헤모필루스 인플루엔자는 COPD 및 폐렴을 포함한 다양한 만성 폐 질환에서 염증의 주요 원인입니다. 이 프로토콜은 폐 염증에 대한 헤모필루스의 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 선천성 및 적응성 면역 반응을 포괄적으로 평가할 수 있다는 것입니다.
450 마이크로 리터의 말초 혈액을 50 마이크로 리터의 활성화 된 요오드화 프로피듐 표지 H 인플루엔자를 섭씨 37 도의 수조에서 20 분 동안 5 밀리리터 튜브에 배양합니다. 수조에서 샘플을 제거하고 5 마이크로 리터의 DHR을 첨가하고 10 초 동안 와동시킵니다. 그런 다음 수조에 다시 10 분 더 두십시오.
수조에서 샘플을 제거한 후 적혈구를 0.8 % 염화 암모늄 용액 5 밀리리터로 용해하고 텍스트에 설명 된대로 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다. 말초 혈액 샘플을 대조군 및 항원 자극을 위한 분취량으로 나눕니다. 두 샘플 모두에 공동자극항체를 추가합니다.
그런 다음 항원 샘플에 비유형 H 인플루엔자를 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 골지 차단제 브레펠딘 A를 샘플에 첨가하고 5시간 더 배양한다. 이전에 입증된 바와 같이 적혈구를 용해시킨 후 1시간 동안 1 내지 2%파라-포름알데히드의 500마이크로리터를 사용하여 백혈구를 고정합니다.
혈구계를 사용하여 세포를 세고 100 마이크로 리터의 0.1 % 사포닌으로 15 분 동안 100 만 개의 세포를 투과시킵니다. 다음으로, 세포를 적절한 형광 표지된 항체로 배양한다. 세포를 씻은 다음 유세포 분석기를 사용하여 분석하십시오.
관련 림프구 집단을 얻어 항원 반응 세포의 비율을 결정한다. 분석할 모든 사이토카인에 대해 자극되지 않은 세포에 대한 배경 염색을 수행합니다. 약 20-40 그램의 폐엽 절제술 샘플을 3-5 입방 밀리미터 섹션으로 자릅니다.
멸균 된 50 마이크로 리터 챔버 안에 넣고 적절한 디 애그리 게이터를 사용하여 조직을 기계적으로 단편화합니다. 조직 분해 후, 입증된 바와 같이 적혈구를 용해시키고 멸균 RPMI에 세포를 재현탁시킨다. 그런 다음 100 마이크로미터 멸균 나일론 메쉬를 통해 세포를 여과하고 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
감염 분석을 위해 RPMI의 폐 세포를 튜브당 밀리리터당 4백만 세포의 최종 농도로 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포당 100개의 박테리아의 MOI로 세포를 감염시킵니다. 튜브에서 가스가 전달될 수 있도록 캡을 반 바퀴 풉니다.
세포를 튜브 회전 장치에 넣고 12RPM으로 회전하면서 섭씨 37도에서 배양합니다. 자극 1시간 후, 사이토카인의 세포외 수출을 방지하기 위해 그레펠딘 A를 첨가하고, 세포 현탁액을 회전과 함께 추가로 16 내지 22시간 동안 배양한다. 다음날, 1% 소 혈청 알부민과 0.01% 아지드화 나트륨을 함유하는 500마이크로리터의 PBS로 세포 현탁액을 세척한다.
다음으로, 특정 인간 림프구 세포 표면 마커에 대한 세포 현탁액을 1시간 동안 염색한다. 그런 다음 PBS로 세포를 씻고 이전에 시연 한대로 고정하고 투과시킵니다. 다음으로, 세포를 세포내 사이토카인 염색 항체와 함께 1시간 동안 배양한다.
그런 다음 세포를 세척하고 유세포 분석기에서 데이터를 수집하기 전에 100 마이크로 리터의 PBS에 재현 탁시킵니다. 금속 단백 분해 효소의 작용을 통해 단백질 분해를 측정하고 폐 조직 섹션 슬라이드에 직접 플루오레세인 표지 젤라틴 기질을 추가합니다. 슬라이드를 수평으로 놓고 섭씨 37도의 빛으로 보호된 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
음성 대조군을 준비하려면 추가 분석을 위해 형광 젤라틴이 없는 하나의 x 반응 완충액을 섹션에 추가합니다. 말초 혈액 단핵 세포는 식세포 집단을 정의하기 위해 전방 및 측면 산란을 사용하여 게이트되었습니다. 식세포 집단은 단핵구를 표지하기 위해 CD14 발현에 의해 추가로 정의되었다.
ROS 측정은 형광을 생성하기 위해 DHR 123의 산화를 통해 수행되었습니다. 자극된 샘플의 중앙값 형광을 대조군과 비교하였다. 림프구에 의한 세포내 사이토카인 생산은 유세포분석을 사용하여 측정하였다.
세포를 먼저 백혈구 마커 CD45의 발현에 대해 분석한 다음 CD 3 및 CD 4, CD 8에 대해 분석했습니다. CD3, CD4 양성 세포를 대조군 및 자극된 샘플에서 세포내 시토카인 생산에 대해 평가하였다. 프로테아제 활성은 고정되지 않은 폐 조직 절편에서 NC 2개의 접합조영술로 측정하였다.
형광 염색은 MMP 활성의 존재를 나타내었고, 이는 또한 염색질의 발현과 함께 국소화되었다. 폐 조직 샘플에 항체를 추가하려면 농축이 필요하며 세포의 염색은 예비 실험에서 최적화가 필요합니다. 폐 조직 샘플의 상청액은 ELISA와 같은 기술을 사용하여 다른 염증 매개체에 대해 추가로 분석될 수 있으며, 이들 기술은 폐 염증에 대한 잠재적 치료법의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
