국방부 (아이디어 상 W81XWH - 07-0406) - Ulus Atasoy로 NIH RO1 A1080870 - Ulus Atasoy로 NIH R21 A1079341 - Ulus Atasoy로 미주리 기관 자금 대학교 - Ulus Atasoy로

실험 준비 실험을 시작하기 전에, 모든 시약, 용기 및 주방기구 RNase 무료를하는 것이 중요합니다. DEPC - 처리 물과 린스 다음 RNase 억제제 (RNaseZAP, Ambion)로 유리를 취급합니다. 모든 시약은 RNase 무료로 확인되어 있는지 확인합니다. 1. mRNP Lysate 준비 <ol><li> 성장하고 각 RIP에 대한 총 단백질 2-5 밀리그램 사이에 생산하기 위해 기하 급수적으로 성장 조직 세포를 수확. <ol class="lalpha"><li> 두 P150 문화 요리는 일반적으로 충분합니다. </li><li> 각 RBP이 조사되는 경우, 총 세포 수와 단백질 양이 적절한 대상 mRNA와 RBP 상호 작용을 극대화하도록 최적화해야합니다. </li><li> qRT-PCR 분석을 위해 RIP는 특히 허, AUF1, TIAR와 같은 높은 풍부한 정보 RBPs위한 증폭 및 검출 방법에 의해 적은 세포 lysate를 (약 400 μg 총 단백질)이 필요할 수 있습니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 4에 8-10 분 ° C, 200 XG에서 원심 분리를 통해 펠릿 세포는 얼음 차가운 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 최종 세척 후, 부드럽게 RNase와 단백 분해 효소 억제제를 준비 polysom​​e 용해 완충액 (PLB)의 동일한 볼륨에 튜브의 바닥에 resuspend 세포 펠렛을 버려야지. <ol class="lalpha"><li> 그것은 세포 펠렛의 정확한 양을 측정하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 세포의 clumps을 분리 해제하고 5 분을 위해 얼음에 lysate을 배양하기 위해 조심스럽게 pipet 혼합 (소용돌이하지 않음). </li><li> 4에 20 분에 13,000 XG에서 원심 분리기 ° C 파편의 lysate을 취소 할 수 있습니다. </li><li> 즉시 미리 차가운 microfuge 튜브에 표면에 뜨는 삭제 전송할 수 있습니다. </li><li> -80에서 얼음과 저장소에 보관 ° C. <ol class="lalpha"><li> 즉시 냉동 세포의 적절한 용해를 완료하고 원치 않는 바인딩을 방지 할 수 있습니다. RIP 바로 아래의 예제 해동을 진행하고 RNA 저하를 방지하기 위해 얼음에 샘플을 보관. &lt;/ 리&gt; <li> 이 lysate는 -80에서 6 개월에 저장할 수 있습니다 ° C. 이 단백질 및 / 또는 mRNA 저하로 이어질 수 있으므로 반복 동결 해동 사이클을 피하십시오. </li></ol></li><li> 표준 브래드 포드 단백질 분석을 사용하여 lysate에서 단백질 농도를 Quantitate. </li></ol> 2. 항체 및 워시와 외투 단백질은 세 파로스 비즈 <ol><li> 5 % BSA와 NT2 버퍼 (3-4 권)에서 하룻밤 사전 훌륭한 단백질 세 파로스 (PAS) 구슬. 4 ° C.에 저장 <ol class="lalpha"><li> 4에 몇 개월까지 장기 저장 ° C 0.1 % 나트륨 azide와 보충하면 가능합니다. </li><li> 단백질 세 파로스 비즈는 대상 RBP 항체의 isotype에 따라 선택해야합니다. 단백질 A, G 및 A / G 모두는 특정 isotype 목표를 가지고 대상 선호도에 따라 다양합니다. 단백질 세 파로스 비즈는 허 단백질 항체 isotype에 대한 특이성과 친화력을 바탕으로 사용되었습니다. </li></ol></li><li> 사용하기 전에, 그래서 초과 NT2 버퍼를 제거버퍼 비율 최종 구슬 1:1입니다. </li><li> 1.5 ML RNAse 무료 microcentrifuge 튜브를 사용하여 PAS 슬러리 100 μl를 제거하고 각 개별 IP 반응 (즉, 특정 RBP 및 isotype 제어)에 대한 항체의 30 μg을 추가합니다. </li><li> 항체 구슬 믹스에 NT2 버퍼의 100-200 μl를 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> 혼합은 4에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다 ° C 0.1 % 나트륨 azide와 보충합니다. </li><li> 같은 종의 isotype 검색 항체 또는 전체 일반 커는 배경 RNA에 대한 항체 제어로 병렬로 사용되어야합니다. </li></ol></li><li> 구슬 조합에 적절한 항체를 추가하고 4시에 끝으로 끝을 텀블링​​, 하루 아침에 품다 ° C. <ol class="lalpha"><li> (항체 1, 5, 10 또는 30 μg 일반적으로 충분합니다) 조사중인 특정 단백질에 대한 항체 titer를 최적화 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 1 ML로 세척하여 바로 사용하기 전에 항체 코팅 구슬을 준비얼음처럼 차가운 NT2 버퍼 5 회입니다. <ol class="lalpha"><li> 4의 1-2 분 ° C.에 13,000 XG에서 원심 분리하여 구슬 믹스를 씻어 </li><li> 조심스럽게 손 pipettor 또는 흡인기로 supernantant의 최대 양을 제거하지만, 펠렛을 방해하지 않도록 할주의하십시오. </li><li> 세탁은 항체 혼합물로부터 언 바운드 항체뿐만 아니라 RNase의 오염 물질을 제거하는 데 도움이됩니다. </li></ol></li><li> 일단 최종 세척이 완료되었습니다, 100 MM의 40 U / μl, 10 μl의 RNase의 10 μl 출력을 포함하여 대상 mRNAs를 보호하기 위해 다양한 RNase 억제제 치료에 이어 얼음처럼 차가운 NT2 버퍼 700 μl의 구슬을 resuspend DTT, 15 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (15 ㎜). NT2 버퍼로 1,000 μl에 볼륨을 가져와. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl의 ribonucleoside 단지는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 억제 효과로 인해 사용되지 않습니다. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitation와 RNA 강수량 <ol><li> 선택 Preclear 단계 :<ol class="lalpha"><li> 배경을 줄이기 위해 구슬 및 제어 항체는 사전 투명한 lysate로 사용할 수 있습니다. 이 출력 신호를 줄일 수 있습니다. </li><li> 이 단계는 microarray 다음 IP을 수행 할 때 배경을 줄이기 위해 필요할 수 있습니다. 그것은 일반적으로 qRT-PCR 다음 IP에 대한 필요가 없습니다. </li><li> Preclear 30 분 / 4 끝 이상 ° C 텀블링 엔드에 대한 isotype 제어의 15 μg을 갖추고 있습니다. </li><li> 단계 2.1에서 항체와 비 코팅 preswollen PAS 비즈의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 마지막 30 분 / 4 ° C 회전 엔드와를 품다 </li><li> 4 ° C.에서 10,000 XG에 원심 분리기 IP에 대한 표면에 뜨는 저장합니다. </li></ol></li><li> 준비된 항체 믹스로 분리 해제 lysate (약 2-5 MG) 100 μl를 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> lysate를 Diluting 것은 배경 및 특이 현상 구속력을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. </li><li> lysate 입력 한 금액 검출 방법 및 RBP O의 풍부한에 따라 달라질 수 있습니다RBP 항체의 연구 효율은 단계 1.1.c.에 기록 </li></ol></li><li> (선택 사항) 즉시 부드럽게 4에 10,000 XG에서 간단한 원심 분리 한 다음 여러 번 flicking하여 튜브를 섞어 ° C 펠릿 구슬로 즉시 표준 RNA 절연 기술을 사용하여 qPCR 분석을위한 총 입력 mRNA 표현과 같은 표면에 뜨는 100 μl를 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 이 단계는 입력 lysate RNA는 IP에 대한 최적입니다 만 검사 단계 또는 가난한 RNA 결과 RIP에 따라 문제 해결 단계로 수행해야합니다 확인하기위한 것입니다. </li></ol></li><li> parafilm의 랩 튜브 끝으로 끝을 텀블링​​ 2 ~ 4 시간에 4에 꼭 씰링 및 배양 ° C를 보장합니다. <ol class="lalpha"><li> 부화에 타이밍을 대상 풍부에 따라 최적화되어야하며 복잡한 다시 정리하기 또는 저하를 방지하기 위해 최소화되어야한다. 일부 RBPs를 들어 짧은 incubations 더 최적의 수 있습니다. </li></ol></li><li> 5000 xgf의 펠릿 비즈또는 4에서 5 분 ° C와 서양 얼룩에 의해 잠재적 인 분석을 위해 표면에 뜨는 저장합니다. -80에서 저장 aliquots ° C. <ol class="lalpha"><li> 잔여 대상 단백질의 높은 양이있는 표면에 뜨는의 Aliquots는 세 파로스 구슬에 의해 유발되는 단백질의 실패를 나타낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이전에 설명한 바와 같이, 얼음처럼 차가운 NT2 버퍼와 원심 분리 1 ML과 비즈를 다섯 번 씻어 (4에서 5 분 5,000 XG ° C)가 손 pipettor 또는 흡인기로 표면에 뜨는 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 더 엄격한 세척 방법은 나트륨 deoxycholate, 우레아 또는 SDS와 NT2 버퍼를 보완하여 배경을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 얼음 최대한의 샘플을 유지하고 목표 mRNA의 저하를 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. </li></ol></li><li> 선택 사항 : 서양 얼룩 분석을 사용하여 대상 단백질의 IP 효율성을 확인을위한 비즈 믹스의 작은 나누어지는 (10 %)를 저장 또는 병렬로 추가 샘플을 실행합니다.</li></ol> 4. DNase와 Proteinase K 처리 <ol><li> 세척 후, NT2 버퍼 100 μl와 resuspend 구슬은 RNase 무료 DNase 1 (2 U / μl)의 5 μl를 보충. </li><li> 5-10 분 동안 37 ° C에서 보관. NT2 버퍼 1 ML을 추가하고 실온에서 1 분에 5,000 XG에 원심 분리기. <ol class="lalpha"><li> 구슬의 작은 (~ 10 %) 나누어지는이 SDS-PAGE 분석하여 IP 효율성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 100 μl NT2 버퍼, 5 μl Proteinase K (10 MG / ML), 및 1 μl 10% SDS에 Resuspend 펠릿 PAS. </li><li> 부드럽게 매 10 분에서 flicking, 55 ° C 물 목욕시 30 분에 resuspended 비드 혼합물을 품다. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K는 RNP 구성 요소의 릴리스에 도움이됩니다. </li></ol></li><li> 5 실온 (RT)에서 분, 표면에 뜨는 (~ 100 μl)를 수집 5,000 XG에서 펠렛의 구슬. </li><li> 구슬 200 μl NT2 버퍼 centri을 추가RT에서 2 분에 fuge 5,000 XG는 표면에 뜨는 (~ 200 μl) 및 폐기 비즈를 수집합니다. </li><li> supernatants (100 μl와 200 μl)을 결합하고 산 페놀-CHCl 3 300 μl 낮은 레이어를 추가합니다. </li><li> 소용돌이, 1 분 RT (또는 37 ° 흔드는에서 C) 및 1 분에 대한 RT에서 16,000 XG에서 원심 분리기. </li><li> 상부 층 250 μl (인터페이스를 방해하지 마십시오)을 수집, 산도 5.2 625 μl 백퍼센트 ETOH 5 μl glycoblue에 25 μl 나트륨 아세테이트를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> -20 ° C.에서 하루 아침에 저장 <ol class="lalpha"><li> RNA의 적절한 복구를 보장하기 위해 glycoblue의 추가는 캐리어 분자의 역할을하여 RNA 펠렛의 가시성을 높일 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음 날, 반전 3-5 배 혼합 튜브는 30 분 4에서 12,000 XG에서 스핀 ° C와 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 파란색 펠렛과 반전이나 vortexing하여 혼합에 70 % ETOH 1 ML을 추가합니다. </li><li> 2 분에 대해 4 ° C에서 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 디표면에 뜨는을 iscard와 4에서 1 분에 12,000 XG를 원심 분리기 ° C. </li><li> 5 분에 대한 RT에서 피펫, 공기 건조 펠릿과의 잔여 70 % ETOH를 제거합니다. </li><li> RNase / DNase 무료 물이나 필요에 따라 다른 적절한 양의 20-40 μl에 Resuspend. <ol class="lalpha"><li> 샘플는 현재 qRT-PCR 또는 microarray 등의 추가 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되었습니다. </li><li> Nanodrop 분광 광도법은 샘플 농도를 평가에 사용될 수 있지만, 귀중한 샘플, 그건 낭비 상대적으로 부정확 할 수 있으므로 nanodropping 샘플을 피할 도움이 될 수 있습니다. 우리는 귀중한거나 낮은 항복 샘플에 대한 순도와 IP 효율성을 평가하는 하우스 키핑 유전자 성적 증명서를 정상화 샘플을하시기 바랍니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 프로 시저가 최적화 올바르게 수행 된 경우 immunoprecipitation는 mRNA 대상의 상당 농축를 얻을 수 있습니다. 일반적으로qRT-PCR에 의해 평가 때 50 배에 - RBP 및 mRNA 대상 (들)에 따라, 우리는 약 10 농축을 참조하십시오. RBPs 많은 타겟이 microarray 분석을 사용하여 실내 masse을 발견 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 qRT-PCR에 비해 저하에 더 민감하다. RBP에 따라 목표와 반응의 효율의 수는, microarray는 소설 대상 수백을 표시 할 수 있습니다, 또는 경우에만, 몇를 발견 할 수 있습니다. 예를 들어, 더 나은 특징 RNA 결합 단백질 허 중 하나 인 후 transcriptionally 여러 중요한 생리 유전자 1, 2의 표현과 번역을 규제하고있다. 유방암 세포 라인에 RIP 칩을 통해 허 - ribonucleo - 복합 절연 예를 들어, 그림 1에서와 같이 qRT-PCR을 사용하여 β-고를 포함한 여러 중요한 알려진 허 대상의 농축을 공개했다. 암 세포 라인 모두에서 β-고를는 12 풍부합니다 - 15 배에. 일반적으로 제대로 수행 할 때 우리는 큰 enr를 참조셀 라인의 다양한 β-고를의 ichment. RIP는 β-고를에 대한 상당한 이득을 공개하지 않는 경우에는이 RIP에 문제가 있음을 나타냅니다과 절차는 반복해야 할 수도 있습니다. 또한, 이러한 세포 라인에서 immunoprecipitated 샘플 microarray 분석은 다른 에스트로겐 수용체의 허 타겟의 독특한 표현 하위 집합 (ER) 등 ER 부정적 메가바이트-231 유방암 세포 라인 대 긍정적 인 MCF-7 암 세포가 그림 2 1 시연을 공개했다. 어느 관련된 암과 관련되지 않은 알려진 알 수없는 허 목표 :이 목표는 여러 범주로 나눌 수 있습니다. 예를 들어, CALM2과 CD9 모두 이전에 허 목표로 식별되지 않은 암 ​​유전자 있습니다. 180 배는 허 단백질하고 이러한 목표 유전자 사이의 눈에 잘 띄는 상호 작용을 나타내는 허 펠릿에 풍부에 - qRT-PCR, CALM2과 CD9으로 microarray를 사용하고 확인은 5가된다는 것을 발견했다. <iMG SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot;ALT = &quot;그림 1&quot;/&gt; 1 그림. Immunoprecipitation 및 메가바이트-231에서 RIP (ER-)와 MCF-7 (ER +) 유방암 세포. Immunoprecipitations은 안티 - 허 단클론 항체 (3A2)와 IgG1 isotype 컨트롤을 사용하여 메가바이트-231 또는 MCF-7 세포 lysates에서 수행되었다. 3A2에 의해 감지로 허의 A. IP 서양이 예상 크기의 밴드를 공개했다. 오른쪽에있는 패널을로드하는 컨트롤과 같은 β-tubulin과 함께 두 세포 라인에서 사용 lysates 입력에 허의 양을 드러내고있다. 정량 RT-PCR에 의한 B. 검증은 각각 메가바이트-231과 MCF-7에서 3A2 된 IP에서 β-고를의 십오 및 11 배 enrichments, 알려진 허 대상을 보여 주었다. 모든 ΔΔCT 값은 GAPDH로 표준화되었다. 실험은 (N = 2) 중복 이루어했다. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 허 RIP-칩은 ER + 및 ER-유방암 세포에 독특한 유전자 프로파일을 식별합니다.허의 immunoprecipitations는 메가바이트-231 또는 허 항체와 Illumina Sentrix 배열 (47,000 유전자)에 hybridized IgG1 isotype 컨트롤을 사용하여 MCF-7 세포 lysates에서 수행되었다. 제어 신호 차감되었습니다. 결과는 12 개의 배열의 누적 데이터를 나타냅니다. 실험은 일치 컨트롤 각 셀 라인에 대한 세중의 (N = 3)에서 수행되었다. 비늘이 log2 있습니다.

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제작자들은 더 경쟁 관심이 없다는 점 선언합니다.

본 실험, 최적화 및 경험의 특성으로 인해 성공적으로 의도 된 결과를 획득 할 수있는 유일한 보장 방법이 될 것입니다. 이 절차의 여러 단계에서 온도와 시약 및 제품의 효율적인 처리는 매우 중요합니다. 적절한 계획과 기법의 실행 실험이 권장하는 최적의 온도에서 적절한 기간에 수행 된 것을 보장하는 데 도움이됩니다. RNA의 분리 실험과 주요 문제는 RNases의 저하에 RNAs의 감도입니다. 모든 시약은 RNase 무료 저장하거나 RNase 무료 용기에 사용 있어야합니다. 이렇게하면 mRNA 샘플의 무결성을 보장에서 중요한 단계입니다. 실험이 제대로 수행 경우에도 그러나, 원하는 결과는 RBP 및 대상 mRNAs 사이의 상호 작용의 특성으로 인해 달성되지 않을 수 있습니다. 한 잠재적 인 문제가 낮거나 RIP 칩에 의해 고립 된 RNA로부터도없이 신호가 발생했습니다.총 RNA의 신호가 될 수 있지만,이 구슬 타고 내려 오게되고 불충분 한 바인딩 단백질의 결과 일 수 있습니다. 첫 번째 문제 해결 단계는 사용중인 휴대 전화 lysate의 특정 RBP의 적절한 표현을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 확인 후, 단백질은 최종 NT2 세척 한 후 격리 될 수 있으며 5 분에 Laemmli 버퍼 또는 다른 적절한 denaturing 버퍼에 resuspended 95에서 가열 ° C. 서양 얼룩 분석은 충분히 관련된 단백질의 풀다운 보장하기 위해 입력 lysate뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 조정에서 이러한 샘플을 사용할 수 있습니다. 또한, 셀을 lysing하면 이러한 구성 요소에 액세스하는 데 필요한 때문에, 일반적으로 분리 된 단백질과 mRNA 사이의 이상 및 원치 않는 상호 작용에 대한 가능성이 유입 될 수있다. 이러한 상호 작용은 잠재적으로 바인딩하고 특이 현상의 상호 작용을 통해 대상 mRNAs 또는 바인딩 단백질 &quot;을 만끽&quot;수 있습니다. 이러한 다양한 공동으로 또한, 단백질nditions는 여러 형태의 공간의 수와 바인딩을 모티브는 상호 작용을 방지, 그들의 목표 mRNAs에 액세스 할 수 없게 될 수 있습니다. 이 모두 효율적으로 작업뿐만 아니라 이러한 원치 않는 상호 작용을 제한하는 나와있는 최적의 온도를 활용의 중요성을 강화. 또한 각 특정 대상 단백질에 대한 조건을 세척의 최적화 상호 작용의 순도를 극대화하는 것이 중요합니다. 더 엄격한 세척 조건이 필요 할 수 있습니다. 예를 들어, 세탁 버퍼는 SDS 또는 신호 출력에 특이 현상 상호 작용과 배경을 줄이기 위해 요소의 적절한 금액을 보충 할 수 있습니다. 이 실험의 대상 RBP뿐만 아니라 독특한 생리적 조건에서 대상 mRNA에 완전히 의존 될 것입니다. 일부 조건은 샘플의 준비에 주목해야한다 특정 mRNA 분석 도구, 적합하지 않습니다. 마지막으로,하지만 RIP는 RNA의 농축에 성공- RBP 상호 작용, RIP (칩) 메소드와 잘 알려진 문제는 과도 mRNA 대상에 RBP의 특정 바인딩 도메인을 식별 할 수 없다는 것입니다. 여러 상호 연결 기술은 고유 한 시퀀스 목표를 분리하기 위해 RIP 뒤에 사용할 수 있지만, 단파 UV의 사용은 핵산 손상 될하는 경향이있다. PAR-CLIP, 또는 photoactivatable ribonucleoside의 crosslinking와 immuoprecipitation,로 알려진 새로운 방법은 안정적이고 과도 모두 RNA 상호 작용의 독특한 바인딩 사이트의 식별을 허용 초기 RNA에 thiouridine를 통합 할 수 긴 웨이브 UV을 사용합니다. 전반적으로, RIP 칩은 우리의 그룹뿐만 아니라 다른 많은 연구 그룹에 의해 RNA 결합 단백질과 mRNA 대상 사이의 상호 작용을 분리하고 공부하는 데 훌륭한 도구로 자리 매김하고 있습니다. 자연과 연습에 민감하지만,이 절차의 적절한 실행 최근까지 inacc되었습니다 이러한 RNP 단지의 고립을 얻을 것입니다발견 및 분석을위한 essible.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 1 M dithiothreitol </td><td> 어부 </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase 무료 </td></tr><tr><td> Tetraccetic 산을 Ethylendiamine </td><td> 어부 </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3375-100G </td><td> 산도 7.0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78,641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> 어부 </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 어부 </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 버퍼 </td><td> * 아래 참조 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysom​​e 용해 버퍼 </td><td> * 아래 참조 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 알약 </td><td> 로슈 </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 세 파로스 비즈 </td><td> 시그마 </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 어부 </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 저해제 아웃 RNase </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / μl </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> 어부 </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 </td><td> 어부 </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M 트리스 - HCL </td><td> 어부 </td><td&gt; BP153-500 </td><td> 산도 7.4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl Ribonucleoside 단지 </td><td> 뉴 잉글랜드 연구소 </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 정밀 검사 </td></tr><tr><td> RNase / DNase 무료, DEPC - 처리 유리에 시약을 준비 </td></tr><tr><td> Polysome 용해 버퍼 </td></tr><tr><td> 100 MM KCl </td></tr><tr><td> 5 MM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 MM HEPES (산도 7.0) </td></tr><tr><td> 0.5 % NP40 </td></tr><tr><td> 1 ㎜ DTT </td></tr><tr><td> 100 단위 / ML RNase 아웃 </td></tr><tr><td> 400 μM VRC </td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 태블릿 </td></tr><tr><td> Polysome 용해 버퍼의 5 ML </td></tr><tr><td> 1 M의 HEPES 50 μl (산도 7.0)를 추가 </td></tr><tr><td> 1 M KCL 500 μl </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2의 25 μl </td></tr><tr><td> NP40의 25 μl </td></tr><tr><td> 4.7 ML RNase-DNase 무료 H 2 O </td></tr><tr><td> 1 M DTT의 50 μl </td></tr><tr><td> 100 U / ML RNase의 12.5 μl 아웃 </td></tr><tr><td> 200 μl 프로테아제 억제제 칵테일 (제조업체에 따라 해산) </td></tr><tr><td> 10 μl 200 MM VRC (사용시) </td></tr><tr><td> NT2 버퍼 </td></tr><tr><td> 50 MM 트리스 - HCL (산도 7.4) </td></tr><tr><td> 150 MM NaCl </td></tr><tr><td> 1 ㎜ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.05 % NP40 </td></tr><tr><td> NT2 버퍼 1 L </td></tr><tr><td> 50 ML 트리스 (산도 7.4) </td></tr><tr><td> 30 ML 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ML 1 M MgCl <suB&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 μl NP40 </td></tr><tr><td> 820 ML RNase-DNase 무료 H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

높은 처리량 시퀀싱하고 효율적인 microarray 분석의 발전의 결과로서, 글로벌 유전자 발현 분석은 데이터 수집의 간편하고 쉽게 사용할 수 양식이되었습니다. 그러나 많은 연구와 질병 모델에서 대상 유전자 mRNA의 정상 상태 수준은 언제나 정상 상태 단백질 수준 상관 관계를하지 않습니다. 포스트 전사 유전자 조절은 둘 사이의 차이가 크다는의 가능성이 설명입니다. RNA 바인딩 단백질 (RBP)의 바인딩에 힘 입어 포스트 전사 규제 대상 mRNAs와 Ribonucleoprotein (RNP) 복잡한을 형성하여 mRNA의 현지화, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. RNP 단지의 세포 추출물에서 이러한 알 수없는 드 노보 mRNA 목표를 확인하는 것은 이해 메커니즘과 RBP와 단백질 출력에서​​의 결과에 큰 영향을의 기능에 중요한 것입니다. 이 프로토콜은 s의 식별을 허용 RNP immunoprecipitation-microarray (RIP 칩)를 칭했다 방법을 설명추가로 개별 연구자에 대한 실험을 최적화하는 옵션과 함께 pecific mRNAs는 변화 실험 조건 하에서, ribonucleoprotein 단지에 연결된 상태입니다. 이 중요한 실험 도구, 연구자들은 후 전사 유전자 조절뿐만 아니라 다른 ribonucleoprotein 상호 작용과 관련된 복잡한 메커니즘을 탐색 할 수 있습니다.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K 조회수.  University of Missouri. RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

연구

생물학

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

절차 식물 추출물에서 분산 된 입자의 제거를위한 응집제의 효율성을 평가하는

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 Ribonucleoprotein 단지의 3D-페이지에서

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...