우리는 몽구스 혈청에서 이오페녹스산을 검출하고 정량화하는 절차를 설명했습니다. 결과는 iophenoxx산이 종에 있는 beta uptake를 확인하기 위하여 생물학 마커로 이용될 수 있다는 것을 건의합니다. 이 방법의 주요 장점은 단백질 강수 기술을 수행하기 위해 간단한 을 사용하여 10 억 수준 당 부품에서 iophenoxic 산 유사체의 정량화를 허용한다는 것입니다.
이동 상 A의 경우 포믹산 1밀리리터와 1리터의 초순수수를 결합합니다. 이동 상 B의 경우 포믹산 1밀리리터와 아세토닐릴 1리터를 결합합니다. 희석제의 경우, 아세토나이트 200밀리리터와 트리플루오로아세트산 1밀리리터를 결합합니다.
다음으로, 마이크로 밸런스에 메틸 IPA의 약 10 밀리그램의 무게, 플러스 또는 마이너스 0001 밀리그램질량을 기록. 메틸-IPA를 10 밀리리터 급 A 체피플라스크로 정량적으로 전송하여 아세토닐트리어의 4~5밀리리터를 사용한다. 모든 고체를 용해한 다음 아세토나이트로 볼륨을 가져오기 위해 1분 동안 초음파 처리합니다.
각 스톡의 약 8밀리리터를 PTFE 라이닝 캡이 달린 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 옮기고 샘플을 실온에 보관합니다. 그런 다음 남은 주식을 유해 폐기물로 옮기습니다. 25X 재고의 경우 7 개의 메틸 IPA 재고는 밀리리터 당 약 200 마이크로 그램에서 메틸 IPA 및 아세토나이트 의 주식을 준비합니다.
주식의 1 밀리리터를 5 밀리리터 플라스크로 옮기고 아세토닐로 부피로 희석합니다. 그런 다음, PTFE 줄 지어 모자와 8 밀리리터 호박 유리 유리 바이알에 주식을 전송하고 실온에서 저장합니다. 반복 피펫을 사용하여 PTFE 라이닝 캡이 있는 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 텍스트 프로토콜에 설명된 6개의 추가 25X 메틸-IPA 주식을 준비하고 실온에 보관합니다.
25X 대리 주식의 경우, 농축 된 에틸-IPA 주식의 0.1 밀리리터를 10 밀리리터 클래스 A 볼륨 플라스크로 100 마이크로 리터 유리 주사기를 사용한 다음 아세토나이트로 부피로 희석합니다. 대리 스톡의 약 8밀리리터를 PTFE 라이닝 캡이 달린 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 옮기고 실온에서 보관하십시오. 남은 주식을 유해 폐기물로 옮기.
다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메틸-IPA와 에틸-IPA를 모두 포함하는 4배 의 주식을 10밀리리터 스크류 톱 유리 자동 샘플러 바이알로 준비한다. 예를 들어, 재고 4X7을 준비하려면 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 2밀리리터 바이알에 25X 스톡 7개의 메틸-IPA 스톡의 0.2 밀리리터를 추가합니다. 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 25X 대리 에틸-IPA 스톡의 0.2 밀리리터를 추가합니다.
1 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 0.85 밀리리터의 아세토나이트를 추가합니다. 유리병을 단단히 캡하고 혼합하려면 5번 반전합니다. 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2밀리리터 나사 상단 자동 샘플러 바이알로 표준 곡선을 준비합니다.
예를 들어 표준 7을 준비하려면 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 4X7 스톡의 0.2 밀리리터를 2밀리리터 바이알에 추가합니다. 1 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 0.6 밀리리터의 초순도 이온화 물을 추가합니다. 바이알을 단단히 캡하고 혼합하려면 5번 반전합니다.
각 샘플에 대해 200~300밀리그램의 염화나트륨을 함유한 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 80개의 플라스틱 랙에 튜브를 정렬합니다. 각 샘플에 대해 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 A로, 두 번째 마이크로 원심분리기 튜브를 B.는 80개의 위치 플라스틱 랙에 튜브를 정렬합니다. 혈청 추출에 필요한 다음 재료와 장비를 2개의 생물안전 캐비닛에 배치합니다: 마이크로 원심분리기 튜브, 소용돌이 믹서, 0.5 밀리리터 및 5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫, 1000 마이크로리터 팁이 있는 100~1000 마이크로리터 공기 변위 파이펫, 희석제 및 초순도 이온화 물 각각 약 100밀리리터가 있는 용기, 생체 위험 폐기물 용기.
다음으로, 냉동 보관에서 혈청 샘플을 제거하고 생물 안전 캐비닛의 실온으로 따뜻하게 합니다. 소용돌이는 샘플링 전에 각 혈청 샘플을 혼합합니다. 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 05 밀리리터의 몽구스 세럼을 튜브 A에 분배하고 25X 대리 스톡의 05 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 튜브 A에 0.95 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 단단히 캡하고 10~15초 동안 소용돌이 믹스를 섞습니다. 다음으로, 관 A.Fortify 0.5 밀리리터 용량 팁반복 피펫을 사용하여 나-IPA와 함께 4QC 샘플각각을 포티피튜브에 컨트롤 몽구스 세럼을 추가합니다.
QC 샘플에 25X 대리 스톡을 추가합니다. 그런 다음 QC 샘플에 희석제를 추가합니다. 튜브와 소용돌이 믹스를 캡.
미리 계량된 염화나트륨을 튜브 A에 분배하고 소용돌이 믹스를 8-12초 동안 세 번 분배합니다. 그런 다음 70%의 이소프로판놀을 사용하여 튜브 A를 포함하는 바이알 랙의 외부 표면을 닦아냅니다. 생물 안전 캐비닛에서 샘플을 제거 한 후, 원심 분리기 튜브 A는 1 분 동안 1200 배 G에서 수성 및 아세토나이트 상을 분리합니다.
파이펫 0.8 마이크로리터 공기 변위 파이펫을 사용하여 튜브 B에 상부 아세토닐트리어 위상의 파이펫 0.8 밀리리터. 튜브 A의 나머지 솔루션을 유해 폐기물로 옮기고 빈 튜브를 생물 유해 폐기물 용기에 폐기합니다. 이제 45도의 수조에서 질소 가스의 부드러운 흐름으로 튜브 B에서 아세토나이트와 삼불화를 제거하십시오.
반복 피펫과 소용돌이 믹스를 사용하여 튜브 B에 0.25 밀리리터를 추가합니다. 이어서, 원심분리기는 튜브 의 바닥에 액체를 수집하기 위해 2~4초 동안 1200배 G에서 분리된다. 원심 분리에 따라, 4~5초 동안 5밀리리터 용량 팁과 소용돌이 믹스가 있는 반복 피펫터를 사용하여 튜브 B에 0.75 밀리리터의 초순수 분해물을 첨가합니다.
원심분리기는 1분 동안 1200배 G의 원심분리기를 사용하여 샘플을 명확히 합니다. 이어서, 1000마이크로리터 공기 변위 파이펫을 이용하여 초산자의 0.75 밀리리터를 자동 시료 바이알로 옮기고 생체 위험 폐기물 용기의 파이펫 팁을 폐기한다. LC-MS/MS 분석을 위해 각 자동 샘플러 바이알을 안전하게 캡합니다.
튜브 B의 나머지 용액을 유해 폐기물로 옮기고 빈 튜브를 생물 유해 폐기물 용기에 버려두십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 모든 매개 변수로 LC-MS/MS를 구성합니다. LC-MS/MS의 전원을 공급하고 컬럼이 섭씨 70도에 도달한 후 분당 0.8 밀리리터로 유속을 설정할 수 있습니다.
데이터 수집 소프트웨어에 서열을 설정하여 품질 관리 샘플 및 알 수 없는 샘플로 구성된 각 배치 전후의 표준 곡선을 주입합니다. 모든 표준 및 샘플을 주입하고 텍스트 프로토콜에 나열된 매개 변수를 사용하여 MR 이온 크로마토그램을 획득합니다. 시퀀스 완료 후 LC-MS/MS를 끄고 유해 폐기물에 모든 자동 샘플러 바이알을 폐기하십시오.
대조군 몽구스 세럼의 이온 크로마토그램은 에틸-IPA의 보존 시간과 표시된 보존 시간에 메틸-IPA의 부재를 보여줍니다. 품질 관리 샘플의 이온 크로마토그램은 메틸-IPA로부터 메틸-IPA의 기준분리뿐만 아니라 메틸-IPA에 대한 정량화 및 한정자 전환을 보여줍니다. 연구에서 대표적인 샘플의 이온 크로마토그램은 메틸-IPA의 마이크로리터 당 33.5 마이크로그램의 관찰된 혈청 농도를 나타낸다.
메틸-IPA로 강화된 제어 몽구스 세럼의 정확도와 정밀도 결과는 여기에 나와 있습니다. 회복%는 96.9~109%로 3대 강화 수준에서 상대편차가 각각 3.4%1.7%, 2.3%였다. 에틸-IPA로 강화된 제어 몽구스 세럼의 정확성과 정밀도 결과는 여기에 나와 있습니다.
회복%는 89.5~115%로 5대 강화 수준에서 상대기준 편차가 각각 4.3%1.5%2.3%와 1.1%였다. 모든 몽구스는 에틸-IPA와 메틸-IPA 미끼를 제공 24 시간 제약 내에서 미끼의 적어도 25 %를 소비하고 각각 자신의 세라에 에틸 IPA와 메틸 IPA의 정량화 수준을했다. 이 방법의 잠재적 인 유용성은 프로필 및 부틸 iophenoxic 산과 같은 다른 iophenoxic 산 유사체에 대한 데이터를 수집하기 위해 LC-MS를 구성하여 증가 할 수있다.
우리는 예방 접종 관행에 대한 자문위원회의 가장 최근의 권고, 또는 사전 노출 광견병 예방 접종이 필요한지 여부에 대한 지침을 위해 기관 생물 안전위원회의 최신 권고사항을 자문할 것을 권장했습니다. 희석되지 않은 혈청과 관련된 이 프로토콜의 섹션 2.3~2.6항은 2급 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 한다.
