원고에 대한 피드백을 주신 Javierre 연구실의 나머지 구성원들에게 감사드립니다. 제도적 지원을 해주신 CERCA 프로그램, Generalitat de Catalunya 및 Josep Carreras Foundation에 감사드립니다. 이 연구는 FEDER/스페인 과학혁신부(RTI2018-094788-A-I00), 유럽 혈액학 협회(4823998) 및 스페인 암 퇴치 협회(AECC) LABAE21981JAVI의 자금 지원을 받았습니다. BMJ는 La Caixa Banking Foundation Junior Leader 프로젝트(LCF/BQ/PI19/11690001)에서 자금을 지원하고, LR은 AGAUR FI 펠로우십(2019FI-B00017)에서 자금을 지원하며, LT-D는 FPI Fellowship(PRE2019-088005)에서 자금을 지원합니다. Universitat Autònoma de Barcelona의 생화학 및 분자 생물학 박사 과정의 지원에 감사드립니다. 자금 제공자 중 누구도 실험 설계나 원고 작성의 어느 시점에도 관여하지 않았습니다.

희소한 세포에서 프로모터 상호작용체를 연구하기 위한 포괄적인 접근법

저자는 공개 할 것이 없습니다.

liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 프레임워크를 사용하지만 세포 수가 크게 감소한 고분해능 프로모터 상호작용체 라이브러리를 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 이것은 페놀 정제 및 비오틴 제거와 같은 불필요한 단계를 제거함으로써 크게 달성됩니다. 고전적인 핵 내 결찰 Hi-C 프로토콜57 및 후속 파생 기술인 PCHi-C에서, 비오틴은 나중에 정보가 없는 DNA 단편을 끌어내리는 것을 ?...

시간적 유전자 발현은 세포 분화와 궁극적으로 유기체 발달을 유도하며, 그 변화는 광범위한 질병 1,2,3,4,5와 밀접한 관련이 있습니다. 유전자 전사는 조절 요소의 작용에 의해 미세하게 조절되며, 이는 근위부(즉, 유전자 프로모터) 및 원위부(예: 인핸서 또는 소음기)로 분류될 수 있으며, 후자는 종종 표적 유전자로부터 멀리 떨어져 있고 유전자 발현을 조절하기 위해 염색질 루핑을 통해 물리적으로 상호작용합니다 6,7,8.
게놈에서 원위 조절 영역의 식별은 널리 합의된 문제인데, 이 영역은 특정 히스톤 변형 9,10,11을 포함하고 특정 전사 인자 인식 모티프를 포함하여 이들에 대한 모집 플랫폼 역할을 하기 때문입니다(12,13,14). 게다가, 인핸서(enhancers)와 수퍼-인핸서(super-enhancer)15,16의 경우, 이들은 또한 낮은 뉴클레오솜 점유(low-nucleosome occupancy)17,18를 가지며, 비-코딩 eRNAs(non-coding eRNA)로 전사된다(19,20).
그럼에도 불구하고 각 원위 조절 요소의 표적 유전자는 예측하기가 더 어렵습니다. 종종 원위 조절 요소와 표적 사이의 상호 작용은 세포 유형 및 자극 특이적이며21,22, 수백 킬로베이스에 걸쳐 있으며, 어떤 방향으로든 다른 유전자를 연결하고23,24,25 표적 유전자 또는 다른 비개입 유전자의 인트로닉 영역 내부에 위치할 수도 있습니다26,27. 또한, 원위 조절 요소는 동시에 하나 이상의 유전자를 제어 할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다28,29. 이러한 위치 복잡성은 이들 사이의 조절 연관성을 정확히 찾아내는 것을 방해하므로 모든 세포 유형에서 각 조절 요소의 표적 대부분은 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다.
최근 몇 년 동안 염색질 상호작용을 연구하기 위한 염색체 형태 포획(3C) 기술의 개발이 크게 붐을 일으켰습니다. 그 중 가장 널리 사용되는 Hi-C는 세포 게놈30의 모든 단편 사이의 모든 상호 작용에 대한 지도를 생성할 수 있습니다. 그러나 제한 단편 수준에서 중요한 상호 작용을 감지하기 위해 Hi-C는 초심층 시퀀싱에 의존하여 개별 유전자의 조절 환경을 일상적으로 연구하는 데 사용하는 것을 금지합니다. 이러한 경제적 한계를 극복하기 위해 ChIA-PET31, HiChIP 32 및 저투입 대응 HiCuT 33과 같은 여러 농축 기반3C 기술이 등장했습니다. 이러한 기술은 특정 단백질에 의해 매개되는 게놈 차원의 상호작용을 풍부하게 하기 위한 항체의 사용에 의존한다. 그럼에도 불구하고 이러한 3C 기술의 고유한 기능은 응용 프로그램의 골칫거리이기도 합니다. 사용자는 관심 단백질에 대한 고품질 항체의 가용성에 의존하며 단백질의 결합이 동적인 조건을 비교할 수 없습니다.
프로모터 캡쳐 Hi-C(PCHi-C)는 이러한 제한(34,35)을 우회하는 또 다른 농축 기반3C 기술이다. PCHi-C는 비오티닐화 RNA 프로브 농축 시스템을 사용하여 28,650개의 인간 또는 27,595개의 마우스 주석이 달린 유전자 프로모터(프로모터 상호작용이라고도 함)와 상호 작용하는 게놈 영역의 게놈 전체 고해상도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 활성 및 비활성 프로모터 모두의 제한 단편 수준 분해능에서 중요한 장거리 상호작용을 검출할 수 있으며, 히스톤 변형 또는 단백질 결합의 역학과 독립적으로 모든 조건 간의 프로모터 상호작용을 강력하게 비교할 수 있습니다. PCHi-C는 세포 분화 동안 프로모터 상호작용체 재구성을 확인하고(36,37), 전사 인자(38,39)의 작용 메커니즘을 확인하고, 비암호화 변이체(40,41,42,43,44,45)에 의해 질병에서 조절되지 않는 새로운 잠재적 유전자 및 경로를 발견하기 위해 최근 몇 년 동안 널리 사용되어 왔다.46,47,48, 새로운 드라이버 비암호화 돌연변이49,50과 함께. 게다가, 단지 포획 시스템을 수정함으로써, 이 기술은 임의의 상호작용체(예를 들어, 인핸서 상호작용체(51) 또는 비-코딩 변경들의 집합체의 상호작용체(41, 52))를 조사하기 위해 생물학적 질문에 따라 맞춤화될 수 있다.
그러나 PCHi-C는 이 기술을 수행하기 위해 최소 2천만 개의 세포에 의존하므로 발달 생물학 및 임상 응용 분야에서 자주 사용되는 것과 같은 희소한 세포 집단에 대한 연구를 방해합니다. 이러한 이유로 우리는 낮은 셀 입력으로 고분해능 프로모터 상호 작용을 생성하기 위해 PCHi-C의 실험적 프레임워크를 기반으로 하는 새로운 비용 효율적이고 사용자 정의 가능한 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 개발했습니다. 최소한의 튜브 변경으로 실험을 수행하고, 원래의 PCHi-C 프로토콜에서 단계를 바꾸거나 제거하고, 반응 부피를 대폭 줄이고, 시약 농도를 수정함으로써 라이브러리 복잡성이 극대화되고 50,000개 이상의 세포로 고품질 라이브러리를 생성할 수 있습니다53.
낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)는 PCHi-C에 대해 벤치마킹되었으며 인간 조혈 세포 분화 동안 프로모터 상호작용 재배선을 밝히고, 비코딩 변경에 의해 조절되지 않는 잠재적인 새로운 질병 관련 유전자 및 경로를 발견하고, 염색체 이상을 감지하는 데 사용됩니다53. 단계별 프로토콜과 기술을 통한 다양한 품질 관리는 라이브러리의 최종 생성 및 계산 분석까지 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td>
			<td>Qiuantabio</td>
			<td>2302820</td>
			<td>For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters and PCR primers for library amplification</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Bought as individual primers with PAGE purification for NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHiCAGO R package</td>
			<td>1.14.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanNGS beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CNGS-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U120A, U121A, U122A, U123A</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65602</td>
			<td>For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiCUP</td>
			<td>0.8.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention filter tips&#160;(10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L and 1000 &#181;L)</td>
			<td>ZeroTip</td>
			<td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>For sonication in section 6 (sonication)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3131M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers for quality controls</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips&#160;and caps</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>410022, 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531L</td>
			<td>For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) 
			and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td>For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutsmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS - Solution 10% for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect custom 3-5.9 Mb library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-4831</td>
			<td>Custom designed mouse or human capture system, used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-8645</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931107</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224025</td>
			<td>For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 2000000/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4200 instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow to study the promoter-centric spatio-temporal genome architecture in scarce cell populations

시공간 유전자 전사는 전사를 제어하기 위해 표적 유전자 프로모터와의 물리적 근접성에 의존하는 인핸서 및 소음기와 같은 원위 조절 요소에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이러한 조절 요소는 식별하기 쉽지만 대부분이 세포 유형에 특이적이며 선형 게놈 서열에서 수백 킬로베이스로 분리되어 다른 비표적 유전자를 건너뛰기 때문에 표적 유전자를 예측하기 어렵습니다. 수년 동안 Promoter Capture Hi-C(PCHi-C)는 원위 조절 요소를 표적 유전자에 결합시키는 데 있어 황금 표준이었습니다. 그러나 PCHi-C는 수백만 개의 세포 가용성에 의존하여 일차 조직에서 일반적으로 얻은 것과 같은 희귀 세포 집단에 대한 연구를 금지합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 게놈의 각 유전자를 제어하는 원위 조절 요소의 레퍼토리를 식별하는 비용 효율적이고 맞춤형 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)가 개발되었습니다. liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 및 계산 프레임워크에 의존하지만 최소한의 튜브 변경을 사용하고 시약 농도 및 부피를 수정하고 단계를 바꾸거나 제거함으로써 라이브러리 구성 중 재료 손실을 최소화합니다. 총체적으로, liCHi-C는 발달 생물학 및 세포 기능의 맥락에서 유전자 조절 및 시공간 게놈 조직의 연구를 가능하게 합니다.

Temporal gene expression drives cell differentiation and, ultimately, organism development, and its alteration is closely related to a wide plethora of diseases1,2,3,4,5. Gene transcription is finely regulated by the action of regulatory elements, which can be classified as proximal (i.e., gene promoters) and distal (e.g., enhancers or silencers), the latter of which are frequently located afar from their target genes and physically interact with them through chromatin looping to modulate gene expression6,7,8.
The identification of distal regulatory regions in the genome is a matter which is widely agreed upon, since these regions harbor specific histone modifications9,10,11 and contain specific transcription factor recognition motifs, acting as recruiting platforms for them12,13,14. Besides, in the case of enhancers and super-enhancers15,16, they also have low-nucleosome occupancy17,18 and are transcribed into non-coding eRNAs19,20.
Nonetheless, each distal regulatory element&#39;s target genes are more difficult to predict. More often than not, interactions between distal regulatory elements and their targets are cell-type and stimulus specific21,22, span hundreds of kilobases, bridging over other genes in any direction23,24,25, and can even be located inside intronic regions of their target gene or other non-intervening genes26,27. Furthermore, distal regulatory elements can also control more than one gene at the same time, and vice versa28,29. This positional complexity hinders pinpointing regulatory associations between them, and therefore, most of each regulatory element&#39;s targets in every cell type remain unknown.
During recent years, there has been a significant boom in the development of chromosome conformation capture (3C) techniques for studying chromatin interactions. The most widely used of them, Hi-C, allows to generate a map of all the interactions between every fragment of a cell&#39;s genome30. However, to detect significant interactions at the restriction fragment level, Hi-C relies on ultra-deep sequencing, prohibiting its use to routinely study the regulatory landscape of individual genes. To overcome this economic limitation, several enrichment-based 3C techniques have emerged, such as ChIA-PET31, HiChIP32, and its low-input counterpart HiCuT33. These techniques depend on the use of antibodies to enrich for genome-wide interactions mediated by a specific protein. Nonetheless, the unique feature of these 3C techniques is also the bane of their application; users count on the availability of high-quality antibodies for the protein of interest and cannot compare conditions in which the binding of the protein is dynamic.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) is another enrichment-based 3C technique that circumvents these limitations34,35. By employing a biotinylated RNA probe enrichment system, PCHi-C is able to generate genome-wide high-resolution libraries of genomic regions interacting with 28,650 human- or 27,595 mouse-annotated gene promoters, also known as the promoter interactome. This approach allows one to detect significant long-range interactions at the restriction fragment level resolution of both active and inactive promoters, and robustly compare promoter interactomes between any condition independently of the dynamics of histone modifications or protein binding. PCHi-C has been widely used over recent years to identify promoter interactome reorganizations during cell differentiation36,37, identify the mechanism of action of transcription factors38,39, and discover new potential genes and pathways deregulated in disease by non-coding variants40,41,42,43,44,45,46,47,48, alongside new driver non-coding mutations49,50. Besides, by just modifying the capture system, this technique can be customized according to the biological question to interrogate any interactome (e.g., the enhancer interactome51 or the interactome of a collection of non-coding alterations41,52).
However, PCHi-C relies on a minimum of 20 million cells to perform the technique, which prevents the study of scarce cell populations such as the ones often used in developmental biology and clinical applications. For this reason, we have developed low input Capture Hi-C (liCHi-C), a new cost-effective and customizable method based on the experimental framework of PCHi-C to generate high-resolution promoter interactomes with low-cell input. By performing the experiment with minimal tube changes, swapping or eliminating steps from the original PCHi-C protocol, drastically reducing reaction volumes, and modifying reagent concentrations, library complexity is maximized and it is possible to generate high-quality libraries with as little as 50,000 cells53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) has been benchmarked against PCHi-C and used to elucidate promoter interactome rewiring during human hematopoietic cell differentiation, discover potential new disease-associated genes and pathways deregulated by non-coding alterations, and detect chromosomal abnormalities53. The step-by-step protocol and the different quality controls through the technique are detailed here until the final generation of the libraries and their computational analysis.

저자 스포트라이트: 희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 아키텍처를 연구하기 위한 통합 워크플로우  

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

With liCHi-C, the main question that we are trying to answer is how the chromatin interacts in the nucleus, and therefore, to understand a new layer of gene regulation. We have proven with liCHi-C that we can explore the genome organization of a given sample, link the non-coding mutation associated with disease with potential genes affected, and detect chromosomal rearrangements, such as translocation, for example, in tumor samples. Now we can explore the 3D chromatin organization of scar cell types, such as primary stem cells or relevant clinical samples.Our protocol reduces the input materials and the time and cost needed to obtain quality data to explore the genome organization at the restriction fragment resolution. liCHi-C is expanding the reach of the 3D chromatin organization field, allowing us to explore new cell types previously impossible to analyze. Thanks to liCHi-C, the scientific community can explore the special regulation of gene expression.For example, in malignant transformation only in a specific clonal sub-population inside a tumor.

liCHi-C는 50,000 개의 세포로 고품질의 게놈 전체 프로모터 상호 작용체 라이브러리를 생성 할 수있는 가능성을 제공합니다53. 이는 반응 부피의 급격한 감소와 프로토콜 전반에 걸쳐 DNA 저결합 플라스틱 용기의 사용 외에도 상당한 재료 손실이 발생하는 원래 프로토콜에서 불필요한 단계를 제거함으로써 달성됩니다. 여기에는 탈가교 후 페놀 정제, 비오틴 제거, 후속 페놀-클로로?...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations at JoVE.com

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

liCHi-C를 사용하여 우리가 대답하려는 주요 질문은 염색질이 핵에서 어떻게 상호 작용하는지, 따라서 유전자 조절의 새로운 층을 이해하는 것입니다. 우리는 liCHi-C를 사용하여 주어진 샘플의 게놈 조직을 탐색하고, 질병과 관련된 비암호화 돌연변이를 영향을 받는 잠재적 유전자와 연결하고, 예를 들어 종양 샘플에서 전위와 같은 염색체 재배열을 감지할 수 있음을 입증했습니다. 이제 우리는 일차 줄기 세포 또는 관련 임상 샘플과 같은 반흔 세포 유형의 3D 염색질 조직을 탐색할 수 있습니다.우리의 프로토콜은 제한 단편 분해능에서 게놈 조직을 탐색하기 위해 양질의 데이터를 얻는 데 필요한 입력 자료와 시간 및 비용을 줄입니다. liCHi-C는 3D 염색질 조직 분야의 범위를 확장하여 이전에는 분석이 불가능했던 새로운 세포 유형을 탐색할 수 있게 되었습니다. liCHi-C 덕분에 과학계는 유전자 발현의 특별한 조절을 탐구 할 수 있습니다.예를 들어, 악성 형질전환에서는 종양 내부의 특정 클론 하위 집단에서만 발생합니다.

an-integrated-workflow-to-study-promoter-centric-spatio-temporal

Research

JoVE Journal

Genetics

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

968 조회수.  Josep Carreras Leukaemia Research Institute. liCHi-C를 사용하여 우리가 대답하려는 주요 질문은 염색질이 핵에서 어떻게 상호 작용하는지, 따라서 유전자 조절의 새로운 층을 이해하는 것입니다. 우리는 liCHi-C를 사용하여 주어진 샘플의 게놈 조직을 탐색하고, 질병과 관련된 비암호화 돌연변이를 영향을 받는 잠재적 유전자와 연결하고, 예를 들어 종양 샘플에서 전위와 같은 염색체 재배열을 감지할 수 있음을 입증했습?...

비디오: 저자 스포트라이트: 희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 아키텍처를 연구하기 위한 통합 워크플로우  

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

연구

유전학

Lysis and Digestion of Scarce Cells

To begin, take an aliquot of frozen scarce cells and add 1 milliliter of cold lysis buffer to disrupt the cell membrane. Incubate the cells on ice for 30 minutes, mixing by inversion every five minutes. Centrifuge the nuclei for 10 minutes at 1, 000 G.Remove the supernatant and re-suspend the nuclei in 500 microliters of cold 1.25X restriction buffer 2.Then add 5.5 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate, mix by vortexing and incubate in a thermo block. Then quench the SDS by adding 37.5 microliters of 10%Triton X-100. Mix and incubate the sample as demonstrated earlier.Add 7.5 microliters of Hind III to digest the chromatin mix the solution and incubate overnight at 37 degrees Celsius.

희소 세포의 용해 및 소화

Ligation and Decrosslinking of Scarce Cell DNA

To begin, take the digested scarce cell's DNA and place it on ice. Prepare a master mix by using the reagents required to fill in and biotinylate the restriction fragment overhangs. Incubate the sample at 37 degrees Celsius for 75 minutes, mixing by inversion every 15 minutes.Chill the sample on ice, and ligate the filled-in DNA ends by preparing a master mix using the reagents required for ligation. Finally, incubate the sample for four to six hours at 16 degrees Celsius, and then for 30 minutes at room temperature. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter of Proteinase K to decrosslink the chromatin.Mix the solution, and incubate overnight at 65 degrees Celsius.

희소 세포 DNA의 결찰 및 탈가교

Sonication and Biotin Pull-Down of Scarce Cells DNA

After purifying the DNA, begin by taking ligated and decross-linked digested chromatin of the scarce cells. Set the water bath sonicator at a duty factor of 20%peak incidence power of 50 to 200 cycles per burst for 65 seconds, and a temperature range of 6 to 10 degrees Celsius, and sonicate the ligated and decross-linked digested chromatin. After end repairing the sample, transfer 150 microliters of C1 streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter tube.Place them on a 1.5 milliliter tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. Next, wash the beads by adding 400 microliters of Tween buffer and resuspending them with soft vortexing.Place the tube back in the magnet until all the beads are stuck to the wall. Then remove the supernatant, leaving the beads behind. After resuspending the beads, in 300 microliters of 2X No-Tween buffer or NTB, combine them with the 300 microliters of the sample.Finally, incubate for 15 minutes rotating at room temperature to pull down the informative DNA fragments with biotin.

희소 세포 DNA의 초음파 처리 및 비오틴 풀다운

dATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA

DATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA  

To begin, take the scarce cell's DNA fragments pulled with biotin. Prepare a master mix by adding the reagents for dATP tailing and incubate the sample for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Then, inactivate Klenow exo-minus by incubating the sample for 10 minutes at 65 degrees Celsius and cooling it on ice.After washing the beads with 300 microliters each of TB, NTB, and 100 microliters of ligation buffer, resuspend them in 50 microliters of ligation buffer. Add four microliters of 15 micromolar pre-annealed adapter mix and one microliter of 2000 units per microliter T4 DNA ligase to the sample. Wash the beads with 400 microliters of TB, 200 microliters of NTB, and 100 microliters of restriction buffer two.After amplifying the library by PCR, pool all the 50 microliter reactions from the same sample into a 1.5 milliliter DNA low binding tube. Place it on a tube magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube and top up with TLE buffer to 500 microliters.To perform a double-sided selection using paramagnetic bead purification, add 200 microliters of stock beads to the library, mix by vortexing, and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Then, place the library on a magnet and wait until all the beads are stuck to the wall. Transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.Concentrate the beads by taking 750 microliters of stock beads and placing them in a 1.5 milliliter tube on a magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant and resuspend the beads by vortexing in 300 microliters of new stock beads. Add 300 microliters of concentrated beads to the sample.Mix by vortexing and incubate for 10 minutes, rotating at room temperature. Place on a magnet. Wait until all the beads are stuck to the wall and remove the supernatant.Wash the beads by adding one milliliter of 70%ethanol to the tube with the beads still on the magnet. Allow the beads to air dry and resuspend them in 21 microliters of TLE buffer by vortexing. To elute the library from the beads, incubate the sample for 10 minutes at 37 degrees Celsius in a thermoblock.Place the tube in a magnet and transfer the supernatant containing the library to a new 1.5 milliliter DNA low binding tube.

희소 세포 DNA의 dATP-tailing, 어댑터 결찰 및 PCR 증폭

Library Capture, Biotin Pull-Down, and PCR Amplification Using Scarce Cell DNA Library

Begin by taking 500 to 1000 nanograms of the scarce cell DNA library. Dry the DNA with a vacuum concentrator and resuspended it in 3.4 microliters of nuclease-free water. After adding the blockers, and while on the thermocycler, at 65 degrees Celsius, transfer the hybridization solution with the biotinylated RNA to the blocked library.After closing the tube lid firmly, incubate in the thermocycler overnight at 65 degrees Celsius. Then transfer 50 microliters of T1 Streptavidin beads per sample to a 1.5 milliliter DNA low binding tube and place them on a 1.5 milliliter tube magnet. Once all the beads are stuck to the wall, remove the supernatant leaving the beads behind.Now wash the beads thrice with 200 microliters of the binding buffer from the target enrichment kit and resuspend the beads in 200 microliters of binding buffer. Transfer the sample to the resuspended beads while on the thermocycler and incubate for 30 minutes. After washing the beads with 200 microliters of wash buffer 1, incubate them for 15 minutes, rotating at room temperature.Then wash the beads thrice with 200 microliters of wash buffer 2 heated to 65 degrees Celsius and incubate in a thermo block. Finally, after amplifying the library by PCR, perform a DNA purification using paramagnetic beads by adding 270 microliters of stock beads to the sample and mixing by vortexing. An automated electrophoresis profile from a library, just before capture, provided 49.7 nanograms per microliter of DNA in 20 microliters reaction volume.However, 3.06 nanograms per microliter of DNA is obtained from a high sensitivity automated electrophoresis profile from a finished leachic library.