이 방법은 포유류의 형성을 따라 가스를 이해하는 데 기본이 될 것입니다. 모성 자궁 안쪽에 오랫동안 숨겨져 있던 배아 단계 도중 살아있는 태아에 있는 실험을 허용해서. 그것은 최대 6 일의 연장된 기간 동안 자궁 외부 마우스 태아의 효율적이고 적당한 성장을 계속합니다.
가스 농도 와 압력의 신속하고 적절한 배아 해부 및 선기량은 성공적인 배아 성장을위한 가장 중요한 단계입니다. 7.5일 이상 진행된 마우스 배아를 배양하기 시작하려면 배아 해부 전에 최소 1시간 동안 롤러 배양 인큐베이터 시스템의 회전기 및 가열 장치를 켭니다. 또한 가스 입구 병과 출구 테스트 튜브에 오토클레이브 물을 추가합니다.
다음으로, 메인 스위치를 눌러 가스 레귤레이터 모듈을 켜고, 각 컨트롤러를 사용하여 산소 및 이산화탄소 값을 5%로 설정하고 압력 송신기의 전압 스위치를 이동하여 가스 압력을 평방 인치당 약 6.5~7파운드로 설정합니다. 디지털 압력 게이지를 사용하여 가스 압력 값을 확인합니다. 정밀 인큐베이터 내부에 할당된 출구 수충전 테스트 튜브 내부에서 생성된 기포의 속도를 확인하여 가스 흐름을 모니터링합니다.
물병 뚜껑에 가스 흐름 밸브를 닫거나 열어 적절한 거품 속도를 설정합니다. 가스 흐름이 초당 2~4개의 거품 속도로 기포를 형성할 수 있도록 하거나 거품이 가득 찬 출구 튜브에 나오는 첫 번째 지점에서 거품 흐름을 설정할 수 있는지 확인합니다. 다음으로, 배양 배지의 2 밀리리터로 배양 병을 채웁니다.
속이 빈 실리콘 번그를 사용하여 병을 밀봉하고 1 시간 동안 미리 평형하기 위해 속이 빈 회전 드럼에 연결합니다. 솔리드 번그를 사용하여 회전 드럼의 빈 공간을 밀봉상태로 유지합니다. 다음으로, 안락사 된 임신 한 여성 마우스에서 배아를 해부.
70%에탄올로 복부를 청소하고 가위를 사용하여 피부와 복부를 잘라냅니다. 자궁의 한쪽 끝을 찾아 난소와 자궁 사이의 교차점에 잘라. 다른 쪽 끝까지 자궁을 따라 절단을 계속하고 DPBS로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시로 전송합니다.
DPBS의 개념을 신속하게 세척하고 쌍으로 잘라 배아 처리를 용이하게합니다. 모든 개념 쌍을 60mm 페트리 접시에서 미리 평형된 해부 배지로 이동한 다음 개별 개념으로 잘라냅니다. 다음으로, 한 쌍의 총 집게를 사용하여 자궁 조직을 찢어 개념의 자궁 벽을 제거한 다음 미세한 미세 수술 용 집게를 사용하여 배 모양데시두아의 끝을 자른다.
긴 축에 평행배 옆에 있는 집게를 삽입하고 집게를 열어 데시두아를 반으로 나눕다. 마지막으로, 미세 한 집게를 사용 하 여, 데시두아에서 배아를 잡고 태아에서 정수리 노른자 자루를 껍질, 계란 실린더에 부착 된 그대로 ectoplacental 콘을 떠나. 에피블라스트에 손상을 보이지 않는 신경판 또는 초기 헤드 폴드 스테이지에서 배아를 선택합니다.
병당 5~6개의 선택된 배아를 미리 평형유리 배양병으로 옮기고 회전 배양 시스템에 병을 섭씨 37도, 산소 5%와 이산화탄소 5%의 대기로 배치한다. 배양 배양 소회 및 조기 위질 배아 및 정적 플레이트에, 8 웰 플레이트의 각 우물에 갓 준비 된 전 자궁 배아 배양 배지의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 이산화탄소 인큐베이터 내부에 플레이트를 37도의 섭씨로 배치하여 사전 평형을 제공합니다.
이전에 입증된 바와 같이 자궁에서 배아를 해부한 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 8웰 플레이트의 각 우물로 개별 배아를 옮기고 37°C에서 5%의 이산화탄소로 인큐베이터 내부에 플레이트를 배치한다. 스테레오 현미경으로 배아를 이미지하고 명백한 손상없이 라이처트의 멤브레인없이 잘 형성 된 양수 공동을 가진 사람들만 배양을 선택합니다. 7.5일 전배아에 대한 이 프로토콜에 기재된 롤러 배양 조건은 4배양일 후에 평균 효율이 75%에 가까운 일정하고 정상적인 배아 성장을 지원합니다.
배아 발달의 효율성은 다양한 마우스 유전 배경에 따라 다르지만 일관되게 견고합니다. HCS 대신 HBS를 사용하면 4일간의 문화가 발생한 후 약 68%의 효율을 얻을 수 있습니다. 6.5 배아와 정적 플레이트의 발달은 HCS와 HBS를 모두 가진 전 자궁 배아 배양 배지를 사용하여 90% 이상의 효율로 올바르게 재구성됩니다.
배아를 예식하는 것에서 시작하여 배아의 46%의 효율을 초기 소미트 단계에 표시하고 배아의 거의 17%는 문화의 6 일 후에 적당한 발달을 완료합니다. 형태 발생 및 조직 개발은 42 개의 소미트까지 제대로 진행됩니다. 배아일 7.5, 6.5 및 5.5로부터 시작된 배아배에서 관찰된 대표적인 발달 결함이 여기에 나와 있다.
에피블라스트 또는 라이허트의 막을 유지하는 배아에 경미한 손상을 입은 배아는 버려야 합니다. 초기 배아는 제대로 성장하지 않거나 심한 발달 지연을 표시하지 않을 것이며, 플레이트 표면에 배아 에피블라스트를 부착하면 추가 배아 발달의 실패가 발생할 수 있습니다. 결함이 있는 태아에서 관찰되는 주요 이상은 신경 주름의 성장에 있는 노른자 자루 또는 결점 외부의 후방 영역의 발달입니다.
5.5일 령 배아로부터 개발된 배양에서 발달 결함은 작고 저개발 된 에피블라스트의 존재가 빈번히 관찰된다. 이 방법을 사용하여, 연구원은 이식 한 후 배아를 개발하는 물리적 또는 화학 적 조작의 다양한 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 조작, 세포 이식 또는 혈통 추적.
이 방법은 이식 후 마우스를 연구하는 방법을 매우 자세하게 개발할 뿐만 아니라 인간과 같은 다른 종의 배아에서 유사한 배양 방법을 구현할 수 있는 길을 열어줍니다.
