이 연구는 충칭 자연과학재단의 핵심 프로그램(No. cstc2020jcyj-zdxmX0027)과 중국 국가자연과학재단 프로젝트(No. 32270988)의 지원을 받았습니다.

동물실험은 실험동물의 사용 및 관리 가이드에 따라 수행되었으며 제3군 의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 나노 에멀젼(NE)의 제조
<ol><li>수성 상 준비를 위해 40°C에서 교반하면서 0.15g의 폴리소르베이트 80을 28.2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시킵니다.</li>
	<li>유상 제조를 위해, 표 1에 나타낸 나노에멀젼의 유상 제형을 사용한다. 40°C에서 교반하면서 sornitan trileate 85, DOTAP 및 RA를 스쿠알렌에 용해시킵니다.</li>
	<li>1차 O/W 에멀젼 준비의 경우 1400rpm에서 오일 상을 자기적으로 저어주면서 수성을 1mL/분의 속도로 천천히 적가합니다. 30,000rpm에서 고전단 유화제를 사용하여 6분 동안 혼합물을 사전 유화합니다.</li>
	<li>고압 균질화(HPH)의 경우 위에서 준비한 1차 O/W 에멀젼을 900bar에서 12사이클 동안 고압 균질화기로 처리하여 160-190nm 범위의 균질한 나노 에멀젼을 얻습니다.</li>
	<li>공정이 끝나면 50mL 플라스크에 에멀젼을 모으고 0.2μm PES 필터 멤브레인을 통해 에멀젼을 필터 멸균합니다.</li>
	<li>카테터를 통해 플라스크를 Schlenk Line에 연결하고 3방향 스톱콕을 회전시켜 시스템을 진공관에 연결하고 진공 펌프를 켜서 플라스크에 진공을 생성합니다. 그런 다음 3 방향 마개를 회전시켜 시스템을 아르곤 튜브에 연결하고 아르곤으로 채웁니다. 이 단계를 3번 반복하여 플라스크에 아르곤이 채워지도록 합니다.</li>
	<li>코르크와 밀봉을 파라핀 필름으로 교체하고 플라스크를 은박지로 싸서 4°C에서 보관합니다.</li>
</ol>2. 나노 에멀젼의 특성 분석
<ol><li>입자 크기 및 제타 전위 검출<ol><li>기기를 켜고 레이저 광원이 안정화될 때까지 30분 동안 기다립니다.</li>
		<li>NE를 초순수로 50배 희석하고 해당 샘플 셀에 1mL의 샘플을 추가합니다.</li>
		<li>입자 크기를 측정하려면 온도를 25°C로 설정하고 물을 분산 매체로 선택한 다음 일회용 플라스틱 접시를 측정 셀로 선택합니다. 샘플을 로드하고 자동으로 측정합니다. 각 샘플에 대해 세 번 반복된 측정의 평균값을 최종 결과로 보고합니다.</li>
		<li>제타 전위를 측정하려면 온도를 25°C로 설정하십시오. 수성상을 분산 매체로 선택했기 때문에 Smoluchowsi 모델을 선택하고 접힌 모세관 셀을 측정 셀로 선택합니다. 샘플을 로드하고 자동으로 측정합니다. 각 표본에 대한 3번의 반복 측정 평균을 최종 결과로 보고합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>캡슐화 속도(encapsulation rate) 및 약물 로딩 속도(drug loading rate)의 결정<ol><li>NE에 로드된 RA의 양을 측정하려면 절대 에탄올을 사용하여 NE에서 RA를 탈유화하고 추출합니다. 5 μL의 샘플에 995 μL의 에탄올을 추가하고 355 nm에서 분광 광도계를 사용하여 용액의 RA 함량을 측정합니다. 흡광도를 표준 곡선과 비교합니다. 다음 방정식을 사용합니다. 캡슐화 = 실제 RA 부하/추가된 약물의 중량 약물 로딩 속도 = 실제 RA 로딩 / 샘플의 품질</li>
	</ol></li>
</ol>3. 예방접종 절차 및 검체 채취
<ol><li>예방 접종 절차 및 그룹화<ol><li>다음 실험 그룹에 따라 0일, 14일, 28일에 면역을 위해 6-8주 되고 체중이 약 18-21g인 암컷 Balb/C 마우스를 5개 세트로 그룹: (1) PBS 그룹, (2) 오브알부민(OVA) 그룹, (3) OVA+ NE-RA(OVA/NE-RA) 그룹, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA) 그룹.</li>
		<li>200 μL의 다양한 백신 제형으로 상부 대퇴사두근에 근육 주사로 모든 마우스를 면역시킵니다 : 100 μL의 에멀젼과 100 μL의 PBS에 흡수 된 15 μg OVA는 투여 전에 혼합됩니다. 뒷다리 100μL를 주입합니다. 대조군의 마우스의 경우 PBS를 단독으로 투여합니다.</li>
		<li>안락사: 세 번의 예방 접종 완료 후 2주 후에 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg의 복강 내 주사로 모든 마우스를 안락사시킵니다.</li>
		<li>검체 채취 및 처리: 안락사 후 가위를 사용하여 쥐의 가슴을 절개하고 주사기를 심장에 직접 삽입하여 약 0.5mL의 전혈을 흡인합니다. 혈액을 실온에서 2시간 동안 그대로 둔 다음 1800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 혈청을 채취하고 부분 표본을 채취하여 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.</li>
		<li>전혈, 비장, 질 세척액(VLF), 기관지 폐포 세척액(BALF), 비강 세척액(NLF) 및 소장 세척액(SILF)을 수집합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>비장 림프구의 분리<ol><li>간단한 살균을 위해 생쥐를 에탄올 75%(v/v)에 담그고 생쥐를 깨끗한 벤치로 옮깁니다. 왼쪽 복부의 피부를 가위로 자르고 비장을 노출시켜 제거합니다.</li>
		<li>PBS 3mL가 들어있는 페트리 접시에 비장을 놓고 체(200 mesh, 70 μm)와 연삭 막대를 사용하여 15mL 원심분리기 튜브에 분쇄 및 여과합니다.</li>
		<li>실온에서 650 x g 에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 3mL의 적혈구 용액으로 침전물을 현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>튜브에 PBS 10mL를 넣고 잘 흔들어 반응을 종료한 다음 실온에서 650 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 버리고 10mL의 PBS에 세포를 재현탁시키고 세포 계수를 위해 20μL의 세포 희석액을 자동 세포 카운터에 추가합니다.</li>
		<li>실온에서 650 x g 에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포를 1640 완전 배지(1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청)로 1 x 106 cells/mL로 희석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>VLF 수집: 75μL의 1%BSA/PBST로 질을 4배 헹구고, 세척액을 결합하여 1.5mL 원심분리기 튜브에 수집하고, 4°C에서 5000 x g 에서 20분 동안 원심분리한 후 피펫으로 상층액을 수집하여 -80°C에서 보관합니다.</li>
	<li>BALF 및 NLF 컬렉션<ol><li>희생 후 75%(v/v) 에탄올로 생쥐를 소독합니다. 쥐 배를 위로 잡고 목을 곧게 펴십시오. 가위를 사용하여 쥐 목의 피부를 세로로 절개하고 집게를 사용하여 근육을 분리하고 기관을 적절하게 노출시킵니다.</li>
		<li>작은 가로 구멍을 통해 기관을 절단하고 호스를 폐쪽으로 삽입하고 주사기를 호스에 부착하고 PBS 0.5mL를 폐에 주입하고 빼내고 3회 헹굼을 반복하고 4°C에서 650xg에서 5분 동안 원심분리하고 상층액(BALF)을 -80°C에서 보관합니다.</li>
		<li>호스를 비강으로 역전시키고 주사기를 호스에 부착하고 0.5mL의 PBS를 주입하면 액체가 비강을 통해 1.5mL 원심분리기로 흐릅니다. 원심분리기 튜브에서 세척액을 흡인하고 헹굼을 2회 반복한 다음 4°C에서 650 x g 으로 5분 동안 원심분리하고 상층액(NLF)을 -80°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>SILF 컬렉션<ol><li>0.1mg/mL 트립신 억제제, 50mM/L EDTA-2Na, 1mM/L 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 함유한 PBS 용액을 소장 세척액으로 준비합니다. 실온에서 저어 녹인 후 4°C에서 보관합니다.</li>
		<li>대장을 따라 열린 소장을 절개하고 소장 세척액 3mL를 담급니다. 4 °C에서 30분 동안 15rpm에서 수직으로 흔들어 혼합합니다. 4°C에서 1440 x g 으로 20분 동안 원심분리하고 피펫으로 상층액을 채취한 다음 4°C에서 5000 x g 으로 20분 동안 원심분리합니다. 상층액(SILF)은 -80°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 근육내 투여 후 OVA 특이적 항체 반응 평가
<ol><li>효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 통해 IgG의 혈청 수준, IgG1, IgG2a의 하위 분류 및 VLF, BALF, NLF 및 SILF의 특정 sIgA 수준을 측정합니다.</li>
	<li>항원 코팅의 경우 코팅 완충액을 사용하여 OVA를 5μg/mL로 희석하고 웰당 100μL의 OVA 용액으로 4°C에서 밤새 96웰 ELISA 플레이트를 코팅합니다.</li>
	<li>PBST로 ELISA 플레이트를 5배 세척하고 37°C에서 2시간 동안 250μL의 1%BSA/PBST로 배양하여 차단합니다.</li>
	<li>PBST로 ELISA 플레이트를 5배 세척한 다음 아래 설명된 대로 희석한 샘플 100μL를 추가하여 테스트하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 0.5% BSA/PBST로 희석된 혈청, VLF, BALF, NLF, 20% 태아 송아지 혈청(FCS)/PBST로 묽은 SILF.<ol><li>2단계 희석 절차를 사용하여 혈청을 1000배 희석하는 것으로 시작합니다: 혈청 20μL를 1mL로 희석한 다음 이 희석된 혈청 25μL를 500μL로 희석합니다. 이 혈청 희석액을 사용하여 IgG1, IgG2a를 검출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1000x로 희석된 혈청 200μL를 코팅판의 첫 번째 줄에 추가하고 첫 번째 줄을 제외한 모든 웰에 0.5% BSA/PBST 100μL를 추가합니다. 첫 번째 줄에서 두 번째 줄로 100μL를 옮기고 피펫과 10x 혼합합니다. 이 단계를 8행까지 반복하고 100μL의 액체를 버리면 IgG 검출을 위해 다양한 농도의 혈청이 얻어집니다.</li>
	<li>BALF, NLF 및 SILF를 1:1로 희석하여 IgA를 검출합니다. VLF에 대해 혈청과 동일한 희석 절차를 사용하십시오.</li>
	<li>PBST로 ELISA 플레이트를 5번 세척합니다. 100μL의 HRP 접합 염소 항마우스 IgG/IgG1/IgG2a/IgA(PBST로 1:10000으로 희석)를 적절한 웰에 추가하고 37°C에서 40분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBST로 ELISA 플레이트를 5번 세척하고 TMB ELISA 기판 100μL(고감도)를 추가한 다음 플레이트를 5분 동안 빛으로부터 보호되는 장소로 옮깁니다. TMB 기질에 대해 100μL의 450nm 정지 용액을 즉시 추가하여 반응을 중지합니다.</li>
	<li>각 웰에 대해 450nm에서 흡광도(OD)를 측정하고 blank group mouse의 혈청 값의 2.1배를 양성 반응 값으로 취하여 항체 역가를 계산합니다.</li>
</ol>5. ELISpot 분석
<ol><li>ELISpot Plus에 대한 지침을 따르고 키트의 마우스 IFN-γ(ALP)를 사용하여 분석을 수행합니다.</li>
	<li>밀봉된 패키지에서 플레이트를 제거하고 멸균 PBS(200μL/웰)로 4회 세척합니다. 1640 완전 배지(200 μL/well)로 플레이트를 컨디셔닝하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 step3.2.2(100μL/well)에서 준비한 조정된 농도의 림프구 현탁액을 플레이트에 추가한 다음 자극제 100μL, 즉 20μg/mL OVA257~264 또는 OVA323~339 또는 1640 완전 배지를 포함하는 1640 완전 배지를 추가합니다. 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에 5% CO2 로 48시간 동안 넣습니다. 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 감쌉니다.</li>
	<li>셀 현탁액을 버리고 PBS(200μL/well)로 플레이트를 5번 세척합니다. 검출 항체(R4-6A2-비오틴)를 0.5% 태아 송아지 혈청(PBS-0.5% FCS)이 포함된 PBS에서 1μg/mL로 희석합니다. 100 μL/웰을 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>5.2단계와 같이 플레이트를 세척합니다. 스트렙타비딘-ALP(1:1000)를 PBS-0.5%FCS에 희석하고 100μL/웰을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>5.2단계와 같이 플레이트를 세척합니다. 0.45μm 필터를 통해 바로 사용할 수 있는 기판 용액(BCIP/NBT-plus)을 여과하고 100μL/웰을 추가합니다. 뚜렷한 반점이 나타날 때까지 개발하십시오.</li>
	<li>수돗물로 광범위하게 세척하여 발색을 멈추고 부드러운 플라스틱을 제거하고 접시를 건조시키십시오.</li>
	<li>ELISpot 리더의 스폿을 검사하고 계수합니다.</li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>일원 분산 분석으로 4개 그룹의 데이터 간의 차이를 분석한 후 Tukey 다중 비교 사후 테스트를 수행합니다. 모든 결과를 평균 ± SD로 표현합니다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었습니다.</li>
</ol>

마우스에서 나노에멀젼 캡슐화된 레티노산의 면역원성 평가

<ol>
	<li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants.">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Chen, W. 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저자는 이 작업에 대한 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산을 개발했습니다. 기존 NE 보조제와 비교하여 다음과 같은 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 일반적으로 O/W NEs의 표면은 음전하가 높아 항원을 직접 로드하기 어렵다. 양이온성 NE는 펩타이드 또는 단백질 항원을 효과적으로 흡착하고 특정 면역원성을 향상시킬 수 있?...

보조제는 면역 체계가 백신에 더 강하게 반응하도록 자극하여 특정 병원체에 대한 면역력을 증가시킴으로써 백신의 효능을 향상시키는 데 자주 사용됩니다1. 나노에멀젼(NE) 보조제는 유상과 수성을 일정 비율의 유화하여 W/O(water-in-oil) 또는 O/W(oil-in-water) 형태의 에멀젼을 생성함으로써 열역학적 안정성을 가진 콜로이드 분산 시스템을 말합니다.2. O/W 나노에멀젼 보조제는 주사 부위에서 사이토카인과 케모카인을 생성하고, 단핵구, 호중구, 호산구와 같은 중요한 면역 세포의 빠른 응집 및 증식을 유도하고, 면역 반응을 향상시키고, 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있습니다3. 현재 3종의 나노에멀젼 보조제(MF59, AS03, AF03)가 백신에 사용 허가를 받았으며 우수한 안전성과 효능을 보이고 있다4.
그러나, 점막 면역은 기존의 비경구 백신 접종에서 현재 허가된 보조제 제형으로는 잘 다루어지지 않았다5. 레티노산(RA)은 면역 세포의 장 귀환을 유도하는 것으로 보고되었지만, 극성이 낮고 물에 대한 용해도가 낮으며 빛과 열 안정성이 낮기 때문에 강력한 장 백신 접종에 사용하는 데 제한이 있습니다. 나노 에멀젼은 친유성이 높은 약물의 생체 이용률을 높일 수있는 기회를 제공하며 O / W 에멀젼 보조제의 오일 코어는 RA6 와 같은 비극성 물질을 용해시키는 데 적합합니다. 따라서, 나노 에멀젼은 전신 면역과 점막 면역의 이중 반응 효과를 달성하기 위해 RA의 담체로 사용될 수 있습니다.
중성 또는 음이온 전달 시스템과 비교하여, 양이온 전달 시스템은 상대적으로 효율적인 항원 캡슐화 및 전달 능력을 가지며, 이는 항원 7,8,9의 면역원성을 향상시킬 수 있습니다. 다양한 보조제 시스템의 양이온 표면 전하는 보조제 효과에 중요하다 10,11,12. 양이온 전하는 주사 부위에서 백신 머무름을 연장하고, 항원 제시를 증가시키며, 체내 세포 면역 자극을 연장하는 데 중요한 요소이다12.
위의 고려 사항을 바탕으로 RA와 항원을 효과적으로 공동 전달하기 위해 양이온성 나노에멀젼을 개발했습니다. 나노에멀젼의 입자 크기 및 제타 전위는 동적 광산란(DLS)을 사용하여 측정하고, OVA와 결합된 나노에멀젼의 전신 및 점막 면역 반응을 근육 주사13에 의해 평가하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1640 medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171529-1000 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>CordenPharma, Switzerland</td>
			<td>O02002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)</td>
			<td>mabtech</td>
			<td>ab205719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97235-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab205720-500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat&#160;Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97245-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>ATS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA323-339</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>TCI, Japan</td>
			<td>TCI-R0064-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10 basic Ultra-Turrax</td>
			<td>IKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171523-1000ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A003570-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid as an adjuvant to promote ova&#45;specific systemic and mucosal responses

양이온성 나노구조체는 수지상세포 성숙, ROS 생성 및 항원 흡수를 향상시키고 항원 특이적 면역 반응을 촉진하는 보조제 및 항원 전달 시스템으로 부상했습니다. 최근 몇 년 동안 레티노산(RA)은 점막 면역 반응을 활성화하는 효과로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나, RA를 점막 보조제로 사용하기 위해서는 이의 용해, 로딩 및 전달의 문제를 해결할 필요가 있다. 여기에서는 양이온성 지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOTAP), 레티노산, 스쿠알렌을 기름상으로, 폴리소르베이트 80을 계면활성제로, 소르비탄 트리올에이트 85를 보조계면활성제로 구성하는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(CNE-RA) 전달 시스템에 대해 설명합니다. 그것의 물리적, 화학적 특성은 동적 광 산란과 분광 광도계를 사용하여 특성화되었습니다. 항원(오브알부민, OVA)과 CNE-RA의 혼합물을 마우스에 접종한 결과, OVA 단독에 비해 질 세척액과 마우스의 소장 세척액에서 항-OVA 분비 면역글로불린 A(sIgA) 수치가 유의하게 상승했습니다. 이 프로토콜은 CNE-RA의 보조제 효과의 준비, 특성화 및 평가를 위한 자세한 방법을 설명합니다.

총 4개의 나노에멀젼 제형이 제조되었으며 표 2에 제시된 바와 같이 입자 크기(그림 1), 제타 전위 및 캡슐화 효율로 특성화되었습니다. 입자 크기는 약 160-190nm에 집중되었으며 DOTAP을 첨가하면 나노 에멀젼의 제타 전위가 역전되었습니다. OVA 특이적 혈청 IgG 및 혈청 내 하위 그룹 항체 수준은 3차 면역 접종 2주 후에 검출되었습니다. 나노에멀젼 보조 백신은 혈청 ...

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저자 스포트라이트: 점막 백신을 위한 양이온성 나노에멀젼 캡슐화된 레티노산 시스템의 개발 및 평가

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(RA)을 개발했습니다. FDA 승인 RA를 나노에멀젼에 첨가함으로써, 나노에멀젼의 근육 주사 후 질과 소장에서 항원 특이적 sIgA를 촉진시켰다.

OVA 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로서의 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

우리는 감염을 예방하고 전염을 차단할 수 있는 잠재력을 가진 감염 세트로 면역 반응을 일으키는 점막 백신을 연구하고 있습니다. 우리는 근육 주사에 의한 오브알부민으로 전신 및 점막 면역 반응을 모두 유발하는 긴장성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산 전달 시스템 면역을 개발했습니다. 향후 연구에서는 장 관련 질환의 동물 모델을 사용하여 양이온성 나노에멀젼 캡슐화된 레티노산이 백신 보호를 강화하는 효과와 메커니즘을 추가로 평가할 수 있습니다.

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

517 조회수.  Third Military Medical University. 우리는 감염을 예방하고 전염을 차단할 수 있는 잠재력을 가진 감염 세트로 면역 반응을 일으키는 점막 백신을 연구하고 있습니다. 우리는 근육 주사에 의한 오브알부민으로 전신 및 점막 면역 반응을 모두 유발하는 긴장성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산 전달 시스템 면역을 개발했습니다. 향후 연구에서는 장 관련 질환의 동물 모델을 사용하여 양이온성 나노에멀젼 캡슐화된...

비디오: 저자 스포트라이트: 점막 백신을 위한 양이온성 나노에멀젼 캡슐화된 레티노산 시스템의 개발 및 평가

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

편도선 단핵 세포의 격리는 인간 점막 림프구 조직에서 Ex Vivo 타고난 면역 반응을 연구합니다

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

유사형 바이러스를 이용한 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화도 평가

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

저자 스포트라이트: Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (유사형 바이러스와의 숙주 바이러스 상호 작용 연구) 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...