연구는 웰컴 트러스트와 수막염 영국에 의해 투자되었다. HBMEC 세포 라인은 박사 KS 김에 의해 제공되었다. 공촛점 이미징 및 전자 현미경은 울프슨의 Bioimaging 시설, 브리스톨 대학에서 수행되었다. 우리는 또한 그들의 도움과 조언을 미스터 앨런 리어드 박사 마크 젭슨 (브리스톨 대학), 그리고 앨런 씨가 틸리 (PerkinElmer)을 감사드립니다.

1. Immunofluorescence 프로토콜 심는 감염 및 단백질 염색법 다음 절차는 적절한 안전 수준의 조직 문화와 미생물 실험실 시설을 필요로합니다. 1 일 감염 대상 세포의 A. 준비 <ol><li> 유리 coverslips 50 %의 합류 (~ 1.5x10 4 셀 / cm 2) (16mm 직경)에 씨앗 HBMECs은 12 잘 플레이트 (물론 3.8 cm이 성장 지역 /)에 배치. 성장 매체 : RPMI 1640는 15 %의 열 inactivated (56 ° C, 30 분) FBS, 2 MM의 글루타민, 1 MM 나트륨 pyruvate, 100 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % (V / V) 멤 아닌 필수 아미노산과 보충 지방산 솔루션, 1 % 멤 비타민 솔루션입니다. </li><li> 37 박 (O / N)를 통해 문화 ° C, 5 % CO 2 배양기 인치 </li></ol> B. 세균성 문화 <ol><li> 관심의 변형 성장을 37 10 % 온수 말 피가 보충에 필요한 매체 예 : 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에서 O / N (16-18 H) ° C 5 % CO 2 분위기 4인치 </li></ol> DAY 2 박테리아 (N. meningitidis) 정지 A. 준비 <ol><li> 10 μL 문화 루프를 사용하여, 2 ML PBSB (칼슘, 마그네슘과 PBS)에서 밤새 세균성 문화의 정지합니다. </li><li> 대형 박테리아 집계는 실온 (RT)에서 5 분 서 정지를 떠나하여 해결하도록 허용합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고, 멸균 튜브에 정지의 상위 1 ML (재고 inoculum)를 전송합니다. </li><li> 주식 inoculum에서 박테리아 숫자를 계산하려면, 0.1M NaOH에 1퍼센트 SDS의 1mL 볼륨을 포함하는 튜브에 aliquots (20-50 μL)을 추가하고 solubilise에 부드럽게 섞는다. </li><li> 260nm (A260)에서 흡광도를 결정하여 솔루션의 핵산 함량을 측정. 우리 손에 1에 해당하는 5x10의 A260 8 식민지가 단위를 형성 / ML (cfu / ML). 이것은, PBSB의 재고 inoculum의 dilutions 일련의 준비 한천 플레이트 위에 도금 및 O / N 부화 후 식민지를 세어 확인하실 수 있습니다. </li><li> 감염 매체의 재고 inoculum의 나누어지는을 희석 [(2 %를 보충 M199 decomplemented (56 ° C, 30 분) 정상적인 인간의 혈청 (NHS)] 대상 세포의 감염에 필요한 박테리아 밀도를 얻을 수 있습니다. <ol><li> 저희 연구실에서 대상 셀 당 200-300 박테리아의 감염 비율은 일상적으로 사용됩니다. </li></ol></li></ol> B. 셀 문화 감염 <ol><li> 항생제의 모든 흔적을 제거하는 행크의 중간과 교양 대상 세포를 3 회와 coverslips 씻으십시오. </li><li> 5% CO 2, 37 3 H 8 H에 대한 신선한 박테리아 suspensions (위에서 설명한) ° C와 세포를 감염. </li><li> 감염 기간의 끝에, 4 RT 또는 O / N에서 30-45 분 2 % paraformaldehyde 500 μL (PFA)에 PBS로 세포를 세 번 씻고 수정 ° C.를 <ol><li> 위에 표시된 농도와 시간에 Paraformaldehyde의 고정은 세균과 세포 형태학의 보존에 적합한 것으로 발견되었습니다. </li></ol></li><li> paraformaldehyde를 세척 후, 트리톤은 X - 100 10 분 PBS에 희석 0.1 %의 잠복기하여 paraformaldehyde - 고정 세포를 permeabilise. </li><li> PBS로 샘플을 3 번이나 씻으십시오. </li><li> 단백질 얼룩을 진행하거나, 또는 4 1% BSA / PBST O / N 500 μL의 시료를 남겨 ° C. </li></ol> 3 일 단백질 얼룩 세포내 박테리아 얼룩 다음과 같이 α - actinin은 적절한 기본 및 보조 항체의 사용에 의해 순차적으로 또는 동시에 수행할 수 있으며 모든 절차는 12 잘 접시에서 진행하실 수 있습니다. <ol><li> 3퍼센트 500 μL와 permeabilised 세포를 포함하는 coverslips를 차단 RT에서 30-60 분 BSA / PBST (PBS는 트리톤 X - 100 0.05 %를 포함) </li><li> PBS로 세척 후 12 잘 플레이트의 새로운 드리 웰 각 coverslip을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 박테리아와 α - actinin에 대한 기본 항체를 추가하며 coverslip의 표면을 커버하기 위해 신중하게 추가할 경우 coverslip 당 항체의 80 ~ 100 μL가 충분합니다. 실온에서 1 시간을위한 부화. <ol><li> 우리는 동시에 α - actinin (Abcam)에 대해 Neisseria meningitidis (연구소 - 사육) 및 마우스 단클론 항체 (mAb)에 대한 토끼 polyclonal 항혈청를 사용합니다. 어떤 실험에서, 안티 α - actinin 대신에, 굴지 또는 vimentin에 대한 mAbs는 (시그마) 사용되었습니다. </li></ol></li><li> 부화의 마지막에는, 잘하는 PBS 200 μL를 추가할 뉴 웰이 포함된 500 μL PBS에 coverslip과 장소를 리프트. </li><li> 5 분 후 pipetting으로 PBS를 제거한 다음 신선한 PBS를 추가합니다. 두 번 반복합니다. 에 coverslips을 전송새로운 드리 웰. </li><li> 어둠 속에서 1 시간을위한 RT에서 품어, 1% BSA / PBST에 희석 다른 fluorochromes하는 복합 적절한 보조 항체를 추가합니다. <ol><li> 세균 검출을 위해 우리가 TRITC에 복합 백신 토끼 IG를 사용하고 α - actinin 및 기타 cytoskeletal 단백질 감지, 우리가 복합 백신 마우스 IG를 사용 중 FITC - (시그마) 또는 알렉사 플루어 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> 부화의 끝에, 4 단계와 5 단계에로 씻으십시오. </li><li> 어둠 속에서 RT에서 5 분 0.6 μg / PBS에 ML DAPI (DNA가 얼룩)와 얼룩 카운터. </li><li> PBS와 린스. </li><li> 장착 매체의 한 방울과 함께 슬라이드 (E, G. Mowiol 또는 Vectashield)에 마운트 coverslips (세포가 아래로 향하게) </li><li> 4 어둠 속에 보관 ° C. </li><li> 샘플은 현미경 관찰을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 관찰하고 세포내 세균 및 cytoskeletal 요소의 이미지를 캡처하려면, 우리는 Leica DM I6000 거꾸로 epifluorescence 현미경에 부착된 Leica SP5 - AOBS 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 immunolabelled 샘플 촬영된 이미지를 사용합니다. 모든 이미지는 Leica 소프트웨어와 63x NA 1.4 기름 침지 객관적이고 공정을 사용하여 수집되었습니다. CLSM 절차 : <ol><li> CLSM 절차를 시작하려면 목표에 침지 기름 한 방울을 추가하고 현미경 단계에 표본 슬라이드를 coverslip 측 다운 놓으십시오. </li><li> 비주얼 모드로 현미경을 설정하고 현미경의 눈 조각을 사용하여 관심 영역을 찾습니다. </li><li> Leica 소프트웨어를 사용하여 XYZ 수집 모드를 선택합니다. </li><li> 512 X 512 포맷 (프레임 크기)를 선택합니다. colocalisation 연구 들어, 높은 해상도, 더 정확한 이미지, 마음의 현미경의 해상도 제한을 유지. 다음 스캔 속도를 높일 수 양방향 X 모드를 선택하고, 사진 표백을 줄일 도움이됩니다. </li><li> 순차 스캔 설정을 설정할 수 있습니다. &quot;seq&quot;기능을 클릭하여 스캔 모드 중 하나를 선택합니다. 우리는 모드 &quot;라인 사이&quot;를 사용합니다. </li><li> DAPI (파란색), TRITC에 대한 알렉사 플루어 488 (녹색)와 561 nm의 (적색)에 대한 488 nm의에 대한 405 NM : 선택 레이저 보조 항체에 복합 fluorochromes에 따라 들보. Photomultiplier 튜브 (PMT) 각각 1, 2, 3, 활성화. 올바른 방출 파장을 감지하는 PMT 설정을 조정합니다. </li><li> Z - 스택 또는 일련의 상단 ( &quot;시작&quot;)와 바닥 ( &quot;종료&quot;) 설정합니다. 다음, 필요한 &quot;Z - 단계 크기&quot;를 설정합니다. <ol><li> Neisseria meningitidis는 diplococcus (그림 1G)입니다 각 구균은 0.5 μm의의 대략적인 지름을 가지고 있기 때문에, 0.20 μm의의 Z - 단계 크기는 적어도 두 번은 각 구균 스캔의 확률을 향상시키기 위해 선정되었습니다. 0.2 μm의 - 그것은 0.1의 최적 해상도를위한 단계 크기 이내에 있습니다. </li></ol></li><li> 노이즈 비율로 신호를 향상시키기 위해 3 라인 평균을 선택하여 최종 검사 매개 변수를 설정합니다. </li><li> &quot;시작&quot;을 클릭하여 이중 또는 삼중 묻은 이미지는 다른 chromophores 간의 상호 대화를 제거하는 다른 파장의 연속적인 스캔하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 이 fluorochromes의 colocalisation의 표시 들어, 하나의 이미지로 선택한 채널을 병합하려면 &#39;오버레이&#39;기능을 선택합니다 예를 들어, 알렉사 488 (녹색) 및 TRITC (적색) fluorochromes 모두 colocalise 때 노란 색깔은 중첩 이미지에 나타납니다 . </li><li> 가능한 colocalisation를 시각화에 필요한 2D 이미지의 건설을위한 &quot;최대 프로젝션&quot;기능을 이용하여 Z - 스택 또는 시리즈를 컴파일합니다. colocalisation의 더 자세한 분석은 각 광학 부분의 분석에 의해 얻을 수 있습니다. </li><li> Z - 스택 또는 시리즈를 인수 후, 다양한 요소의 세포 지방화 (그림 1E)의 시각화를위한 직교 이미지를 얻기 위해 데이터를 처리합니다. </li></ol> 3. Colocalisation의 부량 공촛점 스캐닝 현미경 이미지의 통계 분석은 Volocity 소프트웨어 (순발력, PerkinElmer)로 수행됩니다. 이 소프트웨어는 멘더스 외. (1993) 5 설명된 colocalisation 분석을 위해 특별히 설계된 도구를 제공합니다. 디지털 형광 이미징의 맥락에서 Colocalisation는 각 채널에 동일한 voxel (픽셀 볼륨) 위치에서 신호의 검출이라고 할 수 있습니다. 두 채널은 동일한 샘플 영역 (Volocity 사용자 가이드)에서 촬영한 두 가지 fluorochromes의 이미지들로 만들어집니다. 통계 분석은 아래에서 설명 양적 Colocalisation 분석을 사용하여 Volocity 소프트웨어 (순발력, PerkinElmer)로 수행됩니다. 양적 Colocalisation 분석 <ol><li> Volocity 소프트웨어를 사용 CLSM 이미지와 라이브러리를 만듭니다. </li><li> 메뉴 표시줄에있는 이미지에서 &quot;확장 포커스&quot;를 선택하십시오. 이 도구는 분석하는 2D 이미지에서 Z - 스택을 컴파일. </li><li> &quot;Colocalization&quot;도구를 선택합니다. 분석하는 두 채널은 같은 색 농도가 있어야합니다. </li><li> 그것이 계량 될되는 영역을 선택합니다. 어떤 배경을 제거하는 임계값을 설정합니다. </li><li> &quot;colocalization를 생성합니다&quot;를 선택하여 colocalisation 출력을 만듭니다. Colocalisation 통계는 이전에 다음 ID로 선택한 관심 지역에 대해 생성됩니다. </li><li> 선택 멘더스 &#39;계수 R (계수를 중복)와 내 (colocalisation 계수). <ol><li> 멘더스 &#39;계수들은 총 픽셀 강도에 대한 표준 있으므로 얼룩의 강도로 구분하지 않습니다, 따라서 그들은 한 항원의 얼룩은 다른보다 강력한 경우 고용 수 있습니다. </li><li> 멘더스 5,6에 따라 계수 R을 중복하는 것은 colocalisation의 진정한 정도를 나타내는 픽셀의 총 개수와 비교 colocalise 픽셀의 수를 즉. </li><li> 반면에, colocalisation 계수, 내이 덜 풍부한 잔기 (이 경우 세균에 빨간색)에 더 풍부한 잔기 (이 경우 α - actinin, 녹색)의 형광 기여를 설명, 빨간색 픽셀의 수를 즉, 그 빨간 픽셀의 총 개수와 비교 녹색 픽셀과 중복됩니다. </li><li> 멘더스 &#39;계수 1 높은 colocalisation, 0중인 없음 있기 때문에 1과 0 사이의 범위,하지만 그들은 쉽게 해석에 대한 비율로 표현할 수있다. </li></ol></li><li> 데이터를 프레 젠 테이션을위한 Excel 문서로 내보내기 통계 값. </li></ol> 4. 대표 결과 OPC - Neisseria meningitidis 표현과 α - actinin의 세포내 현지화 으로 α - actinin과 (표시되지) 3 H 감염 실험에 덜 자주하는 등장 NM의 표시 colocalisation 위에서 설명한 3 8 시간 NM에 감염된 인간의 두뇌 microvascular 내피 세포의 공촛점 이미징 8 H에 대한 감염 문화에 비해 ( 그림 1 AF). OPC - 표현 meningococci과 α - actinin의 논증할 수있는 colocalisation는&gt; 5 복제 실험에서 각 시간을 관찰했다. 위에서 설명한 여러 공촛점 이미지를 사용 colocalisation의 통계 분석이 수행되었다. 전체 HBMEC에서 OPC - 표현 meningococci를 더 그린 (α - actinin)과 빨간색 (NM) 픽셀의&gt; 25 % 중복이 (그림 2B, 계수 R을 오버랩) 얻은 감염. vimentin은 희귀했다와 internalized 박테리아와 굴지이나 vimentin 중 하나의 라벨이 수행어진 α - actinin, 실험에 대조적으로, 가끔 colocalisation는 굴지과 함께하지만 그 관찰되었다 (Figure. 2B). 데이터는 또한 계정으로 각 잔기의 상대 풍부한 소요 계수 내를 사용하여 분석되었다. 내가 더 풍부한 신호 (이 경우 그린, α - actinin에서) 덜 풍부한 신호 (이 경우 빨강, 박테리아)를 발생 때마다 발생의 빈도를 측정하기위한 한 방법입니다. 이 법안은 internalized meningococci (그림 2A 및 C)의 주변에 α - actinin의 발생의 인상 수준을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. N.의 세포 상호 작용을 평가하기 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 α - actinin과 meningitidis. AH. coverslips에 성장 콘플루앙 내피 monolayers는 OPC - 표현 (AF) N. 감염된 meningitidis. 8 H 후, 비 점착 성의 박테리아를 씻어 있었다 전지 paraformaldehyde로 고정하고 0.1 % 트리톤 X - 100 permeabilised. 위에서 설명한 후, 박테리아와 α - actinin은 (; 세균, 빨강, α - actinin, 녹색) 스테인드되었습니다. AC. NM (A) 또는 α - actinin (B)의 위치의 XY 이미지를 보여주는 한 분야. (C)의 오버레이 이미지가 노란색 오렌지색 색상 colocalisation을 제안 나타나는 몇 가지 영역을 나타냅니다. 에서 화살표 (A)와 (B) α - actinin의 축적의 높은 수준은 세균 주위에 발생했을 것으로 보인다 영역을 보여줍니다. 세포의 기지에 위치한 세포내 세균 주위에 감염된 HBMEC의 monolayer 표시 colocalisation의 D. 광학 해부. 일반적인이 지역의 α - actinin의 얼룩으로 다시이 colocalisation 낮은이며, α - actinin의 사고로 인해 근접하지 않습니다. 위와 같이 처리 감염된 HBMEC monolayers의 E와 F.는 3 차원 이미지를 표시합니다. 혀끝의 표면 (E)의 경사보기 자기편 박테리아를 보여줍니다 스테인드 빨간색 (적색 화살표) 내피 세포 (노란색 화살표)의 기저 표면을 향해있는 몇몇 박테리아가 독특한 오렌지 / 색상 노란색 반면. 기초 위치가 좀 더 명확하게 (F) 어떤이 최종에 XZ 단면이다에서 볼 수 있습니다. G. N.의 부정적인 스테인드 전자 현미경 이미지 그것을 보여주는 meningitidis에서 주된 diplococcal. 각 구균은 직경 약 0.5 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. HBMEC 세포에 Localisation과 α - actinin, 굴지과 vimentin의 배포. 위의 전설에서 설명한지만, α - actinin 이외에, 일부 coverslips가 α - actinin에 대해 비슷한 절차에 의해 굴지이나 vimentin의 검출에 사용되는 것처럼 HBMEC의 A. 감염된 monolayers이 치료되었습니다. 위와 같이, α - actinin 여러 internalized 박테리아 (흰색 화살표) 주위 집중. Vimentin과 굴지는 감지할 수있을 정도의 수준으로 박테리아와 colocalise하지 않았다. 바 20 μm의를 나타냅니다. 계수 R과 나의위한 B. &amp; C. 값은 위에서 설명한 Volocity 소프트웨어를 사용하여 3 개 실험에서 얻은되었습니다.

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	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

의 결합의 가능성 internalized OPC - α - actinin 표현하는 Neisseria meningitidis의 것은 박테리아의 colocalisation의 심사 3과 8 H의 잠복기 후 감염된 세포에서 cytoskeletal 단백질에 의해 HBMEC를 사용하여 탐색했다. 공촛점 현미경으로, α - actinin과 Neisseria meningitidis의 colocalisation은 증명 수 있습니다. 세균은 3 H에 internalized 있었지만 특히,이 시점에서 α - actinin과 작은 colocalisation있었습니다. cytoskeletal 단백질과 박테리아 협회 8 H 감염 기간이 지나면 같은 세포내 체류 긴 기간을 필요로 나타나, 세균의 큰 숫자는 가까운 협회에서 분명히 α - actinin했다. 알파 actinin은 다기능 단백질이며, cytoskeletal 요소 세균 상호 작용은 현재 연구 주제는 대상 세포 기능에 중요한 영향을 수 있습니다. 위에서 설명한대로 colocalisation의 부량는 세심한 표본 준비가 필요합니다. 특히주의가 기간 및 항체 dilutions을 차단, 표본의 고정 부여해야합니다. 노이즈 비율 가장 좋은 신호를 각 주 및 보조 항체가 최적 농도를 결정하는 예비 실험에서 titrated해야합니다. 우리의 경험에서 장착 중간 Mowiol 더 나은 이미지를 생산.

1. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) : Leica SP5 공촛점 이미징 시스템 :이 시스템, AOTF의 조합 (음향 광학 필터 tuneable)과 AOBS (음향 광학 빔 스플리터)를 사용하여이 특정 파장과 함께 여기를 단순화합니다. 2 - 소프트웨어 : Leica 공촛점 소프트웨어 LCS, Leica 이크로 시스템즈, 독일. Volocity 5, 순발력, PerkinElmer, 미국.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

Neisseria meningitidis (NM, 수막염)의 OPC 단백질은 adhesin 인간 상피 및 내피 세포에 대한 효과적인 invasin 역할을 수있는 표면 표현 적분 외부 막 단백질이다. 우리는 OPC와 같은 vitronectin으로 인테 그린의 리간드 먼저 바인딩하는 OPC을 요구하는 과정을 주요 수용체로 이들에게 휴대 표현 수용체 하나를 통해 내피 표면에 위치한 integrins을 확인했습니다. 이 과정은 내피 세포의 세균 침입이 발생합니다. 최근, 우리는 인간의 세포 3 전체 세포 lysates에서 찾을 100kDa 단백질과 OPC의 상호 작용을 관찰했다. 숙주 세포의 단백질은 전기 영동에 의해 분리하고 nitrocellulose에 blotted OPC - NM 표현과 중첩했을 때 우리는 처음이 상호 작용을 관찰했다. 상호 작용은 직접했고 중간 분자를 포함하지 않았다. 질량 분광법으로, 우리는 α - actinin로 단백질의 신원을 만들었습니다. 어떤 표면이 표현 없기 때문에 α - actinin은 검사 8 셀 라인의 어느 발견하고, 대상 세포에 세균 항목으로 혈청 리드의 면전에서 내피 세포와 OPC의 상호 작용으로, 우리는 intracellularly 상호 작용하는 두 단백질의 가능성을 조사했다. 이를 위해, 교양 인간의 두뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)는 OPC - 표현 연장 기간과 internalized 세균과 α - actinin의 위치에 대한 NM 것은 공촛점 현미경으로 검사되었습니다에 감염되었습니다. 우리는 박테리아 internalisation의 여덟 시간 동안 후 상당한 있었던 cytoskeletal 단백질과 NM의 colocalisation 시간 종속적인 증가를 관찰했다. 또한, 양적 이미징 소프트웨어의 사용은 우리가 α - actinin 및 기타 cytoskeletal 단백질과 NM의 colocalisation의 상대적인 측정을 얻을 수있었습니다. 절차는 또한 인간의 상피 세포에 적용할 수 있지만 여기서 우리는, 시각화 인간 내피 세포로 세균 입국 후 세포내 단백질과 세균의 colocalisation의 부량을위한 프로토콜을 제시한다.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis</em공촛점 이미징에 의해 α - actinin>과 인간

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K 조회수.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

연구

면역학 및 감염병학

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

새로운 박테리아 특정의 광학 검사 Confocal 레이저 Endomicroscopy에 의해 전 비보 인간의 폐 조직에 프로브

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis과 인간