편도선 단핵 세포는 혈액 세포 보다는 더 관련성있고 복잡하고, 그들의 격리는 점막 면역을 관련시키는 병리에 있는 면역 세포 반응의 연구 결과 수 있습니다. 우리가 확립 한 기술은 전 생체 연구에 대한 무결성을 유지하면서 점막 조직에서 많은 수의 면역 세포를 회복 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하지만 편도선은 수율을 최대화하기 위해 신속하고 주의하여 처리해야합니다.
원고 텍스트에 설명된 대로 인간 편도선 조직을 실험실로 이송합니다. 다음으로 셀 스트레이너를 150~25mm 배양 접시에 놓습니다. 모든 해부 악기를 다른 접시에 담아 멸균을 유지합니다.
모든 주요 표본은 이전에 자격을 갖추지 못했으며 전염성 요원을 포함할 수 있으므로 주의하여 처리해야 합니다. 그런 다음 편도선에 침범한 일부 세포를 포함하기 때문에 유리병에서 여과기에 PBS를 붓습니다. 멸균 집게를 사용하여 편도선을 바이알에서 멸균 집게를 사용하여 배양 접시로 옮킨다.
필요한 경우 더 많은 PBS를 추가하여 그리드에 몰입합니다. 해부는 편도선 당 약 45 분 정도 소요됩니다. 이 기간 동안 편도선이 침수되어 생존력과 세포 수율을 보장하는 것이 중요합니다.
포셉과 메스를 사용하여 소작 피 묻은 자궁 근종 조직을 제거합니다. 메스와 구부러진 핀셋을 사용하여 조직을 직경 이반 센티미터 미만의 작은 조각으로 자른다. 작은 조각이 항상 침지 될 수 있도록 모든 조직을 잘라.
세포 여과기에 조직의 몇 조각을 배치합니다. 흰색 스트로마의 매우 얇은 층이 남아있을 때까지 유리 유봉으로 그리드에 긁어. 그리드가 막히는 것을 방지하기 위해 스트로마를 제거하고 버립니다.
그런 다음 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 그리드로 전송하고 마지막으로 긁어냅니다. 다음으로, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 세포 현탁액을 멸균 유리병으로 옮기는다. 그리드와 셀 스트레이너를 PBS로 한 번 세척하고 PBS를 바이알로 이송합니다.
진행하기 전에 실온에서 5 분 동안 벤치에 셀 서스펜션을 쉬게하십시오. 멸균 70마이크로미터 체는 새로운 50밀리리터 바이알 위에 놓습니다. 셀 서스펜션을 10밀리리터 파이펫으로 체에 부드럽게 전달합니다.
체가 막힌 경우 멸균 1 밀리리터 파이펫 팁의 뒷면을 사용하여 체를 통해 세포를 긁어냅니다. 필요에 따라 체를 자주 변경합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 g의 원심분리.
원심 분리 후, 상체를 폐기하십시오. 병기를 부드럽게 눌러 펠릿을 다시 중단한 다음 PBS의 35 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 격리의 첫 번째 단계를 완료하려면 새로운 유리병 위에 새로운 70 마이크로미터 체를 배치하고 10 밀리리터 파이펫으로 세포 현탁액을 전달합니다.
더 명확한 세포 용액을 얻으려면 밀도 그라데이션 배지의 15 밀리리터를 새로운 50 밀리리터 바이알에 추가하십시오. 밀도 그라데이션 매체 위에 TMC 솔루션을 붓고 혼합을 최소화하도록 주의하십시오. 다음으로, 가속과 브레이크오프로 실온에서 30분 동안 1000배 g의 원심분리를 합니다.
원심분리기에서 바이알을 제거한 후 10밀리리터 파이펫을 사용하여 상부 층을 제거하고 폐기합니다. TMC와 밀도 그라데이션 매체 사이의 인터페이스를 방해하지 마십시오. 그런 다음 멸균 1 밀리리터 파이펫 팁으로 TMC를 제거하고 새로운 50 밀리리터 바이알로 옮길 수 있습니다.
세포를 세척하려면 먼저 2 %의 태아 소 혈청과 2 밀리마일러 EDTA를 포함하는 PBS의 50 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 4°C에서 10분 동안 250배 g의 튜브원심분리를 합니다. 세포를 다시 씻으십시오만, 이번에는 4섭씨에서 10분 동안 400배 g로 튜브를 원심분리합니다.
10%의 열불활성화 FBS, 2 밀리머 L-글루타민 및 항생제 용액으로 RPMI 1640을 보충하여 R10 배양 배지를 준비하십시오. R10의 10 밀리리터에서 TMC를 다시 중단합니다. 그런 다음 셀을 계산합니다.
셀은 원고에 설명된 대로 향후 사용을 위해 즉시 사용하거나 냉동할 수 있습니다. TMC는 염색되고, 항체로 배양하고, 유동 세포측정을 사용하여 특징지어졌다. TMC는 혈액에서 말초 단핵 세포에 존재하는 모든 주요 면역 세포 유형을 포함, 축약 PMBC.
그러나, B 세포를 제외한 모든 세포 모형의 주파수는 PBMC에서 보다는 TMC에서 더 낮았습니다. 사이토카인 생산에서 세포 활성화를 연구하기 위해 TMC는 resiquimod R848로 밤새 자극되었습니다. 파란색으로 그려진 TMC는 IFN Lambda 2/3 및 IL-8을 제외한 모든 사이토카인을 생산했지만, PBMC보다 생산량이 낮았지만 녹색으로 그려졌습니다.
주름은 R848 자극을 자극이 없는 것으로 비교하여 빨간색으로 지적된다. 정제되고 고립된 TMC, 청색 및 편도선 조직 블록, 주황색은 인플루엔자 A 바이러스, IAV로 24시간 동안 자극되었다. IFN 생산은 TMC에서 검출되었지만 조직 이질이 사이토카인 분비 및 세포 활성화에 대한 연구를 위한 최상의 모델이 아니라는 것을 나타내는 조직 블록의 상부에서는 검출되지 않았다.
독성 약물 C1과 사전 배양 후 R848을 자극, TMC및 PBMC는 생존가능성을 위해 분석되었다. TMC는 C1에 더 민감했습니다. 이것은 미래 처리에 있는 새로운 약이 세포주, PBMC, 또는 조직 이식에 뿐 아니라 조직에서 세포에서 시험되어야 한다는 것을 건의합니다. 이 절차는 우리가 전혈에서 PBMC와 같은 TMC를 사용하고 특정 세포 모형의 정화와 같은 동일 세포 실험을 능력을 발휘하는 것을 허용합니다, 세포 배양, 유동 세포측정 또는 동결.
TMC의 격리는 점막 면역을 관련시키는 병리에서 이차 림프구기관에서 관련 모형, 면역 반응을 더 잘 특성화하는 가능하게 합니다.
