단일 반점 이미징 및 견인력 현미경의 결합 분석은 성장 콘 사전 및 탐색을 위해 분자 기계를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 시판되는 재료와 표준 현미경을 사용한다. 연구원은 말 그대로 그들의 연구 결과에 있는 기술에 적응할 수 있습니다.
테트라메틸 로다민 또는 TMR 리간드로 뉴런을 체외 3에서 1~2000의 배양 배지에서 희석하여 치료하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 1 시간 동안 5 %의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 뉴런을 유지합니다. 인큐베이션 후, 사전 따뜻하게 된 PBS로 TMR 리간드를 세 번 씻으시다.
온난한 라이보비츠의 L-15 배지를 뉴런에 추가하기 전에 PBS를 제거하십시오. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 뉴런을 유지하십시오. 다음으로, 상피 성약 현미경을 켜고 상태 최고 인큐베이터를 섭씨 37도로 설정합니다.
그런 다음 TMR 리간드 처리 된 뉴런을 따뜻한 스테이지 상단 인큐베이터에 유리 바닥 접시에 놓습니다. Lifeact 및 HaloTag 액틴 형광 채널의 노출 시간을 500밀리초로 설정하고 50프레임에 대해 3초 간격으로 픽셀당 0.065 미크론으로 비닝합니다. 라이프액트와 주간을 강하게 표현하는 성장 콘을 선택한 후 HaloTag-actin을 표현합니다.
다이어프램의 필드를 닫아 성장 콘을 포함하는 최소 영역을 조명하고 시간 경과 이미지를 수집합니다. 시험관 내 3일, 배양 배지를 따뜻한 라이보비츠L-15 배지의 0.5 밀리리터로 대체하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 뉴런을 유지한다. 견인력 현미경검사의 경우 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켜고 스테이지 상단 인큐베이터를 섭씨 37도로 설정합니다.
미리 경고된 스테이지 상단 인큐베이터에 유리 바닥 접시에 뉴런을 놓습니다. 메뉴 스크립트에 설명된 바와 같이 이미지 수집 매개변수를 설정하고 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP를 강력하게 표현하는 성장 콘을 선택합니다. 젤 표면에 초점을 맞추고 시간 경과 이미지를 수집합니다.
완료되면 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 단일 채널 시간 경과 RGB 이미지 스택을 생성합니다. 그런 다음 이미지를 티프 파일로 저장합니다. 다음으로, 증류수에 용해된 도데실 황산나트륨 또는 SDS에 100마이크로리터를 적용하여 기판에서 뉴런을 방출하여 젤 기판을 이완한다.
그런 다음 스테이지 상단 인큐베이터에서 온도를 안정시키기 위해 섭씨 37도에서 5분 동안 접시를 배양합니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서, 훈련되지 않은 기판에서 구슬의 이미지를 얻기 위해 젤 표면에 초점을 맞춥니다. 훈련되지 않은 기판에서 구슬의 단일 채널 RGB 이미지를 생성하고 이 이미지를 티프 파일로 저장합니다.
견인력 분석 코드 TFM2021을 다운로드하고 MATLAB에서 TFM2021을 엽니다. 메인 을 엽니 다. TFM2021에서 m을 실행하고 실행합니다.
그래픽 사용자 인터페이스가 화면에 나타나면 됩니다. 훈련되지 않은 하중을 클릭하고 훈련되지 않은 기판에서 비린도의 비드 이미지를 수정한 X-Y 위치를 선택합니다. 형광 비드 이미지를 로드하고 이미지 구슬의 시간 경과 스택을 선택합니다.
그런 다음 로드 밝은 필드 이미지를 클릭하여 밝은 필드의 시간 경과 스택 이미지를 선택하고 로드 GFP 이미지를 사용하여 EGFP의 시간 경과 스택 이미지를 선택합니다. 그래픽 사용자 인터페이스의 드롭다운 목록에서 표시된 셀 이미지의 두 점을 클릭하여 성장 콘을 포함한 관심 사각형 영역을 지정하기 위해 ROI를 클릭하기 전에 GFP를 선택합니다. 일단 그래픽 사용자 인터페이스의 저장 버튼을 클릭하면 선택한 스택 이미지를 매트 파일에 ROI와 함께 저장합니다.
다음으로 대화 상자에 원하는 값을 감지하고 입력하여 비드 감지임계값을 결정합니다. 계산을 시작 괜찮아. 계산을 마친 후 플롯 트랙을 클릭하여 이전에 선택한 영역을 확대하고 감지된 구슬을 흰색 점으로 표시합니다.
선택 구슬을 사용하여 성장 콘 아래에 올바른 점을 포함하는 다각형 영역을 구분합니다. 그런 다음 키보드에 입력을 누르면 다각형 영역 내의 흰색 점이 빨간색으로 변경됩니다. 그래픽 사용자 인터페이스에서 추정 힘을 클릭합니다.
그런 다음 원고에 설명된 픽셀 크기와 영의 계수에 대한 입력 값을 입력합니다. 푸아송 비율에 대한 값을 0.3으로 넣고 계산을 시작하려면 추정 힘을 실행합니다. 소프트웨어는 스프레드시트 형식 파일에 계산 결과를 저장합니다.
뉴런 성장 콘의 형광 이미지는 완전히 개방적이고 좁은 다이어프램 하에서 성장 콘 형태의 시각화를 허용하는 높은 Lifeact 표현을 보였다. HaloTag-actin 발현 수준은 희미한 신호로 매우 낮았습니다. 다이어프램이 적절하게 좁아지면 배경 신호가 감소하고 반점에 있는 단일 행위가 성장 콘에 나타납니다.
적절하게 모든 단계를 달성 연구원은 성장 콘에서 F-actin 역행 흐름을 관찰합니다. 폴리아크릴아미드 겔의 강성은 마이크로피어의 무게로 인한 들여쓰기의 깊이를 계산하여 결정되었다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 젤 표면과 마이크로 피어의 바닥의 이미지를 캡처하는 데 사용되었다.
형광 구슬의 신호는 들여쓰기 된 영역의 젤 표면에서 보이지 않았다. 폴리아크릴아미드 젤과 신경 성장 콘에 내장된 구슬의 형광 이미지는 구슬의 원점에서 구슬을 나타내고 변위된 위치를 보였다. 성장 콘의 EGFP 신호도 관찰되었다.
키모그래프는 참조 비드에 비해 비드의 움직임을 표시했다. 단일 반점 이미징을 수행 할 때, 중요한 것은 주간 두 개의 최소 영역 에서 액트인하는 방법을 표현하는 뉴런을 선택합니다. 견인력 현미경 검사를 수행할 때, 높은 배율 이미징은 정확한 견인력 의 농도에 중요합니다.
