제브라피시 유충에서 이광자 레이저 절제 접근법을 사용한 뼈 재생의 생물학 연구

먼저, 형질전환 유충을 유리 바닥 마이크로웰 접시에 넣고 저융하는 아가로스에 넣습니다. 접시를 현미경 s에 놓습니다.tage 도립 현미경에서. 시야의 중앙에서 절제를 위해 원하는 영역을 배치하고 초점을 맞춥니다.

Z 스택 설정을 선택하여 오퍼클의 전체 너비를 이미지화합니다. 절제 전에 관심 영역을 이미지화합니다. 그런 다음 선택한 2D 평면에 지름이 25마이크로미터인 원형 영역을 그립니다.

관심 영역(region of interest) 또는 ROI 도구를 사용하여 작업에 초점을 맞춥니다. 절제를 수행하려면 목표 없이 측정한 절제 전력을 450초 동안 10밀리와트까지 적용합니다. 선택한 영역을 이광자 레이저에 노출시킵니다.

절제 후에는 절제 전에 사용한 것과 동일한 설정으로 동일한 Z-stack을 이미징하여 절제를 구조적으로 확인합니다. 겸자나 해개 바늘을 사용하여 잘 녹지 않는 아가로스에서 유충을 조심스럽게 제거합니다. 먼저 유충을 덮고 있는 아가로스 층을 제거합니다.

둘째, 유충과 직접 접촉하는 아가로스를 제거합니다. 유충을 순수한 E3 배지가 있는 접시에 다시 넣습니다. 병변 발생 후 4시간 또는 6시간이 지나면 동일한 현미경에서 동일한 설정으로 아가로스에 매립된 유충을 사용하여 수술 부위를 다시 이미지화합니다.

피지에서 이미지를 처리한 후 핵 라벨로 세포를 정량화하거나 세포가 겹치는 경우 면적을 측정하여 세포를 정량화합니다. 면적을 정량화하려면 대식세포를 둘러싸는 마스크를 만듭니다. 이미지, 조정, 임계값 도구를 사용하여 ROI를 생성하고 입자를 분석합니다.

그런 다음 면적을 측정합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정 결과를 플로팅하는 그래프를 생성합니다. 절제된 수술 부위에 대식세포가 상당히 축적되어 있는 것이 수정 후 6일 후의 유충에서 절제 6시간 후에 감지되었습니다.

수정 후 4일이 지난 유충에서는 병변 발생 후 4시간에 대식세포의 수가 증가했습니다. 대식세포의 수와 면적은 절제되지 않은 상태에 비해 병변 발생 후 4시간에 증가했다.