우리는 해부와 문화 기술과 유용한 조언 A. Hadjantonakis (슬로안 - Kettering 연구소)의 실험실과 L. Niswander (콜로라도 - 덴버 U)의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 L. Niswander와 J. Nadeau (시스템 생물학 연구소)와 공동으로 메르 JDG 및 RO1NS05897에 NRSA NS059562에 의해 지원되었습니다.

1. 문화 미디어의 준비 - 모든 시약은 표 1에 나열되어 <ol><li> 37 해동 남자 쥐 혈청 ° C. </li><li> 55시 30 분에 대한 쥐 혈청을 열 Inactivate ° C </li><li> 상온에서 5 분 10K에 대한 원심의 쥐 혈청 </li><li> 페놀 - 붉은 무료 DMEM w / 높은 혈당과 함께 뜨는와 혼합 50:50를 제거 </li><li> 0.45 음 주사기 필터를 사용하여 미디어를 소독 </li><li> 미디어 / 배아의 최소한 1ml 준비되어야한다 </li></ol> 2. 임신 댐에서 자궁의 분리 <ol><li> 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 절차를 사용하여 임신 댐 먼저 anesthetized하고 다음 경추 탈구하여 희생 </li><li> 70% EtOH로 복부를 소독 </li><li> 큰 집게로 그냥 유두 선 위에 중간선에 따라 피부의 작은 경로를 꼬집어 대형 가위와 집게 아래 복부를 엽니다. 어떤 내부 구조를 손상하지 않도록주의의 </li><li> 전체 복부가 열려 있도록 마우스의 양쪽 방향으로 초기 오프닝에서 옆으로 절단에 가위를 사용하여 </li><li> 창자와 여분의 지방 패드는 종종 자궁을 가리 수 있으며, 이들은 자궁과 난소의 맨 위에는 양쪽에 관찰 할 수 있도록 별도로 이동합니다 </li><li> 난소 아래 자궁의 상단을 핀치과 다른 난소에 자궁의 한쪽에서 절단, 지방에서 자궁을 분리하여 가위를 사용하여 </li><li> 식염수에 페트리 접시에 포셉, 장소와 자궁을 허용 </li></ol> 3. 자궁에서 태아의 제거 <ol><li> 초과 혈액을 제거하고 외부에서 초과 지방을 장식하기 위해 식염수로 자궁을 씻어 </li><li> 방 온도와 깨끗한 접시에 전송합니다. 시각화을 향상시키기 위해 염분 Tyrodes </li><li> stereomicroscope 사용하여 조심스럽게 떨어져 자궁 껍질에 작은 가위 또는 필요할 경우 벌금 (# 5) 포셉 중 하나를 사용하여 각 배아를 구분합니다. </li> &lt;리&gt;하지 피어스 배아에주의하고, 이번에는 질 벽에과 decidua 사이에는 질 벽에 다시 껍질 공간에 멋진 집게를 넣습니다 </li></ol> 4. 배아에서 decidua 제거 <ol><li> 동양 decidua 너무 어두운 부분 (태반)은 당신을 멀리 마주보고입니다 </li><li> 너무 깊이 잘라 않도록 조심하고, 밝은 부분에서 decidua의 어두운 부분을 분리 라인 함께 집게와 절개를합니다 </li><li> ectoplacental 원추형 (EPC)를 찢어 않도록 조심하고, 난황 상단에서 태반의 분리를 완료합니다. 이 시점에서 당신은 난황에 Reicherts 막을 시각화 할 수 있어야한다 </li><li> 하지 피어스 난황에주의되는 전체 decidua를 (밝은 부분)를 제거하기 위해 계속 </li><li> 부드럽게 꼬집어 및 EPC에서 물러나고하여 Reicherts를 제거합니다. EPC가 손상 또는 난황에서 분리되면, 태아는 E8.5 - E9.5에서 정상적으로 설정되지 않을 </li><liReicherts 제거&gt;와 난자는 난황을 통해 쉽게 볼 수 있어야하며 계산 somities에서 개최 수 있습니다. </li></ol> 5. 문화 시스템을 설정 <ol><li> 태아가 난황을 손상시키지 않고 pipetted 수 있도록 개방의 직경을 증가 가위로 플라스틱 전송 피펫의 끝을 잘라 </li><li> 배아 당 미디어 1 ML과 깨끗한 롤러 병을 채우십시오. 3-6 배아의 최대 사용하는 롤러 병의 종류에 따라하는 것은 각 병에 로드할 수 있습니다. </li><li> 가능한 작은 Tyrodes 등으로 운반, 미디어 가득한 롤러 병에 커팅 피펫을 사용하여 배아가있는만큼 미디어를 희석하지 송금 </li><li> 유리 롤러 병의 상단에 고무 플러그 (마개)을 첨부 </li><li> 시일이 플러그와 드럼 사이에 형성되도록 롤러 문화 드럼에 롤러 병을 삽입 </li><li> 일단 모든 병이 첨부되어 있고, 드럼에 빈 슬롯이 w를 봉인되었습니다ith 고무 stoppers은 롤러를 활성화 </li><li> CO 2와 O 2 탱크를 열고 콘센트 밸브는 초 당 한 방울을 공개 있도록 약 2 PSI 그들을 조정할 수 있습니다. E8.5 - E10 배아의, 20 % O 2와 5퍼센트 CO 2를 사용해야합니다. </li><li> 인큐베이터가 37로 설정되어 있는지 확인 ° C와 표지 또는 배아가 빛으로부터 격리되도록 배양기를 닫습니다. </li><li> 태아도 somities의 추가, 회전의 진행, 그리고 신경 튜브 폐쇄의 범위에서 자신의 발전을 평가하기 위해 정기적으로 확인하여야한다 </li><li> 문화 2-3시간 후, 약리 억제제 또는 다른 치료가 언론에 추가할 수 있습니다 </li><li> 연구 설계는 자동차 또는 연구 시약의 비활성 analogues 같은 컨트롤을 포함해야합니다. </li></ol> 6. 전체 배아 문화 이후 개발 평가 <ol><li> 가스를 끄고, 롤러를 중지하고, 배양기에서 병을 제거 </li><li> 전송 배아 다시 Tyrode로stereomicroscope에 따라 평가를위한 배양 접시에있는 s 또는 PBS </li><li> 난황은&gt; 120 분 당 비트, 그리고 혈액 순환을 명백히해야한다 심장 박동을 볼 수도과 심장 박동을해야, 풍선처럼 나타납니다 </li><li> 이전에 난황 제거하기 위해 사진의 배아 필요한 경우 </li><li> EPC 근처에 구멍을 절단하고 배아의 머리와 엉덩이에 걸쳐 난황과 양막을 틀지하여 배아의 난황을 제거합니다. </li><li> 탯줄은 태아의 난황을 분리자를 수 있으며, 난황이 필요한 경우 배아를 genotyping 사용할 수 있습니다. </li><li> 이러한 오픈 두개골 주름, 얼굴 및 / 또는 오픈 꼬리 neuropore의 불완전한 폐쇄로 체절 번호와 신경 튜브 결함에 대한 배아를 검사합니다. 배아는 여러 morphogenetic 변경 Theiler 분류 (에 따라 공연 수 있습니다 <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">emap / home.html을 http://www.emouseatlas.org/</a> 다시)의 사진 기록배아 개발에 유용합니다. </li></ol> 7. 노트 <ol><li> 어떤 별명이나 난황에 눈물이 성공적으로 선회를 방지하고 정상적인 발달을 억제하기 때문에 고품질의 절개가 필수적입니다. EPC는 또한 Reichert의 멤브레인 (RM)의 제거 중에 손상될 수 있으며 EPC가도 부분적으로 난황에서 분리된 경우 배아가 정상적으로 발전하지 않습니다. 그러나, RM의 불완전한 제거는 배아가 또는 RM 세포 문화에 자라다와 정상적인 발전을 방지 둘 다있는 난황 확장, 혈관 수 있습니다 뭉쳐 및 /가 발생할 수 있습니다. </li><li> 썩은 또는 구부러진 집게는 프로 시저가 훨씬 더 어려워하기 때문에 깨끗하고 날카로운 집게가 좋은 절개를 받고하는 비밀입니다. 악기에 단백질 예금은 조직 손상으로 이어질 것입니다. </li><li> 깨끗하고 무균 유리​​병 또한 측면 벽에 고집하고 손상되는 배아를 방지하기 위해 필수적입니다. 전에 실험을 시작하기 위해, 병 SCR해야, 비누와 물로 ubbed DH 2 O에 씻어서, 그리고 물 종기까지 각 병에 물을 작은 양의 microwaved. 병 그 다음 70% EtOH로 씻어서 건조 공기 사용할 수 있습니다. </li><li> 빨리 배아 문화 미디어로 전송 수 있으며 ° C 더 나은 생존을 37로 다시 따뜻하게하기 때문에, 가능한 빨리 작동합니다. </li><li> 각각의 배아가 배아의 성장에 차이를 만드는 피하기 위해 시간의 동일한 금액에 실온에서되도록 롤러 병 어떤 배아를 전송하기 전에 전체 쓰레기를 해부 완료 </li><li> 문화의 세균 오염을 방지하기 위해 멸균 환경을 유지합니다. 우리 문화 실험은 항생제없이 수행하지만, 많은 실험실은 박테리아의 성장을 방지하기 위해 미디어에 항생 추가되었습니다. 이 실험의 시작 부분에 있었어요으로 매체 실험의 끝에처럼 맑은 나타납니다. 미디어 흐린되었다 또는 가시 침전물이있다면 절약 가능성이 높습있다당신의 문화를 감염 tamination. </li><li> 비효과 가스 교환도 배아 개발 지연 때문에 지속적인 전달을 보장하는 안정적인 조절을 확인하실 수 있습니다. </li><li> 배아는 전직 생체내 문화에 약 50 % 느린 개발, 그러므로 당신이 실험의 완료 개발의 적절한 단계에 도달했는지 확인하기 위해 somites를 계산하는 것이 필수적입니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : 배아의 모양 사전 및 사후 롤러 문화 그림 1에서 보여주고있다. 해부 당시 태아는 꼬리가 머리 폴드 뒤에 선반 가공을하지 않은 구성 (그림 1A, D)에 있어야합니다. 문화의 36 시간 후, 배아들은 꼬리가 머리 (그림의 1B, C, E, F)의 앞에있는 C - 곡선, 태아형 자세에서되도록 전환 완료해야합니다. RhoA 키나제 저해제 (Y - 27632), 동안 집중 확장 알려진 억제제 약리 조작neurulation (Ybot - 곤잘레스, 2007), 그들의 주동이의 - 꼬리 축 (그림 1E, F)을 따라 배아 및 두개골 신경 배 폐쇄를 억제의 단축을 초래합니다. 우리의 데이터는 Y - 27632의 양이 점차 증가 두개골 배 폐쇄 impairs (그림 2A) 및 다운 스트림 RhoA는 두개골 neurulation과 집중 확장 신호의 역할과 일치 바디 축 (그림 2B)를 단축 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> 그림 1. 약리 억제제 Y - 27632와 함께 문화 배아 및 조작의 외관. 이전에 전체 배아 문화 E8.5에서 (A, D)를 해부 배아 (B, E) 난황 롤러 문화의 36hrs에, 아직도 건재 이후로 E10에 태아. (C, F) 난황은 성공적인 전환과 신경 튜브 폐쇄를 설명하기 삭제되었습니다. Rho 키나제 억제제 Y - 27632 (E, F)로 처리되었습니다 배아는 제대로 수렴 확장자를 받아야하고 설명하는 데 실패짧은 바디 축. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> 그림 2. 두개골 신경 튜브 폐쇄 및 축 신장에서 RhoA의 키나제 억제제의 효과. (A) (% NTC = 비율 신경 튜브 폐쇄)은 두개골 주름을 성공적으로 닫을 수 있었다 배아의 비율은 Y - 27632의 복용량 비교 문화 미디어에 추가됩니다. (B) 귀의 소포와 forelimb 사이의 거리는 상당히 Y - 27632의 증가 복용 (P는 &lt;0.05)에서 감소했다.

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	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

개발하는 동안 배아에 내장하는 사람에서 산모, 자궁 내 요인을 구분하는 능력은 embryogenesis의 모든 단계를 공부를위한 중요한 도구입니다. 여기함으로써 약물의 산모 대사의 변수를 제거 두개골 neurulation의 전 제품 utero에서 RhoA의 키나제의 작은 분자 억제제의 효과를 분석했습니다. 이 약리 조작 두개골 neurulation과 집중 확장에 지대한 영향을했습니다. 이 화합물에 감도는 서로 다른 유전자 돌연변이 마우스 가운데 비교할 수 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 시약의 다양한 사용하여 배아에서 세포 기능의 직접 조작하므로 개발에있는 다른 분자 경로의 연구에도 적용될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 해부에 대한 Stereomicroscope </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> 정밀 보육 </td><td> BTC 공학 (영국) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> 회전 병 문화 단위 </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> 단위 회전을위한 유리병 </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 고무 마개 </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 고무 코르크 </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 버블러 인렛 </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 버블러 유입 함정 </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> 가스 버블러 아울렛 </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> 봄베 </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, CO 2 5퍼센트 </td></tr><tr><td> 가스 조정기 </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 남성 쥐 세럼 </td><td> 할란 실험실 </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM W / O 페놀 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> 31,053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ML 주사기 </td><td> BD </td><td> 309,604 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> 대형 분석 해 봅시다 가위 (둔기 팁) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> 엑스트라 파인 본에서 가위 </td><td> 좋은 과학 도구 (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><tD&gt; Dumot # 5 포셉 </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode의 염분 </td><td></td><td></td><td> 마찬가지로 1990 년 Cockroft 설명 </td></tr><tr><td> 10cm 일회용 페트리 접시 </td><td> BD </td><td> 351,029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

유전자 마우스 모델은 포유류의 신경 튜브 폐쇄의 연구에 중요한 도구입니다 (회색 &amp; Ross에서 2009 년, 로스, 2010). 그러나, utero에서 마우스 배아의 연구는 직접 pharmacologically 관심 시약에 산모 대사의 영향으로부터 격리 배아를 조작하기 위해 무능력에 의해 제한됩니다. 다이어트를 통해 또는 사출에 의해 작은 분자, 재조합 단백질, 또는 siRNA, 어머니 이러한 물질의 전달을 사용하든하면 그들은 배아에 도달하지 못하도록 할 수 신체적 방어의 다양한 이러한 불안 정한 화합물을 적용합니다. 전체 배아의 문화의 조사는 개발에 본질적인 영향 태아에서 산모 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 절개 후 정상적인 신경 튜브 폐쇄 (크로켓, 1990)을 허용 롤러 인큐베이터 기기에서 높은 농축 미디어를 사용 culturing 마우스 배아에 대한 방법을 제시한다. 일단 문화, 배아 수배아는 utero 아직이라면 그렇지 않으면 불가능했을 체외 기법에서 기존 사용하고 조작합니다. 배아 형제 자매는 (두개골 접어 꼬리 neuropore의 결론에 E9.5 - 10 E7 - 7.5에서 발생 neurulation의 다양한 측면을, (neurulation의 개시에 직전 신경 판 형성) 연구에 여러 시간 지점에서 수령 가능 클로저, 카우프만은, 1992). 이 프로토콜에서는, 우리는 두개골 neurulation의 학습을위한 최적의 아르 timepoints에서 배아를 해부위한 방법을 보여줍니다. 배아는 신경 튜브 폐쇄의 개시 이후지만, 이전에 배아 돌려 두개골 신경 접어 클로저로, E8.5 (약 10-12 somities)에서 해부하고, E10 (26-28 somities)까지 문화에 유지됩니다 때 두개골 neurulation가 완료되어야합니다.

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Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

산모 신진 대사를 무시 neurulation 동안 마우스 배아의 직접적인 약리 조작에 대한 허용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 시점과 약리 에이전트를 변화하여 neurulation의 다양한 측면을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다.

마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K 조회수.  Weill Cornell Medical College. 산모 신진 대사를 무시 neurulation 동안 마우스 배아의 직접적인 약리 조작에 대한 허용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 시점과 약리 에이전트를 변화하여 neurulation의 다양한 측면을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

3D 신경 줄기 세포 문화 번역하는 단백질 : 하이브리드 시각화 방법론

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

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Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

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The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are located in the dorsal spinal cord and send their axons along stereotyped trajectories. Commissural axons initially project ventrally towards and then across the floorplate. After crossing the midline, these axons make a sharp rostral turn and project longitudinally towards the brain. Each of these steps is regulated by the coordinated activities of attractive and repulsive guidance cues. The correct interpretation of these cues is crucial to the guidance of axons along their demarcated pathway. Thus, the physiological contribution of a particular molecule to commissural axon guidance is ideally investigated in the context of the living embryo. Accordingly, gene knockdown in vivo must be precisely controlled in order to carefully distinguish axon guidance activities of genes that may play multiple roles during development.
Here, we describe a method to knockdown gene expression in the chicken neural tube in a cell type-specific, traceable manner. We use novel plasmid vectors3 harboring cell type-specific promoters/enhancers that drive the expression of a fluorescent protein marker, followed directly by a miR30-RNAi transcript4 (located within the 3'-UTR of the cDNA encoding the fluorescent protein) (Figure 1). When electroporated into the developing neural tube, these vectors elicit efficient downregulation of gene expression and express bright fluorescent marker proteins to enable direct tracing of the cells experiencing knockdown3. Mixing different RNAi vectors prior to electroporation allows the simultaneous knockdown of two or more genes in independent regions of the spinal cord. This permits complex cellular and molecular interactions to be examined during development, in a manner that is fast, simple, precise and inexpensive. In combination with DiI tracing of commissural axon trajectories in open-book preparations5, this method is a useful tool for in vivo studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance. In principle, any promoter/enhancer could be used, potentially making the technique more widely applicable for in vivo studies of gene function during development6.
This video first demonstrates how to handle and window eggs, the injection of DNA plasmids into the neural tube and the electroporation procedure. To investigate commissural axon guidance, the spinal cord is removed from the embryo as an open-book preparation, fixed, and injected with DiI to enable axon pathways to be traced. The spinal cord is mounted between coverslips and visualized using confocal microscopy.

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

A method by which gene expression in the neural tube can be downregulated in a cell type-specific, traceable manner is described. We demonstrate how in ovo electroporation of microRNA-based plasmids that elicit spatiotemporally controlled RNA interference can be used to investigate commissural axon guidance in the developing neural tube.

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Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

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Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

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The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...