저자는 다음과 같은 기관에서 재정 지원을 인정하고, 국립 과학 재단 (부여 0719232), 에너지 부 (부여 DEFG02 - 01ER15129), WM 켁 재단 (부여 041904), 그리고 조지 워싱턴 대학 리서치 향상 기금. 저자는 아낌없이 마크 E. 리브스와 조지 워싱턴의 호안 A. 호프만에 의해 섬유 에칭에 관한 프로토콜에 대한 초기 논의에 대한 적외선 광섬유 시스템 (실버 스프링, MD)뿐만 아니라 제공한 GeO2 기반의 광학 섬유에 대한 감사 대학. 저자는 또한 프로토콜 찍고하는 동안 그녀의 도움 제시카 A. Stolee 감사하고 싶습니다.

1. 광학 부품 <ol><li> 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI) 질량 분석계 (MS)에 대한 레이저 박리는 2.94 μm의 파장에서 5 NS 레이저 펄스에 의해 생산됩니다. ND에 의해 주도 조정할 수 광 파라메 트릭 발진기 : YAG 레이저 (Opolette 100, Opotek 주식 회사, 칼스 배드, CA)는이 연구에서 절제에 사용됩니다. 반복 속도는 5 Hz에서 100 사이의 선택됩니다. 이것은 직접적인 노출시 눈 또는 피부에 심각한 영구적인 손상을 일으킬 수있다는 것을 클래스 IV 레이저입니다. 레이저 빔의 확산 반사는 피부 또는 눈에 유해한 수 있습니다. 보호를위한 적절한 레이저 고글을 착용. </li><li> 게르마늄 이산화 기반의 유리로 만든 광섬유는 적외선 섬유 시스템즈 (실버 스프링, MD)에서 얻은 것입니다. 이 Hytrel 있으며 섬유에 코팅이 끝나는에서 그들을 제거하기 위해 다음 지침을 따르십 polyimide 경우. 열 1 - 메틸 - 2 - pyrrolidinone 130-150 ° C로 퓸 후드 인치 섬유가 약 1 분 또는 코팅이 부드럽게 시작까지 보지이 액체에 스트립하려는 종료 딥. 메탄올 또는 잠시 이소프로판올로 부드럽게 코팅 찍어 및 보푸라기가없는 냅킨으로 남아있는 코팅을 닦아. 코팅을 제거 후, ​​클리브 점수 부드럽게 그들을 욕하는게하여 사파 블레이드 (KITCO 광섬유 광학, 버지니아 비치, VA)과 섬유질이 모두 끝납니다. </li><li> 1퍼센트 (V / V) 질산의 산성 (시약 등급) 솔루션, 섬유 팁의 화학적 에칭 한쪽 끝을 원하는 선명도를 얻을 수 있습니다. 수직 최초의 연락 후 300-500 μm의 깊이에 산성 용액에 섬유를 선택한 끝을 담가. 에칭의 약 15 분 후에 팁 그러다가 자연 산성 표면에서 분리합니다. 곡률 ~ 15 μm의 범위와 날카롭게 섬유 팁이 발생합니다. 모든 산성 찌꺼기를 제거하는 탈이온수와 린스. </li><li> micromanipulator에 섬유 (MN - 151, Narishige, 도쿄, 일본)의 에칭 종료를 탑재하고 효율적인 에너지 증착을위한 세포 표면의 근접을 (~ 20 μm의) 가까이에 그것을 가지고. </li><li> 맨 섬유 척 (BFC300, 시스키유 공사 그란츠 패스, OR)에 의해 광섬유의 비 에칭 끝을 잡고. 광학 정렬 들어, 섬유 척은 다섯 축 번역사 (BFT - 5 시스키유 공사 보조금 패스, OR)에 장착됩니다. 레이저 에너지는 (0.5-1 MJ)의 비 에칭 엔드에 평철의 칼슘 플루오르 또는 반사 코팅 ZnSe 렌즈 (적외선 광학 제품, 파밍데일, NY)의 광선을 집중하여 섬유에 결합됩니다. 보호 골드 미러 (PF10 - 03 - M01, Thorlabs, 뉴턴, NJ) 초점 렌즈에 중반 IR 레이저 광선을 조종하는 데 사용됩니다. </li></ol> 2. 전기 분무 설정 <ol><li> 전도성 perfluoroelastomer의 물미, 피팅, 튜브 슬리브, 바늘 포트 (각각 예를 들어, U - 435, M215, F - 331Nx, F - 242x, 9013, IDEX 건강 &amp; 사이언스와 금속 노조 : 전기 분무 시스템은 다음과 같은 구성 요소를 사용하여 건설 수 있습니다 오크 하버, WA)뿐만 아니라 융합 실리카 튜브 (예 : CT360 - 100 - 50-5, 뉴 목적 주식 회사, 워번, MA). 권장 에미터는 스테인레스 스틸로 만들어진 및 50 μm의 아이디 (예 : MT320 - 50 - 5 - 5, 새로운 목표 주식 회사, 워번, MA)와 테이퍼 팁 가지고있다. </li><li> 전기 분무에 대한 0.1 % 초산 (V / V)와 50 % 메탄올 용액을 준비합니다. 솔루션을 사용하여 주사기 펌프 (하버드 장치, 홀리스튼, MA)에 의해 200-300 NL / 분 속도로 펌핑이다, 예를 들어, 500 μl 주사기 (81222, 해밀턴 회사, 리노, 네바다). </li><li> 지속적으로 전기 분무를 생성하기 위해 규제 전원 공급 장치 (PS350, 스탠포드 연구 시스템 병원, 서니 베일, CA)에 의해 금속 노조에 2800과 3000 V 사이에 높은 전압을 적용합니다. 모든 전기 연결이 안전하고 적절하게 접지 차폐와 차폐된 있는지 확인합니다. 노출된 높은 전압 직접 접촉 감전이 발생할 수 있습니다. </li></ol> 3. 샘플 처리 <ol><li> 적절한 소스에서 살아있는 조직이나 세포 샘플을 확보하고 그들과 같이 분석하기 전에 권장 유지. 이 예제에 대한 알리움 cepa 구근은 지역 상점에서 구입했다. 수술 메스에 의해 길이 방향 전구 컷. 규모의 몇 cm 세그먼트는 스트립에 sectioned되었습니다. 안쪽 표피 조직의 손상 monolayer가 해제 벗겨 있습니다. </li><li> 표피의 젖은 표면은 미리 청소 유리 현미경 슬라이드에 조직을 마운트하는 데 사용됩니다. 위치에 대한 3 축 번역 무대에 탑재된 범용 플레이트 홀더 (FP01, Thorlabs 주식 회사, 뉴턴, NJ)의 슬라이드를 잡아. 즉시 세포 저하를 방지하기 위해 시료를 장착 후 질량 스펙트럼을 취득. </li></ol> 4. 시각화 시스템 <ol><li> 두 장거리 현미경은 분석을 위해 세포를 선택하고 날카롭게 섬유 팁 및 세포 표면 사이의 거리를 유지하는 데 사용됩니다. 후자는 표면에서 측정된 15 ° -30 각도에 따라 마운트됩니다. 이 시스템은 알 이루어져5 배 무한대로 긴 사연이 거리 비디오 현미경 (7x 정밀 줌 광학, 에드먼드 광학, 배링턴, NJ) CCD 카메라 (말린 F131, 관련 비전 기술을 갖춘 객관적인 렌즈를 (배 M 계획 APO, Mitutoyo (주), 가나가와, 일본) 수정 , 모니터링 및 이미지 캡처를위한 Stadtroda, 독일). </li><li> 두 번째 비디오 현미경은 상단의 세포를 시각화하기 위해 시료 표면에 직각으로 장착됩니다. 이 시스템은 절제와 분석을 위해 선택한 셀 위에 광섬유 팁을 정렬 시각적인 피드백을 제공합니다. 그것은 10X 무한 장착되어 7x 정밀 줌 광학 (에드먼드 광학, 배링턴, NJ),로 구성되어 긴 작동 거리의 객관적인 렌즈 (10X M 계획 APO, Mitutoyo (주), 가나가와, 일본)와 CCD 카메라를 수정. </li></ol> 5. 질량 스펙트럼의 취득 <ol><li> 레이저, 전기 분무 및 질량 분석기, 예를 들어, quadrupole 시간의 비행 시스템 (Q - TOF 프리미어, 워터스, 밀퍼드, MA)를 켭니다. 절제 명소 및 전기 분무의 서로 상대적인 방출 및 최대 이온 농도를 달성하기 위해 질량 분석계의 구멍의 위치를​​ 조정하여 LAESI 이온 소스의 지오메 트리를 최적화합니다. </li><li> 최상위보기 시각화 시스템을 사용하여 분석에 관심있는 셀을 선택합니다. 선택 후, 직접 광섬유의 끝에 날카롭게 아래 선택한 셀을 가져 샘플 무대를 이동합니다. 사이드보기 현미경을 사용하면 ~ 20 μm의에 대한 팁 - 투 - 셀 표면 거리를 다시 조정. </li><li> 에칭 섬유 팁 통해 선택한 셀 발사 레이저 펄스. 세포 벽 및 미립자 물질의 형태로 세포질의 방출의 천공이 결과를. 전기 분무에 의해 postionization 후 생산 이온은 질량 분석계 및 질량 스펙트럼에 의해 저장됩니다이 기록됩니다. </li><li> 데이터 수집 후, 레이저, 전기 분무 및 대기 모드에서 질량 분석계를 넣어하거나 전원을 끕니다. ablated A. 유지 가벼운 현미경으로 관찰하기 위해 선택 cepa 조직 샘플. </li></ol> 6. 대표 결과 세포 벽 및 LAESI 질량 스펙트럼의 컬렉션의 파열에 단세포 결과의 성공적인 절제. 실패한 실험은 보통없이 절제 및 / 또는 없음 대량 스펙트럼 결과. 데모를 위해, 우리는 A.의 단일 내장 표피 세포의 LAESI - MS 분석에서 결과를 제시 cepa 전구. 그림 2A는 세포의 샘플링 후 대표적인 광학 현미경 이미지를 보여줍니다. 세포 벽이 천공하고 천공의 범위는 이웃 세포와 경계에 의해 제한됩니다. 인접한 세포가 손상 될 것 같습니다. 그림 2B는 세포에서 생산되는 대표 LAESI 질량 스펙트럼을 보여줍니다. 이온의 다양한는 A.에서 감지 cepa 세포들이 정확하게 대중을 기반으로, 동위 원소 분포 패턴, 그리고 경우에, 탠덤 질량 스펙트럼, 그들은 미정 내생 metabolites에 할당됩니다. 하나의 세포에서 발견 이온은 여러 세포의 기존 LAESI - MS하여 동일한 조직의 분석에서 관찰된 것과 비슷 13. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. LAESI - MS에 의해 단일 세포 분석 개략도. 중간 IR 레이저 펄스는 광섬유로 결합하여 유리 슬라이드에 배치 샘플로 전달됩니다. 날카롭게 섬유 팁는 대상 세포에 빛을 초점을 맞추고 있으며 예금 에너지 셀을 없어지는. 생산 절제 플륨 (빨간색 점)는 샘플 특정 이온의 생산의 결과 방울이 뭉쳤다 전기 분무 플륨 (검은 점) (녹색 점들)와 병합됩니다. 이러한 이온 분석 및 질량 분석기 (MS)에 의해 감지됩니다. 두 장거리 비디오 현미경, 현미경 1 현미경 2, 섬유 팁 및 세포 표면 사이의 거리를 모니터링하고 분석을위한 세포, 각각을 선택하기 위해 이용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="그림 2A" /> A.의 단일 표피 세포에 그림 2A가. 절제 표시 cepa 전구. 인접한 세포가 보이는 피해를 전시하지 않고 이후 개별적으로 분석할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="그림 2B" /> 단일 A.의 절제에 해당하는 그림 2B. 질량 스펙트럼 cepa 표피 세포는 기본 및 보조 metabolites의 존재를 보여줍니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 세포질과 세포 벽이나 막의 인장 강도의 수분 함량은 LAESI - MS 분석하는 동안 단일 세포의 박리를 관할하는 중요한 요소가됩니다. 레이저 fluence은 서로 다른 세포 유형의 절제 임계값에 도달하기 위해 조정되어야합니다. 전달 레이저 fluence은 레이저 펄스의 에너지와 섬유 팁 및 세포 표면 사이의 거리에 따라 달라집니다. 단일 세포 분석을하는 동안 주변 세포의 섭동을 최소화하는 것이 중요합니다. 절제 임계값에 레이저 에너지를 유지하면 인접 세포에 대한 분석의 효과를 제한합니다. 잠재적인 응용 프로그램 중 하나는 MS의 화학 이미징을위한 자연 체적 픽셀 (voxels)로 단일 세포를 사용하고 있습니다. 인공 자주 직사각형 격자에 대한 데이터를 수집에 비해 한 번에 조직 세포 하나의 화학 화상은 세포 사이의 생화 학적 상호 작용의 공간적 조직을 유지하기 위해 더 많은 가능성이 높습니다.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>45727</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>65548</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M79603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>39259</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct analysis of single cells by mass spectrometry at atmospheric pressure

단일 세포에서 biochemicals 분석 심지어 같은 세포 유형들이 생리적 조건 및 환경과 상호 작용에 따라 이기종 생화 학적 메이크업을 전시 세포 대사, 세포주기, 적응, 질병 상태 등을 이해하는 것이 중요합니다. 단일 세포의 biomolecules의 분석에 사용되는 질량 분석계 (MS)의 종래의 방법은 광범위한 샘플 준비에 의존하고 있습니다. 그들의 자연 환경과 다양한 샘플 처리에서 세포를 제거하면 세포 조성의 변화가 발생할 수 있습니다. 대기 이온화 방법은 자신의 모국어 환경에서 광범위한 샘플 준비없이 시료의 분석을 가능하게합니다. 1 2.94 μm의 파장에서 생물 학적 물질의 중간 적외선 (중간 IR) 레이저 절제에 따라 기술이 물이 갑자기 여기를 활용되는 단계 결과 폭발. 이러한 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI)과 대기압 적외선 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 (AP IR - 든)와 같은 중간 IR 레이저 방사에 기반이 대기 이온화 기술을 성공적으로 직접 분석 물을 수있는 능력을 증명하고있다 대기압에서 풍부한 조직 및 biofluids. LAESI 대부분 이온을 생산하기 위해 고도로 청구 전기 분무의 방울로 샘플 coalesces에서 중성 미립자 물질로 구성되어 중반 IR 레이저 박리 플륨에서 3-11. 최근, 단일 세포의 중간 IR 절제가 새겨져 광섬유를 통해 중반 IR 방사를 제공함으로써 수행되었다. 이 절제에서 생성된 깃털은 LAESI - MS에 의해 하나의 세포에있는 다양한 metabolites의 분석을 가능하게 전기 분무에 의해 postionized되었습니다. 12이 문서는 LAESI - MS를 사용하여 단일 세포 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 제출 비디오 알리움 cepa 전구의 피부에서 단일 표피 세포의 분석을 보여줍니다. 시스템의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. 세포에서 단일 세포 절제와 LAESI 질량 스펙트럼의 대표 예는 그림 2에 제공됩니다.

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Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

단일 세포 분석 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI) 질량 분광법에 대한 세포 샘플을 날카롭게 광섬유를 사용하여 대기압에서 식물과 동물 세포의 대량 분석법에 의해 수행됩니다.

대기압에서 질량 분석법에 의해 단일 ​​세포의 직접 분석

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

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Research

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15.9K 조회수.  George Washington University. 단일 세포 분석 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI) 질량 분광법에 대한 세포 샘플을 날카롭게 광섬유를 사용하여 대기압에서 식물과 동물 세포의 대량 분석법에 의해 수행됩니다.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

LAESI 질량 분석법에 의해 생물 학적 조직 및 Biofilms의 대기 압력 분자 이미징

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

눈 Microvessels의 질량 분석 기반 Proteomics 분석을 위한 시료 준비

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

대기압에서 질량 분석법에 의해 단일 ​​세포의 직접 분석

대기압에서 질량 분석법에 의해 단일 세포의 직접 분석