이 작품은 NIAID (R01AI074951, U54AI057168)와 SC에 펜 게놈 프론티어 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다; NIH T32HG000046에서 TSM로, NIH T32GM07229과 T32AI007324에서 LRS 수 있습니다.

1 부 : 384 자 플레이트에서 RNAi <ol><li> 검사에 사용되는 시약의 표준화가 필수적입니다. 우리는 슈나이더의 미디어의 개별 많은, 태아 소 혈청 및 얼룩의 시약을 테스트합니다. 그럼 우리가 화면 전체에 대해 동일한 많이 나누어지는하고 사용합니다. </li><li> 어떤 분석 들어, 읽기 밖으로 생물 학적 가장 의무가 어떤 결정하기 위해 몇 가지 다른 세포 라인을 테스트하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로 S2 - DRSC 라인을 사용합니다. </li><li> 25 ° C 전체 슈나이더의 미디어에 Drosophila 세포를 성장. <ol class="lalpha"><li> 슈나이더의 미디어 </li><li> 10% 열 inactivated FBS </li><li> 1X L - 글루타민 </li><li> 1X 펜 / strep 항생제 </li></ol></li><li> Drosophila 세포는 반 자기편하며 flasks에서 세포를 pipetting하고 신선한 플라스크에 1시 10분 세포를 diluting하여 모든 사일 trypsinization없이 passaged 있습니다. 세포 실험에 대한 로그 단계에서해야합니다. </li><li> 판 - 투 - 플레이트와 일상적인 변화는 다중 잘 접시 모든 액체 추가에 대한 자동 액체 처리의 사용을 통해 최소화하고 있습니다. 우리는 WellMate (매트릭스)를 사용합니다. </li><li> WellMate 튜빙을 준비합니다. <ol class="lalpha"><li> 70 % 에탄올로 스프레이 후드와 WellMate. </li><li> 70 % 에탄올로 패키징과 스프레이에서 튜브를 제거합니다. </li><li> WellMate에 위치를 분배에 튜브 카세트를 넣습니다. </li><li> 70 % 에탄올 25 ML과 프라임 튜빙. </li><li> 에탄올의 다른 25 ML과 다음 주요 15 분에 대한 에탄올의 튜빙을 소독. </li><li> 멸균 PBS 50 ML과 프라이밍하여 튜빙을 씻어. </li></ol></li><li> 술병과 카운트에서 세포를 이동시키다. 펠렛 세포가 그래서 당신은 (300xg, 5 분) 필요보다 25 % 더있다. 잘마다 씨앗을 품고 세포의 숫자는 분석 기간에 따라 최적화되어야합니다. 자동 이미지 분석을 실시하는 경우에는 셀 clumping로 단일 monolayer 이미지 세분화에 이상적입니다. </li><li> 1.7x10 6 셀 / ML에서 혈청 무료 슈나이더의 미디어 pelleted 세포를 Resuspend. </li><li> 우리는 384 잘 접시 250ng/well의 농도에 dsRNA의 상용 라이브러리로 사전 aliquoted에서 화면을 수행합니다. 각 접시의 여러 우물을 수동으로 추가하는, 컨트롤에 빈 남아 있습니다. 우리는 부정적인 제어로 루시페라제하는 dsRNA를 사용합니다. 우리는 강력한 RNAi를 제어하는​​ 등 실 (dIAP)에 대한 dsRNA를 사용합니다. 극적인 세포 죽음이 안티 apoptotic 요소 결과의 허물고 다운 노크의 품질을 평가하는 간단한 시각적 방법입니다. 마지막으로, 우리는 우리의 분석을 읽고 아웃 사용하여 바이러스 감염을 억제 수 확인하는 긍정적인 제어로,이 경우 베타 galacosidase에서 바이러스 기자에 대한 dsRNA를 사용합니다. 세포 심는 쉽게 시각화 수 있도록 잘의 모퉁이에 나누어지는 1 μl dsRNA시 판으로 dsRNA을 찾을 경우, 전지를 추가하기 전에 우물의 바닥 (300xg, 1 분)에 dsRNA를 원심 분리기. </li><li> 각 물론 위의 준비를 10 μL 세포를 추가할 수 WellMate 사용합니다. </li><li> 300xg, 1 분 centrifuging하여 접시에 세포를 스핀. </li><li> 45 분 동안 25 ° C 배양기에서 알을 품다. </li><li> 20 μL 전체 슈나이더의 미디어를 추가하고 300xg 1 분 원심 분리기. </li><li> humidified 유리 섬유 복합 용기에 넣어 접시 물에 젖었을 종이 타월로 늘어서. 384의 볼륨이 잘 작습니다, 따라서 증발이 차례로 가장자리 우물의 읽기 아웃에 artifactual 변화로 이어질 수있는 생물에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이것을 극복하기 위해, 접시는 높은 습도에 따라 유지되어야합니다. </li><li> 강력한 최저 수 있도록 사흘 동안 품어. 미디어를 변경하거나이 시간 동안 humidified 용기를 열 필요가 없습니다. </li></ol> 2 부 : 우두 바이러스에 감염 <ol><li> 15 분 Quatricide에 소독 멀티 채널 흡인기, 다음 70 % 에탄올로 헹굼. </li><li> 위에서 설명한 WellMate를 준비합니다. </li><li> 혈청 무료 미디어 전체 미디어 1:5 diluting에 의해 감염 2퍼센트 FBS와 슈나이더의 미디어를 준비합니다. </li><li> 세포 파편을 제거하거나 정화 바이러스를 사용하는 필터 0.8 음 주사기를 통해 필터 원유 바이러스 주식. </li><li> 2 감염의 다중성을 (뫄)을 구하는 2퍼센트 혈청 슈나이더의 미디어에 우두 바이러스를 희석. </li><li> WellMate 튜브에서 PBS를 제거하고, 튜브 기포가 무료 때까지 희석 바이러스와 프라임. </li><li> 부드럽게 dsRNA - 대우 Drosophila 세포의 접시에서 미디어를 제거하는 소독 다중 채널 흡인기 및 진공 매니폴드를 사용하십시오. </li><li> WellMate를 사용하여 접시에 잘 30 μL 바이러스를 분배. </li><li> 300xg에서 접시 1 분 원심 분리기. </li><li> WellMate 튜빙을 소독. 10 % 블리 25 ML과 프라임채널, 10 분 기다려야하고, 또 다른 25 ML 10 % 표백제와 프라임. </li><li> 50 ML의 물로 프라임 튜브 50 ML 70 % 에탄올로 따라갔다. 자사 포장 튜빙을 반환합니다. </li><li> humidified 유리 섬유 복합 컨테이너에 번호판을 반환합니다. 48 시간 동안 25 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 파트 3 : 스테 이닝 플레이트 <ol><li> 10 분 15 μL 4 % 포름 알데히드 / PBS에 번호판을 수정. 액체는 다중 채널 흡인기 각 단계에서 진공 매니폴드를 사용하여 제거됩니다. 일단 접시는 멸균 장비가 해결되었습니다 및 시약이 더 이상 필요하지 않습니다. </li><li> 삭제 수정 30 μL PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X)를 추가하는 WellMate를 사용합니다. 10 분 반복 품어. 튜빙은 소독 할 필요가 없다를 제외하고 운영, 위에서 설명한 WellMate. </li><li> 우두 감염을 감지하기 위해 우리는 늦은 / 이른 우두업자에 의한 β - galactosidase의 기자를 사용합니다. </li><li> 10 분 블록에서 액체와 부화 세포를 (2 % BSA와 PBST)를 제거합니다. </li><li> 블록의 기본 항체를 희석, 액체를 제거하고 각 잘 멀티 채널을 사용하여 반복 pipettor (매트릭스) 15 μL 항체를 추가합니다. </li><li> 접시 (300xg, 1 분) 스핀 다운, 맑은 스티커로 커버 4 ° C 하룻밤에 품어. </li><li> 기본 항체를 제거하고, PBST 3 회 10 분 각 우물을 씻어 WellMate을 사용합니다. </li><li> 찬란 표시된 보조 항체 (FITC)와 블록에 얼룩이 핵을 희석하고, 다중 채널 반복 pipettor를 사용하여 우물 15 μL를 추가합니다. </li><li> 부화 플레이트 실온에서 1 시간, 빛으로부터 보호. </li><li> PBST 3 회, WellMate를 사용하여 십분 각 우물 씻으십시오. </li><li> 4 명확한 스티커, 커버, 그리고 저장과 번호판을 봉쇄 ° C를 3 주. </li></ol> 4 부 : 이미징 및 이미지 분석 <ol><li> 이미지 판에 20X 배율에서 자동 현미경을 사용합니다. </li><li> 총 핵 (DAPI)와 감염된 세포 (FITC)의 이미지를 캡처합니다. 동적 범위를 극대화하기 위해서는 개별적으로 각 채널에 대한 노출 시간을 최적화합니다. </li><li> 초점의 예상 비행기 위에서 아래 비행기에 걸쳐 이미지, 간격 간격 1um의 Z 스택을 복용하여 자동 초점 기능을 조정. 최적의 초점 비행기가있는되면, 그에 따라 자동 초점 설정을 조정합니다. </li><li> 이미지 전체 접시, Hoechst 채널 (DAPI)와 바이러스 채널 (FITC) 모두에 잘마다 적어도 세 이미지를 캡처. 전체적으로 잘 나타내는 이미지를 캡처하기 위해서는 잘 하나에 여러 지역에서 사이트를 선택합니다. </li><li> 세그먼트에 이미지를 일기를 작성하고 각 플레이트에 대한 핵 얼룩 (총 셀) 및 감염 (FITC)에 대한 긍정적인 세포의 총 수를 계산 카운트 핵 모듈을 사용하는 소프트웨어를 MetaXpress 사용합니다. </li><li> %의 감염 (100 * FITC 긍정 / 총 세포)을 계산하고 변환 로그인하십시오. </li><li> 지원자를 확인하려면 우리는 각각의 접시의 평균과 interquartile 범위를 기반으로 강력한 Z 점수를 사용합니다. 이 방법은 outliers 및 nonsymmetric 데이터를 구분하지 않습니다, 그래서 심지어는 약하거나 중간 조회수 10 식별 큰 전력을 제공합니다. 각 접시, 중간은 로그 변환된 데이터로부터 빼서 수 있습니다. 그러면 결과 값은 0.74 배 interquartile 범위 (75 번째 백분 위수의 가치와 25 번째 백분 위수 사이의 차이)로 나누어집니다. 0.74 요인은 대략적인 표준 정규 분포하는 데 사용됩니다. </li><li> 강력한 Z 점수는 접시의 평균으로부터 표준 편차의 거리의 측정입니다. 예를 들어, 2의 강력한 Z - 점수는 우물의 %를 감염 플레이트 평균 또는 P &lt;0.05부터 ~ 2 표준 편차 나타냅니다. </li><li> 세포 독성 후보자를 식별하는 휴대폰 번호를 분석합니다. 핵 카운트의 강력한 Z 점수를 계산합니다. 중복 화면에서 강력한 Z &lt;-2과 지원자는 세포 독성 간주됩니다. </li><li> 세포 독성없이 중복 화면에서&gt; 2 또는 &lt;-2 (P는 &lt;0.0025)의 %의 감염에 대한 강력한 Z 점수를 웰스는 기본 화면에서 잠재적인 후보로 간주됩니다. </li><li> 긍정적인 후보자는 독립적인 시약을 사용하여 확인됩니다. dsRNAs는 mRNA의 다른 지역에서 관심의 유전자에 대한 생성하고 위와 같이 테스트합니다. </li><li> 두 개의 독립적인 dsRNAs 같은 표현형을 가지고있는 이들 유전자들은 진학 간주될 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 이미지와 감염률의 해석 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="그림 1" /> 잘 감염 대리인으로 immunofluorescence 현미경으로 측정 우두 - 표현 베타 galactosidase (βgal) 단백질에 대한 긍정적인 얼룩 세포를 포함하는 동안 그림 1. 감염되지 않은 우물은 우두 바이러스 단백질에 대한 얼룩을 표시하지 않습니다.바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 자동 이미지 분석 소프트웨어는 사용자가 설정한 매개 변수를 사용하여 각 이미지에 감염을 단정. 대표 이미지, 세포 핵 및 바이러스 항원을 표현하는 세포의 수를의 총 숫자는 크기와 지역 배경 위에 얼룩 얼룩의 강도에 따라 계산됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 스레드 (dIAP)의 분해는 대상 유전자의 강력한 RNAi 고갈에 대한 긍정적인 제어 역할을합니다. 이 안티 apoptotic 요소의 최저는 극적인 세포 사망에 이르게한다. 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="그림 4" /> 루시페라제 그림 4. 최저 감염을 두 번 좌초 RNA 치료의 효과에 대해 부정적인 제어 역할을합니다. 루시페라제의 고갈은 치료 왼쪽 세포에 상대적인 감염에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="그림 5" /> 가 감염 밖 읽은 상태로 분석이 βgal 단백질 수준을 사용하고 있기 때문에 그림 5. βgal 단백질의 분해는, 감염의 감소에 대한 긍정적인 제어 역할을합니다. 감염된 세포의 비율에있는 감소 βgal 결과의 고갈. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 감염된 세포의 비율에있는 감소에 휴대 요소 Rab5 결과 최저. Rab5가 endocytosis에 참여하는 것으로 알려져 있기 때문에,이 요소는 가능성이 우두 바이러스 항목에 기여하고 있습니다. 이 화면에서 예제 국외자를 나타냅니다. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색.

<ol>
	<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells.">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li><li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response.">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li><li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells:+regulation+of+viral+transcription+and+replication.">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li><li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors.">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells:+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions?.">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?.</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li><li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication.">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication.">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition.">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li><li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics.">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila의 게놈 - 광범위한 RNAi 검사는 바이러스 감염의 세포 구성 요소를 검토를위한 강력하고 효율적인 방법을 제공합니다. 포유 동물 바이러스의 숫자는 호스트 본질적인 면역 반응의 구성 요소, 그리고 새로운 치료 목표를 나타내는 수 있습니다 바이러스 복제에 필요한 호스트 단백질 요소를 식별하는 데 사용할 수있는 Drosophila 세포를 감염. 화면을 수행하기 전에 분석은 신중하게 셀 타입, 휴대폰 번호, 그리고 감염 수준에 최적화된해야하며, 잘 11 긍정적이고 부정적인 바이러스와 세포의 목표를 ​​모두 포함 제어해야합니다. 분석의 동적 범위를 극대화하기 전에 검사하는 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이에 충분한 간격을 확보하는 것이 중요합니다. 화면이 수행되면 후보자는 호스트 메커니즘이 감염에 기여하는 결정하기 위해 기능적 범주로 나눌 수 있습니다. 같은 우두와 같은 포유 동물의 바이러스 예방 프로그램으로, RNAi의 포유 동물 homologs의 기여는 이차 분석의 일부로 결정되어야합니다. 함께 촬영이 강력한 심사 방법은 우리가 바이러스가 자신의 호스트 세포와 상호 작용하는 복잡한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screening</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Genome-wide dsRNA library</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plates, black with clear bottom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>6569</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denville</td>
<td>B1212-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Well Mate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matrix</td>
<td>201-10001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 pin manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B2261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescently-labeled secondary antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageXpressMicro automated microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MetaXpress image analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells

뿐만 아니라 바이러스는 인간의 질병의 자연적인 유행을 일으킬 수 있지만, bioterrorism 그들의 잠재적인 사용은 또한 관심사입니다, 바이러스성 병원체는 중요한 공중 보건 위협을 나타냅니다. 충격 감염이 많이 - 필요한 치료제의 개발을 용이하게한다고 세포 요인 이해. 여러 생물의 시퀀싱 전체 게놈과 함께 RNA 간섭 (RNAi) 기술의 최근 발전은 게놈 차원, 셀 기반의 손실의 기능 화면의 최적화되었다. Drosophila 세포 때문에의 게놈 규모의 화면에 특히 의무 아르 이 시스템은 1 RNAi의 용이성 및 효율성. 중요한 것은 바이러스의 다양한 의료 및 농업 중요성 2,3,4의 포유 동물 바이러스의 숫자를 포함 Drosophila 세포를 감염시킬 수 있습니다. Drosophila에서 이전 RNAi 화면 항목 번역과 RNA 복제 5 포함한 바이러스 감염의 여러 단계에 필요한 호스트 요인을 확인했습니다. 또한, Drosophila의 세포 배양에서 바이러스 복제에 필요한 세포 요인의 대부분은 이러한 바이러스 4,6,7,8, 9 감염된 인간의 세포에 제한됩니다. 따라서, 바이러스 감염 동안 공동 선택한 호스트 요인의 식별은 항바이러스 치료제에 대한 새로운 목표를 제공합니다. 여기 예로 우두 바이러스를 사용하여 바이러스 감염에 관련된 세포 요소를 식별하는 높은 처리량 RNAi 화면에 대한 일반적인 프로토콜을 제시한다.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells at JoVE.com

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다.<em&gt; Drosophila</em&gt; 세포 배양 모델은 RNAi의 용이성과 효율성으로 인해 이러한 접근 방식에 특히 의무가 있습니다. 우리가 사용하는이 기술을 증명<em&gt; 우두</em예로&gt; 바이러스.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

9.4K 조회수.  University of Pennsylvania. 바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다. Drosophila 세포 배양 모델은 RNAi의 용이성과 효율성으로 인해 이러한 접근 방식에 특히 의무가 있습니다. 우리가 사용하는이 기술을 증명 우두 바이러스.

비디오: RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

연구

면역학 및 감염병학

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila 전지

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila* 전지*