저자 박사 제임스 밤버그 이러한 연구 협력에 대한 그의 연구실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 NIH의 보조금 HD19950, EY07133에 의해 그리고 미네소타 의료 재단 교부금에 의해 투자되었다.

rhodamine - 굴지 라벨 들어, 뉴런은 35mm 플라스틱 요리의 하단에 배치, 또는 &quot;비디오&quot;메뉴로 접착 coverslips에 유리 coverslips에 양식 있습니다. 1. Coverslips 또는 &quot;동영상&quot;요리 준비 <ol><li> 많은 종류의 연결을 체외 기판에 접착제로 저조한 있습니다. 그들이 적절하게 청소하고 준비하지 않는 경우이 절차에 필요한 유리 coverslips는 충분한 신경 세포 - 기판 접착력을 허용하지 않을 수 있습니다. 유리 coverslips을 세척하고 청소 산성에 대한 자세한 절차는 뱅커와 고슬린으로 편집한 도서 Culturing의 신경 세포에 설명되어 있습니다. 또는 avidly 기판 분자를 바인딩 coverslips, 위해 nitrocellulose 코팅이 단계 1.7 아래 1.8에 설명되어 있습니다. </li><li> 유리 coverslips (예 : 18mm의 사각형 또는 24mm 원)는 DH 2 O에 씻어서 유기 성분을 제거하는 드라이 열을 가능한 (≥ 225 ° C) 한 (며칠 최소 최대 3 개월 이상으로)에 구운 아르 화합물. 1.6 또는 1.3으로 진행 동영상 요리 단계로 이동합니다. </li><li> 고해상도 videomicroscopy에 얇은 투명 유리 기판을 만들려면, 적절한 직경의 원형 구멍 전기 코크 송곳 (또는 이와 유사한 악기)를 사용하여 35 또는 50mm 플라스틱 페트리 또는 조직 문화 요리의 바닥에 뚫고있다. 드릴링은 플라스틱 균열 피하기 위해 가벼운 압력으로 천천히 이루어집니다. 뚫고 구멍의 가장자리는 양쪽으로 부드러운 표면을 만들 가위로 스크랩한 있습니다. </li><li> 1.1 또는 1.2에서 설명한대로 유리 coverslips는 조직 문화의 사용을 위해 청소하고 있습니다. Coverslips은 무독성 실리콘 수족관 시멘트 (18x18mm의 coverslips 들어, 12mm 직경 비트를 사용)를 사용하여, 구멍을 통해 장소에 붙어있다. 시멘트는 24 시간 동안 치료합니다. </li><li> (다음 단계는 살균 조건을 사용하여 완료) 비디오 요리 살균 DH 2 O 3 번 씻어서 건조 공기에 사용할 수 있습니다. </li><li> Coverslips이의 연결을 문화 기판 분자로 코팅하고 있습니다. 첫째, coverslip의 표면 (18x18 coverslip 250 μL) 100 μg / ML humidified 38 ° C 배양기에서 4-8 시간 (또는 야간)을 PBS에 폴리 - D - 라이신의 솔루션을 코팅합니다. Coverslips 그때 폴리 - D - 라이신 언바운드을 제거하는 살균 DH 2 O 3 번 씻어서 건조 공기 사용할 수 있습니다. 많은의 연결 타입은 혈청 단백질이 배지에 포함되어있다면, 폴리 - D - 라이신 혼자와 코팅 coverslips에 양식 있습니다. 그러나, 생체내 조건에서 더 관련성이 높은 결과 자연 기판 분자를 사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 laminin, fibronectin 또는 L1 CAM (1-20 μg / PBS에 ML) 이러한 분자의 솔루션은, 직접적으로 4-8 시간이나 야간을위한 폴리 - D - 라이신 코팅 coverslips에 적용하지만, 우리가 실험실에서 우리는 정기적으로 수 외투 단백질 기판 바인딩을 높이기 위해 세포 유착 분자를 적용하기 전에 nitrocellulose의 박막으로 준비 coverslips. </li><li> 백퍼센트 아밀 아세테이트 5 ML에 5g의 nitrocellulose를 용해하여 1 % nitrocellulose 솔루션을 확인하십시오. coverslip이 솔루션을 10 μL를 적용하고 부드럽게 표면을 통해 그것을 확산. 에어 건조 10 분. </li><li> 25 μg / ML laminin 또는 4 μg / PBS에 ML L1 CAM 및 nitrocellulose 표면에 걸쳐의 솔루션을 250 μL을 적용합니다. humidified 38 ° C 배양기, 기음 기판에 4 시간 (또는 야간) 부화 즉시 배지를 추가, 기판이 건조하지 않도록. </li></ol> 2. 의 연결을 문화의 준비 <ol><li> 배아 일 7.2 여자의 배아는 계란에서 제거하고 stereomicroscope를 사용하여, 흉부 및 복부의 내장을 제거하는 절개 10 % 혈청 배지를 포함 100mm 배양 접시에 배치됩니다. </li><li> 배아는 다음 매체 씻어서 액체 매체와 60mm 요리로 옮겨 더욱 등의 루트 신경 (DRG) 또는 신경 망막 조직의 explants을 제거하고 준비를 해부하고 있습니다. 방법과 홀렌백 및 밤버그하여 편집한 셀 생물학, 신청 : 자세한 해부 설명은 세포 생물학, 볼륨 71, 뉴런의 방법에서 찾을 수 있습니다. DRG의 explants는 1/2-whole 신경이며, 망막 신경 explants 직경이 1mm 이하입니다. </li><li> 외부 조직의 explants 청소 후, 개별 explants는 문화 매체와 문화 요리에 이미있는 coverslips에 시계 집게로 이동됩니다. 해부 현미경, explant는 부드럽게 인큐베이터로 운반하는 동안 움직임을 방지하기 위해 집게로 coverslip의 중심을 누르면됩니다. Explants는 산도 7.4-10 MM HEPES와 버퍼와 humidified 38 ° C 배양기에서 하룻밤 배치 B27 첨가제와 F12 매체 양식입니다. 필요에 따라 성장 요소는 문화 매체, 추가할 수 있습니다. E7 DRG 뉴런이 추가 neurotrophins없이 explants에서 axons을 연장할 수 있지만 Neurotrophins는 종종 기존의 배아에서 문화를 DRG에 추가됩니다. 신경 망막의 Explants이없이이 문화 매체 axons을 확장성장 요인을 dding. </li><li> 문화는 아래의 절차를 시작하기 전에 충분한 axonal 가지를 허용하기 위해 최소한 18 시간 동안 incubated 수 있습니다. </li></ol> 3. Rhodamine - 굴지의 Permeabilization 버퍼의 준비 <ol><li> 138 MM KCl, 10 MM 파이프, 3 MM EGTA, 4mm짜리 MgCl 2, 1 % BSA (산도 = 6.9)이있는 permeabilization 버퍼의 주식 솔루션은 4 명이 C11에서 이주까지 계속하실 수 있습니다. 그냥 사용하기 전에 다음 구성 요소의 최종 농도에 대한 추가됩니다 : 0.025 %의 사포닌, 0.1 MM ATP, 100 nm의 알렉사 - 형석 350 phalloidin합니다. </li><li> 별도의 솔루션은 또한 신선하게 바로 이와 같은 구성 요소를 더한 0.45μM rhodamine 비 근육 굴지 솔루션 교대 vortexed와 rhodamine - 굴지의 대단히 짧은 시간을 해산 5 분 tritrated이다와 함께 사용하기 전에 준비하고, 초기 permeabilization 단계 중 한 분 vortexed입니다 튜브의 중합을 방지하기 위해. 그럼에도 불구하고, 튜브의 필라멘트 조립에 문제가있을 경우,이 솔루션은 사용하기 전에 centrifuged 수 있습니다. </li></ol> 4. F - 굴지 이던가 끝에 Rhodamine - 굴지의의 연결을 문화와 정관의 Permeabilization <ol><li> DRG 또는 망막 explants와 문화 요리는 조심스럽게 인큐베이터에서 제거되고 다음 단계는 실온에서 수행됩니다. </li><li> 솔루션의 모든 변경은 신중하게 이루어져야합니다. 피펫 팁는 coverslip의 가장자리에 배치해야하고, 솔루션은 제거하고 천천히 그리고 최소한의 힘으로 추가되어야합니다. </li><li> 문화 매체는 조심스럽게 피펫으로 제거하지만 꾸준히, 그리고 세포를 커버하기에 충분한 permeabilization 버퍼는 1 분 (18mm X 18mm coverslip, ~ 60 μL를위한)에 대한 추가됩니다. 문화 permeabilization 버퍼를 추가하기 전에 다른 솔루션과 씻어서되지 않으며 coverslip은 permeabilization 버퍼를 추가하기 전에 건조 허용되지 않습니다. </li><li> permeabilization 버퍼는 부드럽게 피펫으로 제거 4 분 0.45 μm의의 rhodamine 비 근육 굴지 포함된 permeabilization 버퍼로 대체됩니다. </li><li> 4 % paraformaldehyde (실험실 학년, 인산염 버퍼, pH를 7.3로 만든), 0.05 %의 글루 타 알데히드와 10 %의 자당의 솔루션을 추가하여 rhodamine - 굴지 함유 버퍼 부드럽게 피펫으로 제거하고, 신경이 고정됩니다. 5 분 고정 후 coverslips는 부드럽게 PBS로 씻어서 있으며, 3 인치 유리 슬라이드에 Slowfade에 장착. </li><li> 변화하는 솔루션에 다른 접근법은 흐름 세포를 사용하는 것입니다. 이것은 상업적으로 사용 가능한 유동 세포 수, 또는 간단한 흐름 세포는 coverslip의 모서리에 스페이서로 플라스틱 작은 조각 (두께 ≤ 1mm)을 넣어 만든 다음 위에 동일한 크기 coverslip을 장착 수 coverslip. 솔루션은 흐름 세포의 한쪽에 피펫을 배치하고 반대편에서 심지 (솜 또는 Kimwipe)와 솔루션을 철수하여 교환할 수 있습니다. </li><li> F - 굴지 가시까지 성장 콘에서 F - 굴지의 형광 - phalloidin 라벨에 rhodamine - 굴지의 결합은 60X 기름 침지 목표를 통해 에피 형광 광학과 시각이며, 이미지가 냉각 CCD 카메라를 사용하여 수집하고 있습니다. 공촛점 현미경을 향상 영상을 제공할 수 있습니다. </li><li> rhodamine - 굴지의 정관의 최고의 부량 모든 이미지는 각 이미지에 대한 디지털 카메라 감도 같은 이득 및 노출 설정을 사용하여 단일 세션에서 수집해야합니다. 라벨의 분석은 각 이미지의 상당 지역에서하여야한다, Metamorph, 이미지 J 또는 이미지 분석을위한 유사한 컴퓨터 도구를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 이 절차의 변형 5. 유사 한 : 이전 Rhodamine - 굴지의 레이블에 라이브 셀 이미지를 수집 <ol><li> 비디오 요리는 예열 현미경 스테이지에 배치하고 있으며, 라이브 성장 원뿔 이미지는 회수됩니다. Gridded coverslips 사용할 수 있습니다, 또는 새겨져 및 / 또는 coverslip에 펜 자국은 더 쉽게 라벨 이후에 특정 세포를 찾을 만들 수있는, 또는 비디오 접시는 절차의 기간에 대한 현미경 단계에 위치에 고정하실 수 있습니다. </li><li> rhodamine - 굴지의 Permeabilization, 정관 및 세포 고정은이나 현미경의 무대 역시 비디오 접시에 실시하고 있습니다. 고정 후 PBS는 즉시 이미지에 대한 동영상 요리에 추가됩니다. 나중에 이미지에 대한 샘플을 보존하려면 slowfade 설치 매체가 coverslip에 추가되고 동일한 크기의 coverslip는 부드럽게 (거품을 피하기 위해) 상단에 배치되고 가장자리는 다음 투명 매니큐어로 밀봉하고 있습니다. </li></ol> 6. 유사 둘째, 공동 레이블 추가 단백질 Immunochemistry <ol><li> (4.2-4.4) 위에서 설명한 Rhodamine - 굴지의 설립과 고정은 coverslips 또는 동영상 요리 교양 뉴런 실시하실 수 있습니다. </li><li> 고정 후, 및 PBS의 rinsing, 세포는 PBS에 0.​​1 M 글리신과 함께 15 분 치료 후로 추출 0.1 % 트리톤 X - 100 1 H.위한 2 %의 염소 혈청과 1 % BSA와 PBS에서 (TX - 100) Coverslips1 H.에 대한 1 % BSA가 포함된 PBS에 희석 기본 항체와 incubated 아르 coverslips 그런 다음 씻어서 1 H.에 대한 1 % BSA와 PBS에서 1:1000 희석에 형광 차 항체를 적용하기 전에 2 % 염소 혈청과 1 H 1 %의 BSA와 PBS의 TX - 100, 0.1 %에 incubated 아르 rinsing 후, coverslips 다시 30 분 2 % 염소 혈청과 1 % BSA와 0.1 % PBS에서 TX - 100 incubated 씻어서, 및 안티 변색 중간에 탑재하고 있습니다. 어떤 단백질의 지방화는 초기 permeabilization 단계 (4.3)에 의해 중단될 수 있습니다. 항체와 지역화, 0.05 %의 paraformaldehyde와 0.05 %의 글루 타 알데히드 이러한 단백질을 유지하는 것은 rhodamine - 굴지하여 가시 최종 라벨링에 영향을주지 않고 (rhodamine - 굴지 추가하기 전에 즉, 1) 분 permeabilization 버퍼에 추가할 수 있습니다. </li><li> 트리플 표시 성장 원뿔의 이미지는 형광 또는 공촛점 현미경에 의해 저장됩니다. </li></ol> 7. 유사 세 : F - 굴지 무료 이던가 엔드에 대한 지침의 단서의 효과 평가 <ol><li> 성장 인자 또는지도 큐를는 인큐베이터에서 접시를 제거하고 permeabilization 절차를 시작하기 전에 몇 분 동안 몇 NG / ML (또는 적절한 치료 시간)의 농도에서 보육의 문화 요리에 추가됩니다. 이것은 F - 굴지없는 가시 끝에 성장 요인이나지도 단서의 단기 효과 평가를하실 수 있습니다. </li><li> 의 연결을 문화와 동영상 요리는 예열 현미경 스테이지에 배치 될 수 있으며, 성장 요인이나지도 단서는 permeabilization와 rhodamine - 굴지의 설립을 시작하기 전에 성장 원뿔 근처의 구배에 micropipette에서 발표하실 수 있습니다. 예를 들어, NGF는 신경 망막 신경절 세포에 대한 신경이나 netrin를 DRG에 대한 공개 수 있습니다. 피펫은 permeabilization 절차를 시작하기 전에 같은 짧은 1-2로 분 동안 도입하실 수 있습니다. 이것은 성장 원뿔 선도 마진 (이미지에 대한 참조 인용문 10 참조) F - 굴지 무료로 가시 종료의 형성에지도 큐 기울기의 로컬 효과 평가를하실 수 있습니다. </li><li> 이러한 변화는 위의 6.2에서 설명한 기타의 연결 구성 요소의 항체 - 매개 라벨과 조합하여 사용할 수 있습니다. </li></ol> 8. 유사 푸르 : Transfected 뉴런에서 F - 굴지 무료 이던가 최종 라벨링 <ol><li> RNAi를 (형광등 식별 표시와 함께)를 사용하여 constitutively 활성 또는 지배 - 부정적인 구성이나 단백질 분해의 사용은 F - 굴지 무료 가시 끝이 규제에 단백질의 개입을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 성장 원뿔 내에 단백질의 지방화에 따라, 그리고 그것이 형광등 태그에 융합 경우, transfected 세포에 형광 단백질을 표현 permeabilization시 손실될 수 있습니다. 이 경우, 비디오 요리 미세 permeabilization 전에 transfected 세포를 식별하는 데 사용될 수 있으며, permeabilization는 transfected 세포의 위치를​​ 표시한 다음, 현미경 스테이지에서 수행할 수 있습니다. 또는 GFP - 굴지의 건설은 관심의 GFP - 건설과 함께 공동 transfected 수 있습니다. 이 경우, GFP - 굴지는 F - 굴지에 포함되며, permeabilization 후 transfected 세포의 식별을 가능하게, permeabilization에 의해 손실되지 않습니다. </li><li> 이 변화는 위의 7.1-7.3에 설명한 바와 같이,지도 신호의 추가와 함께하실 수 있습니다. </li></ol> 9. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. NGF의 글로벌 또한 DRG 성장 원추가 5 분 신경 성장 인자 (NGF)에 자극을 때, 굴지의 중합은 최고의 여백에 자극합니다. 총액 F - 굴지과 성장 원추 최고의 마진에서 F - 굴지 가시 끝을을 증가 시키며, rhodamine - 굴지 라벨의 밝은 밴드는 성장 콘 주변 볼 수 있습니다. 그림 1은 unstimulated DRG 성장 원뿔과 NGF 자극 DRG 성장 원뿔에 rhodamine - 굴지의 설립을 비교합니다. 병합된 이미지의 녹색 형광이 phalloidin의 성장 원추의 F - 굴지에 대한 라벨과 빨간 rhodamine - 굴지의 라벨입니다. 가시 끝 라벨을 잘 제어는 단계 4.2 4.3에서 permeabilization 버퍼에 10-6 M 이상 cytochalasin B 또는 D를 추가하는 것입니다. Cytochalasins 캡 F - 굴지 가시 끝이 및 가시 엔드에 rhodamine - 굴지 바인딩 억제. 이것은 심각하게 감소하거나 셀에 rhodamine - 굴지의 결합을 제거한다. 스케일 바, 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. NGF 그라디언트 로컬 F - 굴지 가시 끝을을 증가시킵니다. 릴리즈 NGF가 F - 굴지의 무료 가시 끝을 라벨 뒤에 2 분 동안 DRG 성장 원뿔의 한쪽으로 가져온 것을 micropipette가. 아래의 이미지는 NGF의 그라디언트 로컬 가깝게 피펫으로 성장 원추 지역에서 F - 굴지 무료 가시 종료 증가를 자극 해당 노출을 보여줍니다. 병합된 이미지는 녹색으로 phalloidin을 보여줍니다그리고 빨간색 rhodamine - 굴지. 스케일 바, 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 활성 음의 단백질은 성장 원추 최고의 여백에 축적. phospho-Ezrin/Radixin/Moesin의 Immunocytochemical 라벨 (펌)를 F - 굴지 무료 가시로 끝납니다. 글루 테르 알데히드 (0.05 %)과 paraformaldehyde (0.05 %)은 음의 현지화을 보존 한 분의 초기 permeabilization 버퍼에 추가되었습니다. Rhodamine - 굴지, 빨강, 파마, 녹색, phalloidin, 파랑. 스케일 바, 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 굴지의 중합의 자극 활성 음의 단백질이 필요합니다. Dissociated DRGs는 GFP - 굴지와 GFP 컨트롤 플라스미드 또는 지배 음수 Ezrin / Radixin / Moesin (DN 안건) 건설과 함께 공동 transfected되었습니다. GFP - 굴지의 사용은 permeabilization 후 transfected 세포의 식별을 허용합니다. 여기, NGF 전에 F - 굴지 가시 종료의 라벨 5 분 추가되었습니다. DN 음과 transfected 성장 원추가 근처 untransfected 성장 원추 (하단 패널)와 대조 성장 원추 선도 여백 (로우어 미들 패널), 또는 GFP 제어 (어퍼 미들 패널)와 가시 엔드 수준을 감소 가지고 있습니다. Rhodamine - 굴지, 빨강, GFP - 굴지, 녹색. 스케일 바, 10 μm의.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법은 성장 원뿔을 마이 그 레이션의 리더 가장자리에있는 굴지의 cytoskeleton의 역동적인 리모델링에 관련된 세포 구성 요소의 시간적 및 공간적 해상도를 허용 여기를 발표했다. 신속하게 굴지 필라멘트 중합을 자극 NGF 또는 netrin 같은 유인 분자의 동작으로 그림 1과 2에 표시된 활성화 ADF / cofilin 10 굴지 필라멘트 severing 만든 굴지 가시 종료 현지 증가로 드러났습니다. 방법은 radixin, 그?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

성장 axons의 운동성이있는 팁은 성장 콘이라고합니다. 성장 원뿔 성장 콘 수용체를 바인딩 및 역학과 성장 원추 cytoskeleton 3-6의 조직을 규제 로컬 표현 분자지도 단서과 상호 작용에 의해 개발 조직을 통해 axons 탐색 리드. 이러한 항해 신호의 주요 목표는 성장 콘 주변과 지속적인 굴지의 중합 및 동적 개조 7을 통해 해당 드라이브의 성장 콘 운동성을 가득 채우고 굴지의 필라멘트 meshwork입니다. 긍정적이든 매력적인지도 단서는 자극 굴지 필라멘트 (F - 굴지) 유인 큐의 원본 가까이있는 성장 콘 주변의 지역에서 중합에 의해 회전 성장 원뿔을 유도. 이 굴지의 중합은 최고의 여백과 유인 대한 axonal 신장 지역 성장 콘 돌출부, 접착시킵니다. 굴지 필라멘트 중합 충분한 굴지의 모노머의 가용성과 모노머의 추가를위한 중합 핵이나 굴지 필라멘트 가시 종료에 따라 달라집니다. 굴지 단량체는 여자가 망막 및 지느러미 루트 신경절 (DRG) 성장 콘에서 다량으로 사용할 수 있습니다. 무료로 F - 굴지 가시 엔드 모노머 추가를 위해 사용할 수있게되면 그 결과, 중합은 빠르게 증가합니다. 이것은 가까이 유인 80-10로 성장 원추 지역 계수 (ADF / cofilin)를 depolymerizing F - 굴지의 severing 단백질 굴지의 지역 활성화를 통해 여자는 DRG와 망막 성장 콘에서 발생합니다. 이 강한 ADF / cofilin 활동 중합을위한 새로운 F - 굴지 가시 종료를 만들 수 굴지의 필라멘트 서버스. 다음과 같은 방법이 메커니즘을 보여줍니다. F - 굴지의 총 내용은 형광 phalloidin와 얼룩의 시각이다. F - 굴지 가시 끝이 다른 운동성이있는 세포 11, 12의 이전 연구에서 적응하는 다음에 설명된 절차 permeabilized 아르 성장 콘 이내 rhodamine - 굴지의 결합에 의해 시각입니다. rhodamine - 굴지이 가시 엔드에 굴지의 모노머 추가에 대한 중요한 농도 이상의 농도에 추가되면, rhodamine - 굴지는 무료 끝이 가시로 조립. 매력적인 큐이 같은 성장 원뿔의 한쪽에 위치 micropipette에서 풀려나와 같은 그라디언트에서 제시하는 경우, F - 굴지 가시 종료에 rhodamine - 굴지의 설립은 micropipette 10쪽으로 성장 콘 측면에서 큰 것입니다 . 성장 원뿔은 작고 섬세한 셀 구조입니다. permeabilization, rhodamine - 굴지의 설립, 고정 및 형광 시각화의 절차는 모두 신중하게 수행하고 거꾸로 현미경의 무대에서 진행하실 수 있습니다. 이러한 방법은 마이 그 레이션하는 뉴런, 다른 기본 조직 세포 또는 세포 라인 지방 굴지의 중합을 연구에 적용할 수 있습니다.

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Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

의 연결을 성장 원뿔의 가시 끝이 시각화하고 F - 굴지 수치 방법을 설명합니다. 유리 coverslips에 culturing의 뉴런 후, 세포는 사포닌 함유 솔루션 permeabilized 있습니다. 그런 다음, rhodamine - 굴지 포함된 사포닌 버퍼와 짧은 부화는 무료 굴지 가시 종료에 형광 굴지 통합되어 있습니다.

Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K 조회수.  University of Minnesota. 의 연결을 성장 원뿔의 가시 끝이 시각화하고 F - 굴지 수치 방법을 설명합니다. 유리 coverslips에 culturing의 뉴런 후, 세포는 사포닌 함유 솔루션 permeabilized 있습니다. 그런 다음, rhodamine - 굴지 포함된 사포닌 버퍼와 짧은 부화는 무료 굴지 가시 종료에 형광 굴지 통합되어 있습니다.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...