 샘플 버퍼에 95 ° C로 가열하여 SDS-PAGE에 동결 건조 된 HPLC 샘플을 준비합니다. 시원하고 그들과 다시 난방 간단히 중 하나에 100 밀리미터 DTT를 추가 균등이 microcentrifuge 튜브에 각각의 샘플을 분할. </li><li> MES-SDS는 위의 버퍼를 실행과 12% NuPAGE 비스 - 트리스 사전 주조 아크릴 아미드 젤의 감소와 비 감소 HPLC 샘플을 분리합니다. 소형, 소수성 펩티드는 종종 Coomassie 잘 얼룩 차지하지 않고 예상 분자량에서 실행되지 않을 수 있습니다. 그러나, 감소 및 비 감소 시료의 비교 가교 펩타이드 제품과 순도 평가의 식별을 용이하게한다. </li><li> 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 시간의 비행 (든-TO하여 후보 펩타이드 함유 분수를 분석F) 질량 분석법은 (토론 참조) 관심있는 종을 확인하고 예상 질량을 확인합니다. </li><li> , 결합 순수, 가교 TM 펩타이드 단지를 포함하는 HPLC의 분수를 고정하고 lyophilize 및 수율을 결정하는 최종 제품의 건조 중량을. 높은 이소프로판올 콘텐츠와 분수는 냉동 상태로 유지되지 않을 수 있습니다. 펩타이드 분수 오히려 보송 보송 한 동결 건조 제품보다 필름으로 건조하면, 순수 hexafluoroisopropanol (HFIP)의 작은 볼륨에서 완전히 필름을 다시 분해 정지 한 후 다시 lyophilize. HFIP - 처리 제품은 쉽게 나올 팁과 무거워 작은 흰색 콘해야합니다. </li></ol>

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제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

trpLE-TM fusions의 표현이 있습니다. 우리의 경험에서 trpLE-TM fusions이 저조한 37 ° C에서 풍부한 문화 매체에 표현되며, 여기에 설명 된 문화 조건 수율이 범위를 1-4 TM 도메인에서 포함 된 다양한 시퀀스에 대해 성공적으로 증명 50에서 150 밀리그램 / 순수 그대로 융합의 L. Fusions 인코딩은 세 또는 네 TM GPCR 조각 (인간의 CCR5 각각 TM1-TM3 및 TM4-TM7), 또는 인간의 신호 펩티드 peptidase (4 TM 도메인, 심판 ...

이 프로토콜은 세부 사항 우리가 솔루션 NMR을 사용하여 구조 연구 이황화 - 안정화 transmembrane의 단지 (TM) 펩티드를 생성하기 위해 개발 절차를. 절차는 ΔtrpLE1413 융합 시스템 (아래 참조)에 의해 부여 강력한 표현을 활용하여 정의 된 구성의 TM의 펩타이드 단지는 현대적인 다차원 NMR 실험에 사용되는 복잡한 안정적-동위 원소의 분류 기술을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 우리는 림프구 - 활성화 immunoreceptors이 (최근 1 검토)은 TM 도메인 간의 상호 작용을 통해 여러 막 단백질 subunits에서 조립하는 방법에 대한 중요한 새로운 정보를 공개 여러 NMR 구조를 결정하기 위해 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 이 기술은 다른 많은 막 단백질 시스템뿐만 아니라 솔루션 NMR뿐만 아니라 다운 스트림 분석 방법의 다양한 적용됩니다. 여기에 주어진 예는 기본 시스테인 잔류 물을 활용하는 동안자연스럽게 이황화 - 보세 단백질을 모방 복잡한을 만들려면 디자인은 동일하게 일반적으로 이러한 게이 및 이종 dimeric TM 단지와 같은 약한 비 공유 결합 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다 복합체를 안정화 할 수 있도록 설계 이황화 채권을 생성에 적합합니다 표피 성장 인자 수용체는 (EGFR) 가족 단백질 2-4 또는 heterodimeric의 αβ 인테그린 단지 5,6. 같은 지방질에서 파생 된 것과 같은 매우 소수성 펩타이드 시퀀스 이중층 - 스패닝 TM 단백질의 일부​​ 것은 생화학 및 biophysical 연구 대단히 어려운 과목입니다. 표준 단백질과 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하는 것은 매우 어려운 것뿐만 아니라, 그들은 종종 세포에 매우 독성이 있으므로 recombinantly 생산하기가 어렵습니다. 우리 7,8 등 9-11이 가지고에서 프레임 카르복시 - 터미널로 세균 이러한 어려운 펩타이드 시퀀스를 표현 상당한 성공E.에서 파생 된 ΔtrpLE1413 순서의 수정 된 버전 fusions 대장균 TRP 오페론 12. 이 시퀀스로 인코딩 ~ 13 kDa trpLE 폴리펩티드는 T7 프로모터에 따라 높은 수준의 생산 할 수 있으며 완전히 독성 및 / 또는 불안정에 관한 문제가 피할 아르 포함 단체로 지역화되어 있습니다. 아미노 터미널 9 히스티딘 태그 13 trpLE 순서에서 내부 메티오닌과 시스테인 잔류 물을 제거 금속 이온 친화도 크로마토 그래피에 의해 정화되고 소화 할 14 수 trpLE - 펩타이드 fusions는 시안 브로마이드 (CNBr을 사용하는 추가하여 순서의 변경 ) 원하는 펩타이드 시퀀스를 공개합니다. 우리는 성공적으로 많은 사 등의 TM 도메인을 포함 멤브레인 단백질 조각을 대표 trpLE fusions 등의 12 개의 시퀀스 이상을 표현하기 위해이 시스템을 사용하면 (7,8 및 게시되지 않은 결과, 또한 토론 섹션을 참조). 이 프로토콜의 주요 혁신은 구조화 매우 저조한 용해 trpLE-TM fusions 효율적으로 간소화 된 워크 플로우의 맥락에서 이황화 - 가교가 될 수있는 아래의 조건을 식별합니다. 높은 수율 표현, 취급 및 펩타이드 제품의 정화의 여러 측면은 철저하게 최적화하고, 여기에서 제시 한 권고는 비 이황화 - 가교 (monomeric) TM 펩타이드 제품의 생산을위한 동등하게 관련이되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시안 브로마이드 </td><td> 올드리치 </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의해 매우 독성, 피부에 접촉하고있는 경우는 삼켰다. 산과의 접촉은 매우 독성 가스를 liberates. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P.CODE - 1000984387, CAS 번호 76-05-1 </td><td> 유해 약물. 위험물이 있습니다., 심각한 화상을 일으킨다. 흡입에 의한 유해. 수생 생물에 유해, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P.No M7154, CAS 번호 60-24-2 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한, 피부 접촉 및 삼킨 경우 독성. 피부에 자극. 눈에 심각한 손상의 위험. 피부 접촉에 의해 sensitization의 원인이 될 수 있습니다. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro-2 - 프로 파놀 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 제품 번호 52512, CAS-아냐. 920-66-1 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한 위험하고 경우가 삼켰다. 화상됩니다. </td></tr><tr><td> 개미의 산 </td><td> 머크 KGaA </td><td> K41186564 </td><td> 가연성 액체 및 증기. 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 발생합니다. </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> UNIVAR, AJAX FINECHEM </td><td> 제품 번호, 817, CAS - 아니, 57-13-6 </td><td> 가열, 12 월이산화탄소와 암모니아로 omposes, 구운 경우, 질소 산화물의 작은 양을 방출. 빨갛게 및 피부와 눈의 자극을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 구아니딘 히드로 클로라이드 </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS 번호 : 50-01-1 </td><td> 삼킨 경우 유해한, 심각한 눈 염증을 일으킨다 피부 자극, 급성 독성 구강, 피부 자극, 눈 자극이 발생합니다. </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> 제품 번호 - T8532 CAS 번호 : 9002-93-1 </td><td> 트리톤 X-100는 종종 단백질을 solubilize하기 위해 생화학 응용 프로그램에서 사용하는 nonionic 세제, 100 % 활성 성분입니다. 트리톤 X-100는 항균 특성을가 없으며, 비교적 온화한 비 denaturing 세제를 고려 </td></tr><tr><td> 그의 - 선택 니켈 - 선호도 젤 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 카탈로그 개수-P6611 </td><td> IS-선택 니켈 선호도 젤은 고정 금속 이온 친화도 크로마토 그래피 (아이맥) 제품입니다. HIS - 선택 닉엘 선호도 젤은 특별히 히스티딘이 포함 된 단백질에 바인딩하도록 설계되어 니켈 혐의로 기소 구슬 아가로 오스의 독점적 인 quadridentate 킬레이트입니다. </td></tr><tr><td> (-)-글루타티온, 산화 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 카탈로그 NUM 150,568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (단종) </td><td> 최대 전원 출력 600w. 0.5 인치 교체 - 팁 프로브는 0.5 인치 높은 강도, 높은 볼륨 팁과 높은 강도, 낮은 볼륨 팁의 범위를 걸립니다. 이 회사에서 현재 사용할 수있는 가장 가까운 모델은 Q500 및 Q700 있습니다. </td></tr><tr><td> RP-HPLC : 생물학적 DuoFlow 크로마토 그래피 시스템, 소프트웨어 버전 5.3 </td><td> 바이오 RAD 연구소 </td><td> 카탈로그 개수 760-0047, 구성 번호 : AU500571, 시리얼 번호 : 484BR3705 </td><td> 펩티드는 높은 AQ의 위상 HPLC 컬럼을 취소에 바인딩ueous 모바일 위상 및 높은 유기 모바일 위상과 RP HPLC 컬럼에서 용출되어 있습니다. RP에서 HPLC의 펩티드들은 소수성 문자에 따라 구분됩니다. 펩티드는 유기 용매의 선형 그라데이션을 실행하여 분리 할 수​​ 있습니다. </td></tr><tr><td> 준비 HT C3 ZORBAX 300SB-HPLC 분석 칼럼, 21.2 X 150mm, 5 μm의 입자 크기 </td><td> 애질런트 </td><td> 제품 번호 : 895150-909 </td><td> 반대로 상 HPLC 칼럼 </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% 비스 - 트리스 젤 </td><td> 생명 기술 </td><td> NP0341BOX </td><td> 단백질 전기 영동을위한 사전 주조 젤 </td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer G2 투석 카세트, 3.5K MWCO </td><td> 열 과학 </td><td> 제품 번호 : 87724 </td><td> 샘플 투석 </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

막 단백질의 지질 내장 된 알파 - 나선형 도메인 간의 물리적 상호 작용은 막 단백질 단지의 접이식 및 조립과 같은 transmembrane (TM) 신호와 세포 표면 단백질 수준의 조절, 동적 인 프로세스에서 매우 중요한 역할을한다. 특정 시퀀스의 연결을 운전 구조적 기능을 이해하는 것은 TM의 펩타이드 단지의 정교한 biophysical 및 생화학 분석이 필요합니다. 그러나, TM 도메인의 극단적 인 소수성는 표준 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하도록 매우 어렵게 만듭니다, 그리고 적절한 학습 자료의 생산은 종종 prohibitively 도전 증명한다. 펩티드는 현재 안정적으로 나선형 conformations 및 양식 단지를 채택 할 수있는 환경을 확인하는 것은 자발적으로 어려움의 추가 수준을 추가합니다. 여기 E.하에 게이 또는 자료에서 이종 dimeric TM의 펩타이드 단지의 생산을위한 절차를 제시 안부난, 따라서 핵 자기 공명에 대한 안정적인 동위 원소 라벨 (NMR) 또는 상대적으로 저렴하게 다른 응용 프로그램이 아닌 천연 아미노산의 설립을 허용. 이 방법의 주요 혁신은 TM 단지는 생산 및 세제, 지질 또는 기타 막 모방 재료로 재구성 할 때 안정적인 화학 양 론적하고 균일 한 구조를 형성 할 수 covalently 관련 (이황화-가교) 어셈블리로 정화된다는 것입니다. 우리는 하나의 TM 도메인 또는 가교 단지를 생산 여부 동등하게 적용하고 새로운 TM 시퀀스에이 방법을 조절하기위한 조언을 제공 표현과 정화에 대한 조심스럽게 최적화 된 절차를 제시한다.

trpLE fusions에 달성 표현의 수준은 변수 첨부 된 펩타이드의 아미노 산 순서에 크게 의존한다. 그림 3은 사전 유도의 SDS-PAGE 분석 (차선 1) 시간의 수확 (차선 2) 표시 문화 1 리터과 4 ML의 니켈 매트릭스에서 순수한 그대로 trpLE-DAP12TM 융합의 약 12​​0 밀리그램이 나왔고 문화에서 샘플. trpLE - DAP12TM 융합의 모든으로 표면에 뜨는 (레인 3)에 반대 포함 몸 펠릿 (레인 4)로 번역되었습니다. ...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K 조회수.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. 막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

연구

화학

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

모세관 전기 영동은 실시간으로 키토산 필름에 펩타이드 접목을 모니터링하는

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

O-Carboxyanhydrides Ni/Zn 단지 중재의 Photoredox 반지 개통 중 합 제어

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Azaheterocycles의 합성에 대 한 안정적인 Bicyclic Aziridinium 이온과 그들의 반지 개통 준비

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Photoresponsive 액정의 구조 역학을 관찰을 위한 새로운 기술

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

SNS 코발트(II) 간알코올탈수소효소의 집게 모델 복합체 의 제조

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.