저자는 그림에 대한 지원은 Teele Palumaa 감사합니다. 국립 보건 의학 연구위원회, 호주에서 프로젝트 그랜트 1,008,046 재정 지원.

1. 해리 해마 신경 세포 문화 <ol><li> 커버 슬립 (붕규산 유리)를 준비 : <ol><li> 100 % 에탄올로 세척 할 것. </li><li> UV 조사에 따라 공기 건조. </li><li> 폴리-D-라이신 (4 박 ° C에서 0.15 M 붕산 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖)와 코트. </li><li> 다음 날 (문화의 날) 라미닌으로 다음 코트 PBS에서 3 회 세척에 (2.5 ㎍ / ㎖, 자연 마우스 라미닌) + 5 % V / V를 열 - 불 활성화 된 태아 혈청 (FCS) 2 시간에 대한 PBS에 희석 37 ° C. </li></ol></li><li> 배아 일 18 일 (E18) 쥐의 해마를 해부하고 칼슘과 마그네슘, 얼음에 냉장을 포함하는 PBS로 수집합니다. 주 : 동물을 포함한 모든 실험 프로토콜 멜버른 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 파파인 해리 키트 파파인과 DNA 분해 효소 I 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 1 ㎖ 파파 용액에 50 ㎕의 DNA 분해 효소의 I 솔루션을 추가합니다. </li><li> 참고 : 한 번첫 번째 준비, 파파인 솔루션과 DNA 분해 효소 I 솔루션은 개별적으로 (각각, 파파인과 DNA 분해 효소 I 0.5 ㎖ 및 25 ㎕의 분취 량)을 분취에 분배하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 1 ㎖ 파파 / DNA 분해 효소 I 솔루션 (배아의 한 쓰레기부터) 해마를 품어. 조심스럽게 배양 기간 동안 두 번 내용을 혼합 튜브를 가볍게. </li><li> 세포의 분산을 얻을 및있는 경우, 몇 때까지 불꽃 연마 실리콘 처리 파스퇴르 피펫 10 - 15 배에 부드럽게 해마 조직 (기포의 생성을 방지)를 씹다, 해리되지 않은 조직의 덩어리가 남아 있습니다. </li><li> 정중 행크스 균형 염 용액 플러스 첨가제 V 소 혈청 알부민 (BSA) / w 4 % 3 ㎖ 쿠션 위에 해리 된 세포 현탁액을 계층 (HBSS +; 섹션 1.6.1 참조). <ol><li> 교반없이 실온에서 BSA를 용해하여이 단계 구배 용액을 준비2 mM의 염화칼슘, 1 ㎜ 망초, 4 mM의 탄산 수소 나트륨과 40 mM의 포도당 (HBSS +) 4 ℃에서 후 살균 필터 및 저장을 포함 HBSS에 링 </li></ol></li><li> 원심 분리기 100 XG, 스윙 아웃 로터 벤치 톱 원심 분리기에서 7 분. </li><li> 상층 액은 세포 펠렛을 대기음하지 않도록주의하고 제거합니다. </li><li> 1 ml의 불꽃 연마 (실리콘 처리) 파스퇴르 피펫 (또는 1 ㎖ 블루 피펫 팁)으로 가볍게 펠렛 세포를 재현 탁 완료 Neurobasal 매체 (2 % B27와 함께, 0.5 ㎜의 L-글루타민 1 % FCS로 보충). </li><li> (만 &quot;라이브&quot;세포로 위상 밝은 세포를 계산 NB) 혈구를 사용하여 두 개의 10 μL 분취를 계산합니다. </li><li> preprepared 코팅 된 유리 커버 슬립 (12 웰 플레이트에 0.75-1 X 10 5 / 18mm의 coverslip에)에 대한 기본 뉴런 플레이트. (아래 참조) 직전에 도금, 커버 슬립에서 초과 라미닌 / 혈청 솔루션을 기음과 주요 신경 세포 배양 배지로 교체. NB 필요한 N커버 슬립의 엠버는 coverslip에 준비가 이전의 문화에 일 시작 될 때 (단계 1.1 참조)를 미리 결정해야합니다. </li><li> 문화 쥐 차 E18 Neurobasal 매체 체외 (DIV), 2 % B27, 1 % FCS (열 불 활성화)로 보충 0.5 밀리미터 L-글루타민에서 최대 21 일 동안 해마의 신경 세포. 그 후부터는 매주 7 DIV와에 반 매체 변경을 수행합니다. 항 유사 분열 플루오로 데 옥시 우리 딘 / 딘은 7 DIV에 추가되며 각 뉴 클레오 시드의 10 mM의 주식)의 1 / 1, 000 희석 아교 세포 증식을 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 라이브 신경 세포와 항체 배양 <ol><li> 문화의 첫 주 동안, 신경 돌기 아버을 개발하고 일주일에 2-3로, 뉴런은 시냅스의 6,7을 진행해야하기에 충분히 성숙했다. <ol><li> 선택된 실험 시점 / s에서, 커버 슬립에 기본 배아 신경 세포를 포함하는 우물을 세중하는 일차 항체를 적용합니다. 직접의 문화 매체에 항체의 나누어지는 추가원하는 최종 희석 참고 차 뉴런 :이 예에서, 단백질의 재조합 분비 형태에 대해 제기 토끼 폴리 클로 날 항혈청은 잘에서 배지 1 ㎖로 2 μl를 첨가하여 1 / 500로 희석 된, 10 분 동안 원심 분리 13,000 XG, RT 전에이 같은 항체의 분취 량을 복용에 통합 될 수있는 것은 모든 입자상 물질을 제거하고 배경을 줄일 수 있습니다. </li><li> preimmune 혈청 컨트롤의 경우, (같은 최종 희석) preimmune 혈청의 상당 금액을 추가합니다. 제공된 preimmune 혈청이없는 경우, Neurobasal 배지 또는 PBS의 등가 체적 (아니오 차 항체 제어)를 추가한다. 적절한 일차 항체는 단백질의 세포 내 영역 / 해제를 인식 가능한 경우 그 대안으로,이 항체는 잘 표면 염색의 특이성을 시험하기 위해 제어에 첨가 될 수있다. </li><li> 1-4 시간의 문화 인큐베이터로 세포를 반환 (이 배양 기간은 경험적으로 결정될 수있다). 우리 experime에서실험 설계가 내면화의 시간 과정을 평가하기 위해 세척 아웃 후 추가 배양 기간 (펄스 추적 실험) 다음 항체의 펄스를 통합 할 수 있지만 국세청, 항체는 전체 기간 동안 존재했다. OPTIONAL STEP : 본 배양은 필요한 경우, 기저 단백질의 내재화 속도를 늦추기 위해 실온 또는 얼음 위에서 수행 될 수있다. 비-CO 2 제어 된 환경에서 수행하는 경우, 매체는 중탄산염 항체 / 항혈청의 첨가 전에 버퍼링되지 않는 한 변경되어야한다. 주의 : 성숙한 신경 세포 배양 (&gt; : 14 일, 특히 배양 된 배아의 신경 세포)도 전체 매체 변경을 허용하지 않습니다. </li></ol></li><li> 최적의 시간은 그 단백질의 풍부에 따라뿐만 아니라 않더라도 우리는 좋은 결과를 1 시간, 2 시간, 4 시간이 기본 항체 국제화 단계 배양 시간을 사용했습니다 CEL에있는 단백질 인신 매매의 역 동성연구중인 LS. 참고 : 대표 결과에 표시되는 듀얼 컬러 이미지는 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간의 배양으로 얻을 수 있었다. </li><li> 원하는 기간 동안 배양 한 후, 항체 함유 매체를 대기음. 실온에서 PBS로 가볍게하지만 빠른 속도로 한 번 우물을 씻으십시오. </li></ol> 3. 고정, Unpermeabilized 세포에 이차 항체의 응용 <ol><li> 인산염 완충액 pH를 7.2에서 4 % 파라 포름 알데히드와 신경 세포를 수정, 실온 주에서 5 분 : 최상의 결과를 위해, 새로 제조 된 정착액을 사용하여, 더 침전 파라 포름 알데히드가 분명하지 않도록 대안 -20 ° C에 저장하고 완전 해동 된 수정 프로그램을 사용 . 주의 : 파라 포름 알데히드 정착 준비하고 흄 후드에서 처리되어야한다. </li><li> 우물 (흄 후드에서 액체 폐기물 용기로 전송)에서 수정 프로그램을 제거하고 PBS로 3 회 씻어. <ol><li> 선택적 단계 : 원하는 경우, 항체 시약을 절약하기 위해, 커버 슬립을 할 수신중하게 집게로 12 - 웰 플레이트에서 제거하고 처분 할 수있는 문화 판의 기지에 배치 파라 필름의 시트에, 셀 사이드 업을 배치. </li><li> 그들이 완전히 파라 필름 상에 커버 슬립의 가장자리 위로 용액 범람없이 적용되도록 해법은 커버 슬립 상에 부드럽게 피펫 팅 될 수있다. </li><li> 이 기술은 (예를 들면 밤새) 가습 챔버 내에서 수행되어야하지만 이상 배양 단기간 배양 (1-2 시간)에 적합하다. 대안 적으로, 커버 슬립 위로 밤새 인큐베이션 충분한 볼륨의 12 - 웰 플레이트의 웰에 배치 될 수 커버 슬립이 건조하지 않도록 추가되어야한다. </li></ol></li><li> PBS에서 5 % BSA (: 그것은 세포가 permeabilized되지 않습니다 중요하기 때문에이 단계에서 차단 솔루션에 세제를 추가하지 마십시오)와 실온에서 30 분 동안 차단합니다. </li><li> 검 색을 진행하기 전에 표면 단백질에 레이블을하기 위해내면화 된 단백질의 기는 선택의 첫 번째 찬란 2 ° 항체를 적용합니다. 참고 : 여기에 설명 된 예에서 기본 항혈청 재조합 분비 이소 4 토끼 (사내 항체)에서 제기되었다. 따라서 unpermeabilized 뉴런의 표면에 막 횡단 이소 형의 세포 외 영역을 검출하는 제 차 항체에 대해, 우리는 당나귀 항 - 토끼 Dylight 649 (5 % BSA를 함유하는 PBS에 희석 1 / 200)을 사용. 그것은 사용하기 전에 희석 차 항체 솔루션 (10 분 13,000 XG, RT)을 원심 분리하는 것이 좋습니다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 커버 슬립을 배양한다. </li><li> PBS와 (우물)의 coverslips를 세척, 배 5 분. </li></ol> 4. 초과 레이블이없는 2 ° 항체로 차단 <ol><li> 레이블이없는 2 ° 항체의 높은 농도 (&gt; 0.1 ㎎ / ㎖)와 unpermeabilized 신경을 차단합니다. <ol><li> 레이블이없는 2 ° 항체 종에 대해 제기되어야하는차 항체는 실온에서 배양 밤새 (이 경우 토끼) 제기됐다. </li><li> 이 프로토콜의 경우, F AffiniPure AB 단편 염소 항 - 토끼의 IgG (H + 용의 L)가 0.13 ㎎ / ㎖의 농도로 사용 하였다. 참고 : 하룻밤 배양이 짧은 잠복기 (2 시간)와 같은 중요한 것으로 나타났다 완전히 표시 이차 항체에 의해 구속되지 않은 차 항체의 완전 차단을 위해 충분했다. </li></ol></li><li> PBS와 (우물)의 coverslips를 세척, 배 5 분. </li><li> 이 차단 단계 후, 인산염 완충액 pH가 7.2, 실온에서 5 분의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 후 고정합니다. (흄 후드에서 액체 폐기물 용기로 전송 정착액) 정착액 제거 후 PBS (2X)로 씻어. </li></ol> 5. 둘째 찬란 복합 2 ° 항체의 Permeabilization 및 응용 프로그램 <ol><li> 투과 룸 템피에서 0.1 % 트리톤 - X-100을 함유하는 PBS에서 5 % BSA와 세포를 차단30 분 동안 rature. </li><li> 차단 솔루션 (커버 슬립이 건조하지 않도록주의하면서)를 제거합니다. 다른 형광 태그 두 번째 찬란 - 복합 2 ° 항체를 추가합니다. <ol><li> 주 : (아래 참조) 공 초점 현미경에서 사용 가능한 여기 / 방출 필터에 따라, 이전에 사용 하나에서이 형광 태그를 구별 할 수 있어야한다. </li><li> 이 프로토콜에 제시된 예를 들어, 알렉사 플 루어 488 - 복합 당나귀 안티 - 토끼 2 ° 항체 (1 / PBS에서 200, 5 % BSA, 0.1 % 트리톤 - X-100)을 사용 하였다. 실온에서 2 시간을 품어 후 2 ° 항체 솔루션을 제거합니다. </li></ol></li><li> 세척 PBS로 3 배 5 분을 커버 슬립과, 마지막으로, 탈 이온수로 간단히 세척한다. </li></ol> 6. 설치 및 이미징 <ol><li> 마운트 수성 장착 매체 포함 antifade (예 VECTASHIELD)와 유리 슬라이드에 coverslips를 건조 할 수 있습니다. 영업 이익은 4 ° C에서 어둠에 보관형광 신호 강도의 timal 보존. </li><li> 이미지는 공 초점 현미경 세포를 면역 염색. <ol><li> 두 형광 신호의 검출에 적합한 여기 및 방출 필터를 사용할 수 있어야합니다. </li><li> 다른 실험 조건 (감극 8,9 또는 제어 상태에서 예를 들어, 내재화 비율) 비교 될 경우, 모두 동일한 이미지 수집 매개 변수를 이미지화하는 다양한 조건에서의 coverslips를 복제했는지 확인하십시오. 표준 관심 영역 또는 결과 이미지에서 puncta에 특성 (예 번호, 크기)의 집적 밀도는 표준 이미지 분석 소프트웨어 (예 피지 / ImageJ에, Metamorph의)을 사용하여 측정 할 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 기술은 (가 Arancibia-Càrcamo 등. 리뷰) 세포 표면의 바이오 티 닐화 (12)의 보완이며 그것은 내면화 단백질의 세포 내 현지화에 대한 정보를 보존하기위한 선택의 방법, 적절한 일차 항체에 제공 세포 에피토프를 사용할 수 있습니다. 또, 시간 경과에 단백질 매매 / 내재화의 정량 단백질 추출물을 준비 할 필요없이 (일차 항체와 생균 배양에 걸쳐 서로 다른 시간에 커버 ?...

새로 확인 된 단백질의 기능을 확립, 문제의 단백질의 세포 내 현지화 및 인신 매매의 조사는 단백질 1,2의 가능성이 역할 / S에 대한 중요한 단서를 제공 할 수 있습니다. 개발 신피질 3의 사체의 생물 정보학 분석은 마우스의 뇌 corticogenesis 동안 변경 발현을 보이는 유전자의 목록을 우리에게 제공했다. 우리는 이들 유전자 중 하나 sez6에 의해 코드되는 단백질이 신경 세포의 개발에 중요한 역할을하고 있음을 확인하기 위해 유전자 녹아웃 방식을 채택했다. 우리는 발작 관련 유전자 6, Sez6, 단백질이 개발 수상 돌기에 있으며 또한 돌기 쪽, 수신 및 흥분성 신호를 통합하는 수상 돌기에 전문 구조에 존재하는 것을 관찰했다. 이 단백질이 결여되는 경우 또한, 덴 드라이트 및 흥분성 시냅스 올바르게 (4)을 형성하지 못한다. 단백질의 가능성이 지배적 인 이소는 transmembran의 기능을 가지고 있습니다전자 수용체 immunolabeled 단백질의 세포 내 분포를 공 초점 현미경으로 또는 면역 전자 현미경으로 검사했을 때, 비록 전부는 아니더라도 대부분 신호의 세포막에 표시된 거의, 또는 전혀, 단백질 somatodendritic 구획에있는 작은 소포와 관련된 등장 세포 표면으로. 결정적 예측 대형 세포 외 도메인이 추정되는 수용체는 세포막에 매매되는 것을 보여주기 위하여, 우리는 세포 표면 단백질에 라벨 단백질의 세포 외 부분에 생성 한 항혈청을 사용하여 살아있는 세포 접근법을 채택 하였다. 광범위한 차단 단계와 permeabilization 단계로 구분하여 차별적으로 표지 된 이차 항체의 두 응용 프로그램이 &quot;항체 공급&quot;접근 방식을 결합함으로써, 우리는 형광 표지 된 이차 항체가 다른 fluoresc 베어링 바인딩에 의해 구별 단백질의 두 가지 풀을 식별 할 수 있었다천만에 태그. 따라서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 단백질로부터의 항체 배양 단계 동안 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 단백질을 구별 할 수 있었다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 단백질이 신경 세포에서 세포 표면에과에서 매매되도록 설치했다. 따라서이 비교적 빠르고 간단한 기술은 우리가 이러한 기술에 대해 동일한 토끼 폴리 클로 날 항혈청을 사용한다는 사실에도 불구하고, 기존의 면역 세포 화학 방법 또는 사전 내장 immunogold 전자 현미경보다 더 많은 정보를 증명했다. 이 기술은 세포 외 도메인의 항원을 인식하는 좋은 항체를 사용할 제공하는 횡단 단백질에 일반적으로 적용 할 수있다. 이 기술은 글루타민산 염 수용체에 대한 GluR1 서브 유닛 5 수용체 인신 매매를 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

배양 된 신경에있는 추정상의 막 관통 수용체의 세포 표면 지역화을 입증하기 위해, 우리는 단백질의 세포 외 부분에 대해 발생하는 특정 일차 항체와 라이브 뉴런의 표면에 단백질을 표지. 세포를 고정 후 다음 세포 표면 및 내부 단백질이 동일한 레이블 차 항체에 의해 감지됩니다 permeabilized 경우 수용체가 표면과에서 인신 매매되는 것을 감안할 때. 여기서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 항체 인큐베이션 단계와 단백질 중에 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 라벨 단백질을 차별적으로하는 단백질 매매 ( &quot;항체 수유&quot;)을 연구하기 위해 사용되는 방법을 채택 . 단백질의 두 가지 풀을 구별하는 기능은 초기 incubatio 후 고농도의 레이블이없는 차 항체와 하룻밤 차단 단계의 결합을 통해 가능하게되었다형광 표지 된 이차 항체와 unpermeabilized 뉴런의 명. 다른 형광으로 표지 된 형광 차 항체로 내면화 풀의 검출을 허용하는 신경의 차단 단계, permeabilization 후. 우리는 그것이라고 밝혀,이 추정되는 수용체의 세포 내 위치에 대한 중요한 정보를 얻을 수가이 기술을 사용하여, 참으로, 신경 세포의 세포 표면에 인신 매매. 이 기술은 세포 에피토프에 적합한 항체를 제공하고, 세포의 종류와 세포 표면 단백질의 범위에 광범위하게 적용 할 수있는 것은 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 가지 색의 형광 면역 염색 기법 (그림 1에 개략적으로 도시) 살아있는 세포의 막 횡단 단백질의 세포 외 도메인을 라벨에 유용합니다. 인큐베이션 기간 동안, 면역 글로불린은 액세스 에피토프에 결합하고 함께 결합 된 항체와 단백질 분자의 인구의 비율은, endocytosed된다. 또, 새로 합성 된 단백질은 순방향 매매를 통해 세포 표면에 도달 할 수 있고, 재활용 단백질 분자?...

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Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K 조회수.  The University of Melbourne.  우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.