저자는 프로 시저의 최대 초기 설정 에밀 Mairey과 임마누엘 Donnadieu 감사하고 싶습니다.

1. 인간 숙주 세포 및 세균 문화 <ol><li> 통과 1 5 % (V / V) CO 2 humidified 인큐베이터에서 37 ° 9 사이의 문화 HUVECs. 통로 세포들은 일회용 흐름 챔버 (μ - 슬라이드 VI)에서 75cm 두 문화 flasks 및 실험 문화 정비 문화를 제공하는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 80 % 합류 접근시. </li><li> passaged 수 flasks에서 매체를 철회, PBS의 10 ML로 세포를 씻어 철회하고 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1.5 ML로 바꾸십시오. 세포 ° C. 37 5 분 인큐베이터 세포 배양에서 분리하도록 허용 </li><li> 15 ML 수집 튜브에 세포 배양 매체 10 ML있는 세포를 수집합니다. 상온에서 5 분 원심 분리와 펠렛은 전지 (200g에서). 10 % 보충 엔도 - SFM 4 ML에있는 세포를 일시 중지 (V / V) FBS와 제조 업체의 지시에 따라, Malassez 챔버 그들을 계산합니다. </li><li> 채널 (3x10 4 개)로 ML 정지 당 1x10 6 HUVEC 세포의 30 μl를 소개하고 세포를 37에서 3 시간 준수 ° humidified 인큐베이터에 5 % (V / V) CO 2의 분위기 수 있습니다. 우물을 채우기 위해 엔도 - SFM 120 μl의 추가 볼륨을 추가합니다. 세포는 subconfluent monolayer (그림 2)을 형성한다. </li><li> N. 그로 켈로그의 보조제 37에서 5 μg / chloramphenicol의 ML ° 5 %를 포함한 습한 분위기에서 C (V /를 포함하는 GCB 한천 플레이트에 GFP를 (IPTG - inducible 프로 모터의 제어하에이 경우에는 스트레인 8,013 표현 GFP), 표현 meningitidis V) 16 시간 동안 CO 2. </li></ol> 2. 개인 박테리아의 초기 접착력은 세포를 호스트 <ol><li> 사전 예열 엔도 - SFM은 37 120분 10 % (V / V) FBS와 부화를 포함한 ° C를 5 % (V /를 포함한 습한 분위기와 0.05의 OD600에 GCB의 한천 플레이트에 성장 박테리아의 농도를 조절 V) 부드러운 흔들림 (130 RPM)에서 CO 2. 전체 배양 기간 동안 문화 매체에 1 ㎜의 IPTG를 추가하여 GFP 발현을 유도. </li><li> 37 샘플 온도를 유지하기 위해 가열 플랫폼 ° C. 갖춘 거꾸로 현미경의 무대에서 μ - 슬라이드 일회용을 플레이스 </li><li> 멸균 유리 비커에 2%과 보완 사전 예열 엔도 - SFM (V / V) FBS를 붓고이 매체와 살균 50 ML의 주사기를 입력하십시오. 주사기로 &quot;항목&quot;튜브를 부착하고 매체를 도입하여 기입하십시오. </li><li> 챔버에 공기를 도입하지 않도록하기 위해,주의, μ - 슬라이드에있는 &quot;항목&quot;튜빙을 연결합니다. 그런 다음, 신중하게 접사 다른 끝에 &quot;종료&quot;튜브 및 챔버 &#39;출구&#39;에서 약 1cm 거리에 매체와 채널을 입력합니다. </li><li> 박테리아 OD600를 측정하고 엔도 - SFM 2 % (V / V) FBS를 포함하는으로 0.15을 조절할 수 있습니다. 개인 박테리아를 봐하기 위해서는 모든 집계는 세균 샘플의 활발한 vortexing에 의해 중단될 수 있어야합니다. </li><li> 엔도 - SFM 장소 100 μl의 저수지 2 개의 % (V / V) FBS 배지로 보충하고 나머지 박테리아 합산을 샘플링하지 않도록 vortexed 솔루션의 정상에서 찍은 세균성 솔루션을 100 μl를 추가합니다. </li><li> 챔버에 박테리아를 주입하기 위해 꼭지를 돌려하여 μ - 슬라이드에 200 μl 볼륨을 조심스럽게을 소개합니다. </li><li> 2 %가 포함된 엔도 - SFM (V / V) 37 유지 FBS, 각하 온수 플랫폼과 C, 0.044 다인즈 / 15 분 cm 2의 접착력과 호환 전단 응력과 주사기 펌프를 사용하여 챔버에. 소개 </li></ol> 동영상 1 또는 그림 3 예를 들어 참조하십시오. 이 단계 후에, 각 섹션 3, 4 또는 6로 이동합니다. 3. 호스트 세포 개별 박테리아의 초기 접착의 부량 <ol><li> 액체가 계속 순환되는 동안 15 분 동안 초기 접착 후, 무작위로 열 필드의 이미지를 획득. </li><li> 분야마다 adherant 박테리아의 수를 의미에 액세스하려면 ImageJ 소프트웨어 8, 사용하여 얻은 이미지를 분석합니다. 다음과 같이이 이루어집니다 : 우선, 각각의 이미지가 세포의 배경을 최소화하면서, 각각의 준수 형광 박테리아를 강조하는 &#39;이미지&#39;메뉴에있는 &quot;임계값&quot;창을 사용 thresholded 있습니다. 그런 다음, 모든 단일 세균이 플러그인 &quot;셀 카운터&quot;(사용하여 계산됩니다 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html를</a> .) 각 이미지에 대한 데이터는 Excel 스프레드 시트에서보고 있으며, 분야마다 자기편 박테리아의 평균 개수를 정할 평균입니다. </li></ol> 4. 호스트 세포에 점착 성의 개별 박테리아의 흐름에 저항을 측정 <ol><li> 프로그램 주사기 펌프 3 백 다인즈 / 5 분 cm 2까지 전단 응력을 생성 - 설정합니다. </li><li> 5 분 끝에, 단계 3.1에서 설명한대로 무작위로 선택한 열 필드를 취득하지만, 흐름과 PR을 중지인수 ior. </li><li> 로 단계 3.2에서 설명한 획득한 이미지를 분석하고 현장마다 남아있는 박테리아의 의미 번호를 계량. </li></ol> 5. microcolony에 절연 점착 성의 박테리아의 성장을 측정 <ol><li> 엔도 - SFM 10 % (V / V) 37 유지 FBS, 각하 온수 플랫폼과 C, 몇 시간 동안 선택한 전단 응력과 주사기 펌프를 사용하여 챔버에.를 포함하는 소개 한 프레임마다 5 분 실시간 비디오 현미경에 대한 기록 이미지. </li><li> 비디오 현미경 다음, 주사기 펌프를 해제하여 전단 응력을 중단, 2-3 추가 영상을 얻은 후 소프트웨어에서 이미지 수집 순서를 중지합니다. 박테리아 확산의 예제는 비디오 2 볼 수 있습니다. </li></ol> 6. 자기편 세균성 microcolonies의 흐름에 저항을 측정 <ol><li> 세포 표면에 큰 microcolonies의 형성 후 (step5.2) 흐름을 신청하기 전에 2-3 두 세포의 이미지 (상 대조적으로)와 박테리아를 (GFP - 형광에 의해) 취득. 실험의 나머지 부분은 인수 프로토콜은 형광을 모니터링합니다. </li><li> 한 프레임 5 초마다에서 5 분 (3-100 다인즈 / cm 2) 및 기록 이미지에 대한 높은 전단 응력을 적용. </li><li> 주사기 펌프를 해제하여 전단 응력를 중지, 2-3 추가 영상을 얻은 후 소프트웨어에서 이미지 수집 순서를 중지합니다. </li><li> 다음 먼저 &quot;종료&quot;튜브를 제거하고 신중하게, 채널을 비우는 피하기 위해 다음 &quot;항목&quot;튜브를 제거하기 전에 우물을 채우기 위해 미리 예열 신선한 매체를 추가하십시오. </li><li> 양적 세균성 저항에 대한 전단 응력의 효과를 확인하려면, 도금 분석은 다음과 같이 수행할 수 있습니다 : 남아있는 매체를 수집하고 채널 (모두 세척이에서 남아있는 매체를 제거 PBS 120 μl와 두 번 μ - 슬라이드 씻어 또한 수집된). </li><li> 37 °에서 5 분간 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 50 μl를 추가로 감염된 세포를 분리하고 이전 단계에서 수집된 현탁액이 분리된 샘플을 섞는다. </li><li> PBS 및 플레이트 세중의에 GCB의 한천 플레이트에 10 μl 분수에서 시리얼 dilutions, 37에서 접시의 부화 후 다음날 콜로니 형성 단위의 수 (CFU)를 결정하기 위해를 수행 ° 인큐베이터에서 C와 함께 5 % (V / V) CO 2. </li></ol> 비디오 3 4 pilV 돌연변과 야생 타입 응력을 비교합니다. 7. microcolonies에서 세균 분리 <ol><li> 2.8 단계 2.1 반복하여 흐름 챔버에 세포를 감염과 감염이 30 분 동안 진행하실 수 있습니다. </li><li> 2 분 동안 10 다인즈 / cm 2 흐름을 증가하여 언바운드 박테리아를 제거하고 감염이 2 시간을 위해 계속하실 수 있습니다. </li><li> 0.15 다인즈 / cm 2 흐름을 줄입니다. </li><li> 모든 시간의 흐름 챔버 나오는 매체의 드롭를 수집합니다. </li><li> GCB의 한천 플레이트에 샘플을 판 그들의 시리얼 dilutions을 수행합니다. </li><li> 37 접시의 부화 후 다음날 콜로니 형성 단위의 수 (CFU), 각하 인큐베이터에서 C 5 % (V / V) CO 2를 결정합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> 그림 1 : 관찰과 절차의 흐름의 면전에서 측정할 수있는 세포 monolayer의 다른 단계를 반복합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> 그림 2 : 실험 (전단 응력의 ​​부재)의 시작 부분에 흐름 챔버에서 내피 세포 monolayer. 약 50 내피 세포는 서브 합류 monolayer로 구성됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> 그림 3 : 세포 표면에 박테리아의 초기 접착력의 그래픽 표현. 세 분야에 대한 값 (0044 다인즈 / cm 2) 예상되는 분야 - 투 - 현장 변화의 아이디어를주는 표시됩니다. 비디오 1. 시간 함수 (0044 다인즈 / cm 2)로 세포 monolayer에 대한 박테리아의 초기 접착력의 시각화. GFP - 표현 박테리아는 흐르는 매체의 방향을 따르고 있습니다. 이 영화는 60 배 가속은, 비디오의 실제 소요 시간은 10 분입니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 2. 초기 부착 세균 후는 7 시간의 기간 (1000 배 가속)에 대한 세포 표면에 세포 분열 따위에 의해 번식 수있게되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 3. 확산 후 세포 표면에 기계공microcolonies의 알 저항이 있지만 야생 유형 microcolonies가 내성을 가속 60 배 아르 5 분 10 다인즈 / cm 2로 전단 응력 수준을 증가하여 테스트되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a> pilV 돌연변이에 의해 형성 비디오 4. Microcolonies는 흐름 증가 (10 다인즈 / cm 2)에 의해 방해하고 있습니다. 이 돌연변이가 microcolonies 아래 플라즈마 막의 리모델링을 유도하는 데 실패하고 증가 전단 응력 (동영상 60 배 가속입니다) 5함으로써 더 높은 민감합니다. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전단 응력과 일반적으로 생물의 기계 부분의 중요성이 점차 인식되고있다. 예를 들어 lymphocytes 부착 및 혈관 벽에 압연 과정에서 단백질의 Selectin 가족의 고도의 적응 접착제 속성이 과정에서 전단 응력을 도입하여 인정되었습니다. 위에서 설명한 절차는 그람 음성 세균 Neisseria meningitidis의 적용했지만 병원균의 광범위한 적용해야합니다. 전단 응력의 중요성은 다른 병원균 및 기타 감염 사이트에도 게재되었습니다. 전단 응력에 의해 에어컨 세균 유착이 uropathogenic 대장균 (UPEC) 9에있는 FimH adhesin의 연구에 의해 설명되었다. Selectins 마찬가지로, FimH 및 숙주 세포 수용체 간의 상호 작용이 전단 유도된 기계적 힘에 9 enterotoxigenic E.coli의 CfaE adhesin에 의해 강화하는 게재된는 전단에 의존 통해 창자 상피 세포에 부착을 중재하는 것도보고되었습니다 메커니즘 10. 우리는 연쇄상 구균 agalactiae 필리는 유동 조건 하에서 상피 세포가 11이 병원체의 준수에 필수적인 것을이 장에서 설명한 층류 흐름 챔버 분석 프로토콜을 사용했다. 이러한 연구는 우리의 흐름 챔버 분석은 전단 응력의 조건 호스트 병원체 상호 작용 세포를 조사하는 유용한 도구입니다 있는지 확인합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> μ - 슬라이드 VI 0.4 흐름 키트 </td><td> IBIDI </td><td> 80,606 </td></tr><tr><td> 주사기 Plastipak 50 ML Luer - 잠금 </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon 튜빙 R3603 3.2 X 4.8mm </td><td> 피셔 - 과학 </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 남성 luer 3 방향 꼭지, 2 여성 luer </td><td> 바이오 래드 </td><td> 7,328,103 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경, 니콘 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 T I </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> 오르카 285 CCD 또는 오르카 3 - CCD </td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH </td><td> 프리웨어 ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

세균성 감염 동안 상호 작용의 순서는 병원체와 숙주 사이에 발생합니다. 숙주 세포의 표면에 세균 부착이 자주 pathogenesis의 초기 및 결정 단계입니다. 실험적으로 유착이 거의 정적 조건에서 공부 있지만 접착력은 실제로 액체를 흐르는 앞에서 열립니다. 세균과 호스트 간의 첫 번째 조우는 종종 점액은 상피 세포의 표면을 따라 흐르는 점막 레벨, 입, 폐, 뱃속, 눈, 등에서 발생합니다. 나중 감염에 병원균은 종종 같은 패혈증, 패혈증과 뇌막염과 같​​은 생명을 위협하는 질병의 원인이 혈액 순환을 액세스할 수 있습니다. 이러한 감염의 정의 기능은 혈액을 순환의 존재에있는 내피 세포와 상호 작용 이러한 병원균의 능력입니다. 그것은 병원체에 기계적 힘을 생성하기 때문에 액체, 점액 또는 인스턴스에 대한 혈액을 흐르는 존재는 접착력을 결정합니다. 액체를 흐르는 효과를 특징 짓는하기 위해서는 일반적으로 다인즈 / cm 2의 표현 고정 벽 근처에 움직이는 유체에 의해 단위 면적 당 끼쳤다 접선 힘이 전단 응력의 ​​개념을 말합니다. 전단 응력의 ​​농도가 다른 선박의 종류에 따라 다양, 크기, 장기, 위치 등 (0-100 다인즈 / cm 2). 모세 혈관의 순환은 매우 낮은 전단 응력 값에 도달 심지어 일시적으로 몇 분 1 몇 초 사이에 이르는 기간 동안 중단할 수 있습니다. arterioles의 스펙트럼 전단 응력의 ​​다른 쪽 끝을에 100 다인즈 / cm 2 2에 도달할 수 있습니다. 다른 생물 학적 과정에 대한 전단 응력의 ​​영향은 명확하게 내피 3 leukocytes의 상호 작용하는 동안 인스턴스로 증명되었습니다. 계정에 세균 유착 과정에서이 기계 매개 변수를 이용하려면 우리는 일회용 흐름의 사용 챔버 4 기반의 실험 절차를 이용했다. 호스트 세포가 흐름 챔버 재배하고 형광 박테리아는 주사기 펌프에 의해 제어 흐름에서 소개하고 있습니다. 우리는 처음 세균성 병원체 Neisseria meningitidis, 패혈증과 뇌막염에 대한 책임 그람 음성 세균에 대한 조사를 하였다. 절차는 우리가 박테리아의 능력에 전단 응력의 ​​영향을 연구 허용 여기서 설명 : 세포 표면 5 분아 따위에 의해 번식하는 세포 1을 준수하고 새로운 사이트를 6 (그림 1)을 식민지로 분리합니다. 보완 기술 정보 참조 7 찾을 수 있습니다. 여기에 제시 전단 응력 값은 문헌에서 찾을 값을 나타내는 우리의 이전 경험을 1에 따라 선정되었습니다. 프로토콜은 연구의 목표에 따라 구체적인 조정과 병원균의 광범위한 적용해야합니다.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K 조회수.  INSERM U970. 감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

연구

면역학 및 감염병학

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...