우리는 비디오를 편집 비디오 녹화 및 유용한 조언 씨 하지메 이치 감사합니다. 우리는 또한 비디오 녹화 종류의 조수에 대한 Drs.Yuji Tsunekawa 및 가이치 요시 자키 감사드립니다. 이 작품은 젊은 과학자의 B와 일본의 MEXT에서 우선 분야 - 분자 뇌 과학에 KAKENHI에 의해 지원됩니다. 우리의 지원을 인정 글로벌 COE 일본어 과학 기술기구 (일본 표준시)에서 일본어 과학 기술 주식 회사에서 진화론적인 과학 기술에 대한 일본의 MEXT에서 프로그램 &quot;글로벌 브레인 과학에 대한 기본 및 Translational 연구 센터&quot;와 핵심 연구 (크레스트) .

1. WEC 시스템을 설정 <ol><li> 공동 WEC 시스템 내에서 유입 실리콘 튜브 필터 0.22 μm의 막). </li><li> O 2 (95 %)과 CO 2 (5 %)이있는 가스 실린더의 밸브를 엽니다. autoclaved 물이 들어있는 버블링 병을 통해 드럼에 가스 혼합물을 흐름. </li><li> 50 CC로 가스 혼합물의 흐름 볼륨을 조정합니다. </li><li> 밖은 물통에 실리콘 튜브를하자 및 가스 혼합물의 흐름을 체크 아웃 넣습니다. </li><li> 20 RPM / 분 속도로 드럼을 회전합니다. </li></ol> 2. 문화 매체의 준비 <ol><li> 37.0에서 해동 랫 즉시 - centrifuged (IC) 혈청 ° C B). autoclaved 100 ML의 비커에 해동 혈청에 추가 D를 포도당 (2 MG / ML). 문화 매체는 기본 문화 수준 (예, 후드를 사용)에서 준비되어야합니다. </li><li> 400 희석 : 1 혈청에 항생제 - antimycotic (100X) 액체를 추가합니다. </li><li> 남은 isoflurane을 날려 버리기 (때문에 혈액을 수집하는 동안 쥐를 마취)를 실온 (RT) C)에서 20 분 동안 혈청에서. </li><li> 0.45 μm의 막 필터를 사용하여 배지를 소독. </li><li> 각각의 문화 병의 매체의 3.0 ML를 부어 및 (심판을 참조하십시오. 14) D) 알루미늄 호일로 덮인 실리콘 플러그 각 병의 상단을 밀봉. </li><li> ) Tyrode의 생리 전자를 포함한 서너 처리 배양 접시를 준비합니다. </li></ol> 3. 자궁의 쥐, 고립의 마취 <ol><li> inhalational 또는 비경 anesthetics와 깊이 초과 - 임신 쥐 마취. </li><li> 70 % 에탄올로 anesthetized 임신 쥐의 복부 지역을 청소하십시오. </li><li> 포셉로 피부를 들고) 대형 가위 F로 피부를 절단하여 복벽을 외면 화하다. </li><li> 포셉 한 쌍의로 복벽을 들고) 흉부 수준 g으로 큰 가위로 복부 벽에 U 자형의 큰 길이 incisions을합니다. </li><li> 포셉 한 쌍의으로 왼쪽에 소장 멀리 베어와 난소에 연결된 자궁의 한쪽 끝을 노출. </li><li> 포셉 한 쌍의와 자궁의 끝을 들고 큰 가위로 자궁과 난소의 위치를​​ 잘라. </li><li> 자궁의 다른 쪽 끝을 때까지 자궁 주위의 지방을 절단하여 임신 쥐의 자궁을 가져가라. </li><li> Tyrode의 생리를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 전송합니다. </li><li> 자궁을 제거 후 anesthetics의 과도한 행정이나 자궁 전위로 쥐를 안락사. </li></ol> 4. 자궁에서 태아의 제거 <ol><li> 간단히 Tyrode의 호수에있는 자궁을 씻어) 고급 포셉 H 한 쌍의 두 번째 페트리 접시로 전송할 수 있습니다. </li><li> 쌍안경 현미경, 괜찮아요 포셉 한 쌍의과 자궁 벽을 선택하고 안과 바로 가위를 사용하여 혈관과 연결 mesometrium에 사이드 맞은편에 이번에는 질 벽에 상처를 냈어. </li><li> 이번에는 질 벽에와 decidua 사이의 공간으로 안과 직선 가위 끝에 삽입합니다. 길이 방향 antimesometrial 측면을 따라 자궁 벽을 잘라. </li><li> mesometrial 측면에서 decidua 훌륭한 포셉 I)의 두 쌍을 사용하여 자궁에서 분리 conceptuses 클럼프. </li><li> 적당한 직경 소독 유리 피펫과 함께 세 번째 페트리 접시에 conceptuses을 전송. </li></ol> 5. 쥐 배아의 해부 <ol><li> decidua에 microforceps 중 하나 팁을 삽입하고 포셉의 두 쌍이있는 conceptus 주변 decidua에 가로 절개를합니다. </li><li> placental 측면에서 decidua에 포셉의 도움말을 삽입하고 가기 decidua에 두 개의 세로 incisions합니다. </li><li> 그 포셉 두 쌍이있는 밖으로 추출하여 placental 측면에서 decidua를 제거합니다. 포셉 두 쌍이있는 나머지 decidua를 제거합니다. </li><li> , 레이처트의 막을 들고 그것에 수평 절개를하고, 안티 placental 측면에서 conceptus에서 멤브레인를 구분한다. </li><li> 포셉의 두 쌍이있는 배아의 머리 근처의 난황에 작은 구멍을 확인하고, 안과 곡선 가위로 난황를 잘라. 주요 혈관을 손상하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 좋은 포셉의 두 쌍이있는 배아의 머리 주위의 사이트에서 양막을 선택하고, 부드럽게) 양막 H를 찢어하여 난황에서 배아를 빼낸다. 배아의 본문은 midgestation 단계에서 배아에 대한 산소의 공급을 높일 수있는 난황을 꺼내해야합니다. </li></ol> 6. 전체 배아 문화 <ol><li> 태반, 난황, 그리고 심장 박동과 혈액 순환의 상태에 대한 손해를 확인하십시오. </li><li> 탯줄을 스트레칭하지 알고있는, 이전멸균 유리 피펫있는 문화 병으로 배아. 문화 병에 Tyrode의 생리 이상의 캐리는 최대한 조금해야합니다. </li><li> 회전 드럼에서 비 구멍 실리콘 플러그를 제거합니다. 수직 WEC 시스템의 회전 드럼에 구멍이있는 플러그 문화 병에 연결합니다. 회전 드럼은 아주 좋은 장비이기 때문에 적합하지 방향으로 드럼에 힘을 넣어하지 않도록주의하십시오. 해부 배아를 포함하는 병은 하나의 문화 하나에 전송되며, 보육 정문의 개방)는 j를 감소하는 인큐베이터의 온도를 피하기 위해 최소화되어야합니다. </li><li> 문화의 10 시간 후, (표 1) 24 시간 후 75 CC 최대 100 CC로 가스 혼합물의 흐름 볼륨을 높일 수 있습니다. </li><li> 문화 매체는 신선한 매체와 새로운 문화 병으로 교양 배아를 전송하여 24 시간 주변에 변경해야합니다. 34 시간 후에 125 CC로 흐름 볼륨을 증가 및 48 시간 후에 150 CC (표 1) </li><li> 때로는 심장 박동 속도 (즉, 120-150/min 최적)을 계산하여하고 혈액 순환을 관찰하여 교양 태아의 상태를 확인합니다. 필요한 경우 Tyrode의 호수에있는 태아의 성장을 판단 somites의 개수를 계산합니다. 일반적인 개발, 하나 체절 2 시간에 추가됩니다. </li><li> WEC가 완료되면, 가스 혼합물의 공급을 중단하고 유입 관과 버블링 병의 입구 관으로 흐름을 돌려 방지 필터 멤브레인 연결을 끊습니다. </li></ol> 7. 노트 <ol class="lalpha"><li> WEC 시스템 내부 온도는 지속적으로 37.0-37.5 ° C.에 보관 </li><li> 백퍼센트 쥐 IC 혈청은 일상적으로 쥐, 마우스 배아 저희 WEC에서 사용하고, 사용하기 전에 -20 ° C에 보관됩니다. </li><li> 우리는 isoflurane과 anesthetized 아르 쥐에서 수집 쥐 IC 혈청을 구입할 수 있습니다. </li><li> 일회용 병 이케 모토 리카에서도 사용할 수 있습니다. 병 및 실리콘 플러그는 autoclaved해야합니다. </li><li> 해부 동안 낮은 또는 높은 온도에서 배아의 유지하는 것은 WEC의 후속 개발에 영향을하기 때문에 태아의 해부는 RT에서 수행해야합니다. </li><li> 해부를위한 도구는 건조 열 소독을하고 있습니다. </li><li> 피부 복벽은 가능한 한 그릇에 머리카락의 오염을 피하기 위해 별도로 절단한다. 우리는 우리가 피부를자를 때 그들의 새로운 쌍을 대형 가위와 집게 한 켤레를 변경하고 각각의 자궁을 분리. </li><li> 누구의 조언 정상입니다 포셉를 사용하면 확실하게 조직을 해부하다하는 것은 매우 중요합니다. 우리는 수동으로 돌 및 기계 기름 포셉의 도움말을 선명하게. </li><li> 우리는 배아에 과잉 압력을 피하기 위해 칼과 같은 포셉의 한쪽을 사용합니다. </li><li> WEC 시스템 내부의 온도가 반복 문을 열어 감소하면, 우리는 시스템 내부 온도를 유지하기 위해, 불 켜고 계속. </li></ol> 8. 대표 결과 그림 1은 쥐의 배아와 교양 쥐 배아의 해부의 과정을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. E12.5 쥐 배아의 전체 배아 문화. (A) conceptus은 임신 쥐의 자궁에서 해부 했어요. 태반 사이드에서 decidua의 (B) 제거. 레이처트의 막의 (C) 제거. (D) 난황을 여는. WEC의 시작 후 6 시간에 대한 병 (E) 쥐의 배아 culturing. (F) 쥐의 배아 42 시간을위한 교양. D, decidua, R, 레이처트의 멤브레인, P, 태반, YS, 난황, E, 배아. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 시간 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td><td> 36 시간 </td><td> 48 시간 </td></tr><tr><td> E12.5 쥐 배아 </td><td> 95% 50 CC </td><td> 95% 75 CC (10 시간) </td><td> 95% 100 CC </td><td> 95% 125 CC (34 시간) </td><td> 95% 150 CC </td></tr></tbody></table> 표 1. 최적의 산소 상태.

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	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+rodent+embryos+during+the+early+postimplantation+period.">In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period.</a> Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro.">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li><li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate.">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. 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Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공을 위해 쥐 WEC의 두 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 절개 절차 아니라 특히 태아 손상, 혈관을 정확하게해야합니다. 산소와 영양소가 더 이상 자궁에서 분리 후 태반을 통해 공급 없기 때문에 둘째, 절차는 가능한 한 빨리해야합니다. 이것은 기존의 배아를 위해 중요합니다. E12.5 후 쥐 WEC의 경우, 우리는 30 분 이내에 문화 병으로 해부하는 배아를 전송해야합니다. 우리는 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td colspan="5"> WEC 설정 </td></tr><tr><td> WEC 시스템 (10-0310) </td><td> 도구 </td><td> 이케 모토 리카 </td><td> 010-0310 </td><td> 또 다른 작은 모델도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 구멍없이 실리콘 플러그 </td><td> 도구 </td><td> 이케 모토 리카 </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 혼합물 실린더 </td><td> 도구 </td><td> 닛코 Sanso </td><td> - </td><td> 95 %의 산소 및 5 % 이산화탄소를 포함하는. 맞춤 주문하십시오. </td></tr><tr><td> 가스 조정기 </td><td> 도구 </td><td> 오노 제작소 </td><td> WR - 11 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm의 필터 Millex GS </td><td> 도구 </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> 마취와 자궁의 분리 </td></tr><tr><td> 대형 가위 </td><td> 도구 </td><td> Napox </td><td> B - 7H </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td> 도구 </td><td> Napox </td><td> - 3 - 2 </td><td></td></tr><tr><td> 처리 페트리 접시 (90mm X 15mm) </td><td> 도구 </td><td> 이와키 </td><td> SH90 - 15 </td><td> 딥 타입 접시 해부위한 최상입니다. </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 시약 </td><td> 애보트 </td><td> B506 </td><td> 마취에 대한 </td></tr><tr><td> Pentobarbital 나트륨 </td><td> 시약 </td><td> 셔링 - 플로 동물 건강 </td><td> - </td><td> 마취에 대한 </td></tr><tr><td> Tyrode의 염분 </td><td> 시약 </td><td> - </td><td> - </td><td> 심판의 프로토콜로했다. 2. 4 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 시간 초과 - 임신 스프 라그 - 돌리 랫 </td><td> 동물 </td><td> 찰스 리버스 연구소 일본 </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> 문화 매체의 준비 </td></tr><tr><td> 문화 유리병 </td><td> 도구 </td><td> 이케 모토 리카 </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> 폐기 문화 병 </td><td> 도구 </td><td> 이케 모토 리카 </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> 구멍 실리콘 플러그 </td><td> 도구 </td><td> 이케 모토 리카 </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> 알루미늄 호일 </td><td> 도구 </td><td> 모든 회사 </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Autoclaving 가방 </td><td> 도구 </td><td> Hogy </td><td> HM - 26 </td><td> 문화 병에 대한 </td></tr><tr><td> Autoclaving 가방 </td><td> 도구 </td><td> Hogy </td><td> HM - 14A </td><td> 실리콘 플러그를위한 </td></tr><tr><td> 0.45 μm의 필터 Millex HA </td><td> 도구 </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 관 </td><td> 도구 </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ML의 비커 </td><td> 도구 </td><td> 이와키 </td><td> TE - 32 </td><td></td></tr><tr><td> 랫 IC 혈청 </td><td> 시약 </td><td> 찰스 리버스 연구소 일본 </td><td> - </td><td> 을 참조하십시오 : 미스터 Kunihiko 모리 사키를 TEL : +81- (0) 45-474-9336, FAX : +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+) 포도당 </td><td> 시약 </td><td> 와코 </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - antimyotic 액체 </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 15,240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> 태아의 해부 </td></tr><tr><td> 안과 직선 가위 </td><td> 도구 </td><td> Napox </td><td> MB50 - 7 </td><td> 자궁 벽 절단 </td></tr><tr><td> 안과 곡선 가위 </td><td> 도구 </td><td> Napox </td><td> MB54 - 2 </td><td> 난황을 절단 </td></tr><tr><td> 집게 # 5 </td&gt; <td> 도구 </td><td> 활기 </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 # 5F </td><td> 도구 </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 피펫 </td><td> 도구 </td><td> - </td><td> - </td><td> 파스퇴르 피펫을 사용하여 수작업으로했다. </td></tr><tr><td> Autoclaving 가방 </td><td> 도구 </td><td> Hogy </td><td> HM - 4 </td><td> 유리 pipettes에 대한 </td></tr><tr><td> 쌍안 현미경 </td><td> 도구 </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> 빛 </td><td> 도구 </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> 오일 돌 </td><td> 도구 </td><td> 우치다 요코 </td><td> 833-2000 </td><td> 포셉의 선명에 대한 </td></tr><tr><td> 기계 기름 </td><td> 도구 </td><td> 우치다 요코 </td><td> 835-0000 </td><td> 포셉의 선명에 대한 </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

전체 배아 문화 (WEC) 기술은 신규 및 그의 동료에 의해 ​​1950 년대에 개발하고, 발달 생물학 1 적용되었습니다. 포유 동물 배아의 발전과 성장은 태반의 기능에 매우 의존하고 있지만, WEC 기술은 우리의 배아 일 (E) 6.5 - E12.5 동안 midgestation 단계에 해당하는 제한된 기간 동안 문화 마우스 및 쥐 배아 전 생체내 조건 수 마우스 또는 쥐 2, 3, 4 E8.5 - E14.5. 배아는 현미경으로 조절할 수 있기 때문에 WEC에서, 우리는 직접적으로 고급 유리 모세관을 사용하여 태아의 영역을 원하는 타겟팅할 수 있습니다. 우리가 postimplanted 포유류의 배아 발달의 동적 과정을 공부하고 싶을 때 따라서, 쥐 WEC는 매우 유용한 기술입니다. 최신, WEC 시스템을 여러 종류의는 1을 개발하고 있습니다. 그 중에서도 회전 형 병 문화 시스템은 각각 1 마우스 및 쥐에 E9.5와 E11.5, 후 가장 인기있는 midgestation 즉,에서 배아의 장기적인 문화에 적합합니다. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 새로 콕크 로프트 5, 6에 의해 설계되었지만 원래 회전 시스템의 세련된 모델을 사용 E12.5 후 쥐 WEC의 표준 절차를 입증하고, 포유류의 발달에 연구 WEC 기술의 다양한 응용 프로그램을 소개합니다 생물학.

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The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

전체 배아 문화 기술 문화 마우스 및 쥐 배아 우리에게 수<em&gt; 예 생체내</emmidgestation 단계에 해당하는 제한 기간&gt; 상태. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 회전 형 병 문화 시스템을 사용 E12.5 후 쥐의 배아 전체가 문화의 표준 절차를 보여줍니다.

회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K 조회수.  Tohoku University Graduate School of Medicine. 전체 배아 문화 기술 문화 마우스 및 쥐 배아 우리에게 수 예 생체내 상태. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 회전 형 병 문화 시스템을 사용 E12.5 후 쥐의 배아 전체가 문화의 표준 절차를 보여줍니다.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

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Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.