저자는 토론과 실험 도움 Ule, 루스콤 및 Zupan 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 높은 처리량 시퀀싱을위한 제임스 해드와 닉 매튜 주셔서 감사합니다. 우리는 iCLIP 방법은 주, 여기 로버트 다넬의 연구실에서 커크 젠슨과 JU에 의해 개발된 원래의 클립 프로토콜로 여러 단계를 설명 것을 지적하고 싶다. 이 작품은 유럽 연구위원회 부여 JU와 JK에 대한 장기적인 인간 프론티어 과학 프로그램 교제로 206726 - CLIP에 의해 지원되었다

1. UV 교차 연결 조직 문화의 세포 <ol><li> 미디어를 제거하고 10cm 접시 (충분한 세 실험)에 성장 세포 6 ML 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. </li><li> 얼음 뚜껑과 장소를 제거합니다. 150 254 NM에서 MJ / cm 2 번 비추다. </li><li> 휴대 리프터와 스크레이핑하여 세포를 수확. </li><li> 세 microtubes 각각 2 ML 세포 현탁액을 전송합니다. 4 10 초에 대한 최고 속도로 회전은 ° C 펠릿 세포에 다음 뜨는 제거합니다. </li><li> 스냅 - 냉동 -80에서 드라이 아이스와 저장소에 셀 알약을 ° C까지 사용. </li></ol> 2. 비드 준비 <ol><li> 100 μl의 단백질 새로운 microtube로 실험을 당 Dynabeads (Dynal, 100.02) (마우스 또는 염소 항체에 대한 단백질 G의 Dynabeads를 사용). 추가 </li><li> . 용해 완충액 (; 100 MM NaCl, 1퍼센트 NP - 40, 0.1 % SDS, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate, 1백분의 1 프로 테아제 억제제 칵테일 III, Calbiochem 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 2 배 구슬 와시 </li><li> 20-10 μg 항체 100 μl 용해 버퍼에 구슬을 Resuspend. </li><li> 30-60 분 실온에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 900 μl 용해 버퍼 배 세척하고 4.1 단계로 진행 준비가 될 때까지 마지막으로 씻어 둡니다. </li></ol> 3. 세포 용해 및 일부 RNA의 소화 <ol><li> 1 ML의 용해 버퍼와 1.5 ML의 microtubes로 전송에서 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> RNase I (앰비온, AM2295)의 500분의 1 희석을 준비합니다. 10 μl RNase I 희석뿐만 아니라 세포 lysate 2 μl 터보 DNase 추가 (500분의 1 RNase I의 dilutions [낮은 RNase] 도서관 준비에 사용되며 50분의 1 dilutions [높은 RNase] 항체 특이성에 대한 제어하는​​ 데 필요한) . </li><li> 37 정확히 3 분 ° C, 1100 rpm으로 흔들어에 대한 샘플을 품어. 즉시 얼음으로 전송할 수 있습니다. </li><li> 4 스핀 ° C 및 lysate를 지우 20 분 2만2천그램. 조심스럽게 (펠렛과 함께 약 50 μl lysate를 떠나) 표면에 뜨는를 수집합니다. </li></ol> 4. Immunoprecipitation <ol><li> 비즈 (단계 2.5에서)에서 씻어 버퍼를 제거 후 세포 lysate를 (단계 3.4에서) 추가합니다. </li><li> 4 2 H에 대한 샘플을 회전 ° C. </li><li> 뜨는을 취소하고 900 μl 높은 소금 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4, 1 M NaCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1% NP - 40, 0.1 % SDS, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate)로 2 배 비즈 씻으십시오. </li><li> . 900 μl 세척 버퍼 (; 10 MM MgCl 2; 0.2 % 트윈 - 20 20 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 2 배 씻으십시오 </li></ol> 5. RNA 3&#39;ends의 Dephosphorylation <ol><li> 뜨는을 취소하고 (15 μl 물, 4 μl 배 PNK의 산도 6.5 버퍼 [350mMTris - HCL, pH를 6.5; 50mMMgCl이 25mMdithiothreitol]; 0.5 μl PNK 효소, 0.5 μl RNasin [Promega]) 20 μl PNK 믹스의 구슬을 resuspend. </li><li> 37 20 분 품어 ° C. </li><li> 500 μl 세척 버퍼를 추가하고 높은 소금 버퍼 1X 씻는다. </li><li> 세척 버퍼와 2X 씻으십시오. </li></ol> 6. 3 &#39;끝을 RNA에 결합 링커 <ol><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 (9 μl 물을 20 μl 내고 믹스의 구슬을 resuspend, 4 μl 4X 내고 버퍼 [200 mMTris - HCL, 40m의 MM gCl 2; 40 MM의 dithiothreitol], 1 μl RNA ligase [코]; 0.5 μl RNasin [Promega]; 1.5 μl 사전 adenylated 링커 L3 [20 μm의], 4 μl PEG400 [81170, 시그마]). </li><li> 16 밤새 품어 ° C. </li><li> 500 μl 세척 버퍼를 추가하고 다음 1 ML 높은 소금 버퍼 2X 씻으십시오. </li><li> 두 번째 세척 1 ML 1 ML 세척 버퍼와 2X하고 떠나 씻으십시오. </li></ol> 7. RNA 5 &#39;끝 라벨 <ol><li> 뜨는를 제거하고 뜨거운 PNK 믹스 8 μl의 구슬을 resuspend (0.4 μl PNK [코]; 0.8 μl 32 P - γ - ATP, 0.8 μl 10X PNK 버퍼 [코]; 6 μl 물). </li><li> 37 5 분 품어 ° C. </li><li> 핫 PNK 믹스를 제거하고 20 μl의 1X Nupage 로딩 버퍼 (Invitrogen)에있는 구슬을 resuspend. </li><li> ° C 10 분 70시 thermomixer에 품어. </li><li> 즉시 (8 단계 참조) 빈 구슬을 촉진하고 겔에 뜨는를 로드할 자석에 놓으십시오. </li></ol> 8. SDS - PAGE와 막 전송 <ol><li> 4~12%의 NuPAGE 제조 업체의 지시에 따라 BIS - 트리스 젤 (Invitrogen)에 샘플을로드합니다. 버퍼 (Invitrogen)를 실행 1X 맙스 0.5 리터를 사용합니다. 또한 사전에 묻은 단백질의 크기 표시 (예 : 페이지의 통치자 또한, Fermentas, SM1811) 5 μl를로드합니다. </li><li> 180 50 분 겔을 실행 V. </li><li> 겔 전면을 제거하고 고체 폐기물 (무료 방사성 ATP를 포함)로 폐기. </li><li> 젤의 제조 업체의 지침 (Invitrogen, 30 V에서 환승 1 H)에 따라 Novex 서부 유럽 표준시 전송 장치를 사용하여 nitrocellulose 막에 단백질 RNA의 단지를 전송합니다. </li><li> 전송 후, PBS 버퍼에 막을 린스, 다음 사란 포장에 포장하여 -80 ° C (장소 나중에 T를 정렬하기 위해 막 옆에 형광 스티커를에서 후지 필름에 노출그는 영화와 막이;) 30 분, 1 시간 및 밤 동안에 대한 노출을 수행합니다. </li></ol> 9. RNA 분리 <ol><li> 마스크로 단계 8.5에서 autoradiograph를 사용하여 낮은 RNase 실험에서 단백질 RNA의 단지를 분리. 여러 개의 작은 조각으로 막 조각을 잘라 1.5 ML의 microtube에 그들을 놓으십시오. </li><li> 막 조각을 10 μl proteinase K (로체, 03,115,828,001) 200 μl PK 버퍼를 (10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산),, 50 MM 100 MM NaCl 트리스 - HCL의 산도 7.4) 추가합니다. 37 20 분 1,100 rpm으로 흔들어 품어 ° C. </li><li> PKurea 버퍼 (; 50 MM NaCl, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 100 MM 트리스 - HCL pH는 7.4 7 M 우레아) 200 μl를 추가하고 37에서 20 분 품어 ° C. </li><li> 솔루션을 수집하고 2 ML 단계 잠금 젤 중공업 튜브 (713-2536, VWR)에 클로로포름 (앰비온, 9722) / 페놀 RNA 400 μl와 함께 추가합니다. </li><li> 1,100 RPM에 떨고, 30 5 분 ° C에 대해 품어. 실온에서 13,000 rpm으로 5 분 회전으로 ​​단계를 구분한다. </li><li> (피펫로 젤을 만지지 않도록주의) 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. 0.5 μl glycoblue (앰비온, 9510) 40 μl 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 혼합을 추가합니다. 다음 1 ML 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스 및 촉진 </li></ol> 10. 역방향 전사 <ol><li> 15,000 RPM 4 20 분 스핀 ° C. 뜨는을 제거하고 0.5 ML 80 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> . 7.25 μl RNA / 프라이머 믹스 (; 0.5 μl Rclip 프라이머 [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP 혼합 [10mM] 6.25 μl 물)의 펠릿을 Resuspend 각각의 실험이나 복제를위한 개별 바코드 시퀀스 (14 참조) 포함된 다른 Rclip의 프라이머를 사용합니다. </li><li> 70 5 분 품어 ° C 25 ° C.으로 냉각하기 전에 </li><li> 2.75 μl RT 혼합 (; 0.5 μl 0.1M DTT, 0.25 μl 윗첨자 III 반전 transcriptase [Invitrogen] 2 μl RT 배 버퍼)를 추가합니다. </li><li> 25 5 분 품어 ° C, 42시 20 분 ° C, 50 ° C 40 분 80시 5 분 ° C 4 냉각하기 전에 ° C. </li><li> 90 μl TE 버퍼, 0.5 μl glycoblue 10 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 혼합을 추가합니다. 그렇다면 250 μl 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스와 촉진 </li></ol> 11. cDNA의 젤 정화 <ol><li> 스핀 다운 및 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후, 물 6 μl의 알약을 resuspend. </li><li> 6 μl 2X TBE - 요소 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 추가합니다. 열 샘플 80 ° C 직접적으로로드하기 전에 3 분. </li><li> 프리 캐스트 6% TBE - 요소 젤 (Invitrogen)에 샘플을로드하고 같은 제조 업체에서 설명한 180 V에서 40 분 동안 실행. 또한 이후의 절단 (아래 참조)에 대한 낮은 분자량 마커를로드합니다. </li><li> 120-200 NT (높이), 85-120 NT (중간)와 70-85 NT (낮은) 세 밴드 컷. (그림 3 참조) 절단을 안내 theupper 염료 및 플라스틱 겔 지원 부호를 사용하십시오. 참고 클립 순서의 52 NT 용 Rclip 프라이머와 함께 L3 순서 계정입니다. </li><li> 400 μl TE를 추가하고 1 ML의 주사기의 플런저를 사용하여 작은 조각으로 겔 슬라이스를 부술. 37 2 H 위해 1,100 rpm으로 흔들어 품어 ° C. </li><li> 플레이스 코스타 SpinX 칼럼 (코닝 설립, 8161)에이 1cm 유리 사전 필터 (왓먼, 1823010). 그 결과 해당 컬럼에 대한 샘플의 액체 부분을 전송합니다. 1.5 ML 튜브에 13,000 RPM에서 1 분 스핀. </li><li> 0.5 μl glycoblue 40 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5를 추가 후 샘플을 섞는다. 1 ML 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스 및 촉진 </li></ol> 12. cDNA의 5&#39;end에 뇌관을 내고 <ol><li> 그리고 부화 스핀 다운과 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후 8 μl 내고 믹스 (; 0.8 μl 10X CircLigase 버퍼 II, 0.4 μl 50 MM MnCl 2;, 0.3 μl Circligase II [Epicentre] 6.5 μl 물)의 알약을 resuspend 60 ° C. 1 H에 대한 </li><li> 30 μl oligo 소둔 혼합 추가 (26 μl 물, 3 μl FastDigest 버퍼 ​​[Fermentas], 1 μl cut_oligo [10 μm의]). 95에서 1 분 품어 ° C. 그렇다면 1 매 20 초 온도를 감소 ° C 25 ° C까지 도달하고 있습니다. </li><li> 37 2 μl BamHI (고속 Fermentas) 30 분 품어 ° C. 추가 </li><li> 50 μl TE 및 0.5 μl glycoblue 및 혼합을 추가합니다. 10 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5 믹스를 추가한 다음 250 μl 100 % 에탄올을 추가합니다. -20 ° C. 밤 반복 및 석출물 믹스 </li></ol> 13. PCR 증폭 <ol><li> 스핀 다운 및 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후, 19 μl 물에 펠렛을 resuspend. </li><li> (, 1 μl 입문서 믹스 P5/P3 solexa, 10 μm의 각, 20 μl Accuprime Supermix 한 효소 [Invitrogen] 19 μl cDNA)를 PCR 믹스를 준비합니다. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 실행 25-35 사이클, 68 ° 3 분위한 C, 4 [30 초에 대한 94 ° C 15 초, 65 ° C를위한 30 초, 68 ° C] 94 ° C 2 분을 ° C 영원히. </li><li> 프리 캐스트 6% TBE 젤에 배 TBE 로딩 버퍼와 부하 2 μl (Invit 8 μl PCR 제품 믹스로겐). Sybrgreen I (Invitrogen)로 겔 스테인과 젤 영상기와 함께 분석합니다. </li><li> Rclip의 primers의 바코드는 높은 처리량 시퀀싱을 위해 제출하기 전에 다른 멀티 플렉스 샘플 수 있습니다. 시퀀싱을위한 라이브러리 15 μl를 제출하고 나머지를 저장합니다. </li></ol> 14. 링커 및 프라이머 시퀀스 사전 adenylated 3 &#39;링커 DNA : [우리는 20μM의 aliquots을 다음 IDT의 DNA 어댑터를 주문합니다.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" /> 15. 대표 결과 : 전에 iCLIP 라이브러리의 순서로 실험의 성공은 두 단계에서 모니터할 수 있습니다 : 멤브레인 전송 후 단백질 RNA 복합 (단계 8.5) 및 PCR 제품의 겔 이미지 (단계 13.4)의 autoradiograph합니다. 낮은 RNase 샘플 autoradiograph에서 확산 방사능은 단백질 (그림 2, 샘플 4)의 분자량 위에 볼 수 있습니다. 높은 RNase 샘플의 경우,이 방사능은 가까운 단백질의 분자량 (그림 2, 샘플 3) 초점을 맞추고 있습니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation에 사용하지 않은 경우, 어떤 신호는 (그림 2 샘플 1과 2) 감지되지 않을 것입니다. immunoprecipitation의 특이성에 대한 더 중요한 컨트롤 UV 방사선이나 관심 14 단백질을 표현하지 사용 세포를 생략하거나. PCR 제품 (13.4 단계)의 겔 이미지는 단계 11.4 (그림 4 차선 4-6)에 정화 cDNA 분율 (높은, 중간 또는 낮은)에 해당하는 크기 범위를 표시합니다. PCR primers P3Solexa과 P5Solexa은 cDNA의 크기에 추가 76 NT를 소개합니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation 동안 사용하지 않으면, 해당하는 PCR 제품은 (그림 4 차선 1-3) 감지되지 않을 것입니다. 프리머 이합체 제품은 약 140 NT에서 나타날 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 및 후속 bioinformatic 분석의 대표적인 결과를 얻으려면 14을 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. iCLIP 프로토콜의 도식 표현. 단백질 RNA의 단지는 자외선 조사 (1 단계)를 사용하여 생체내에 covalently을 상호 연결되어 있습니다. 관심의 단백질은 바운드 RNA (단계 2-5)와 함께 정화됩니다. 최종 radioactively (6 단계와 7 단계)로 표시됩니다 반대로 전사의 순서를 특정 마중물 수 있도록, RNA 어댑터 &#39;는 5 반면, RNA의 끝&#39;가 3 출혈도 잡았입니다. 교차 연결된 단백질 RNA의 단지는 SDS - PAGE와 멤브레인 전송 (8 단계)를 사용하여 무료로 RNA의 정화입니다. RNA는 proteinase K는 염기 상호 링크 (9 단계)에 남아있는 polypeptide를 떠나있는 단백질을 소화하여 멤브레인에서 발견한 것입니다. 역방향 전사 (RT)는 남아있는 polypeptide로 잘라 두 cleavable 어댑터 지역 및 바코드 시퀀스 (10 단계)을 소개합니다. 크기 선택 circularization 전에 무료 RT의 뇌관을 제거합니다. 다음 선형화은 PCR의 증폭에 적합 템플릿 (11-15 단계)를 생성합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱은 바코드 시퀀스 즉시 (단계 16) cDNA의 마지막 염기 뒤에있는 읽기를 생성합니다. 교차 연결된 뉴클레오 티드의 상류이 뉴클레오 티드 찾아 한 위치 때문에, 바인딩 사이트는 고해상도로 유추하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 교차 연결된 hnRNP C - RNA의 단지의 Autoradiograph은 denaturing 겔 전기 영동과 막 전송을 사용합니다. hnRNP C - RNA의 단지가 hnRNP C에 대한 항체를 사용하여 세포 추출물에서 단백질 정화되었습니다 (α hnRNP C, 샘플 3, 4). RNA가 부분적으로 낮은 (+) 또는 높은를 사용하여 소화했다 (+ +) RNase의 농도. 단백질의 크기 (40 KDA)에서 이상 이동 단지는 (예제 4) 볼 수 있습니다. RNase의 높은 농도가 (예제 3) 사용했을 때 변화가 덜 발음됩니다. 어떤 항체가 (예제 1과 2) immunoprecipitation에서 사용하지 때 방사성 신호가 사라집니다. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 도식 6% TBE - 요소 젤 (Invitrogen)는 iCLIP cDNA 제품의 절단 안내합니다. 겔은 겔에 cDNAs 및 염료 (파란색 조명과 어두운)의 재현성 마이 그 레이션 패턴 최고 180 V에서 40 분 동안 실행됩니다. (빨간색 선) 고 (H), 중간 (M), 낮은 (L) cDNA 분수를 잘라 면도날을 사용합니다. 플라스틱 겔 카세트에 하늘색 염료의 중간에 즉시 마르크 이상 절단하여 시작하십시오. 매체 낮은 분수를 분할하고 하늘색 염료 위 1cm에 대한 높은 분수를 좀 잘라. 다른 차선을 (이 예제 1-4)를 별도로 주머니와 염색으로 보이는 수직 상처를 사용하십시오. 마커 레인 (m)는 스테인드하고 제어하는​​ 데 몇 군데 있습니다절단 후 크기. 조각 크기는 오른쪽에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 겔 전기 영동을 사용하여 PCR - 증폭된 cDNA 라이브러리 iCLIP 분석. RNA는 반대로 베꼈는데 및 크기 정화가 denaturing 겔 전기 영동 (그림 2)를 사용했던 멤브레인 (그림 1)에서 복구. 세 크기 분수 cDNA (높은 [H] : 120-200 NT, 매체는 [M] : 85-120 NT와 낮은 [L] : 70-85 NT) 복구되었습니다, circularized, 다시 선형 및 PCR - 증폭. 다양한 크기의 배포판의 PCR 제품은 입력 분수의 다양한 크기의 결과로 볼 수 있습니다. PCR 프라이머의 cDNA 76 NT를 도입 이래, 크기는 중간 및 낮은 크기의 분수에 대한 146-161 NT 높은, 161-196 NT 용 196-276 NT 사이의 범위해야합니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation (1-3 차선)에 대한 사용되지 때 PCR 제품은 결석합니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

iCLIP 프로토콜 효소 반응과 정화 ​​단계의 다양한 범위를 포함하고 있기 때문에, 그것은 실험이 실패 문제를 식별하는 데 항상 쉬운 일이 아닙니다. 확인 RNA 상호 링크 사이트의 특이성에 대한 제어하기 위해서는 하나 이상의 부정적인 컨트롤이 전체 실험 이후 전산 분석을 통해 유지되어야합니다. 이러한 컨트롤은 노 항체 샘플, 비 교차 연결된 셀 또는 녹아웃 세포 또는 조직에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 제어 실험은 단백질의 RNA 단지를 정화하지 말아야하고, 따라서 SDS - PAGE 젤에 아무런 신호, 및 PCR 증폭 후 노 감지 제품을주지해야합니다. 이러한 컨트롤 라이브러리의 높은 처리량 시퀀싱는 거의 고유의 시퀀스를 반환해야합니다. 결과 시퀀스는 여전히 작은 양이 분해 전지에서 정화되는 것과 동일한 단백질의 상호 링크 사이트에 해당하는 이후 최저 세포는 시퀀싱 제어로 권장하지 않습니다. 주의는 또한 이전의 실험에서 PCR 제품과 오염을 피하기 위해 이동해야합니다. 이 문제를 최소화하는 가장 좋은 방법은 공간 사전 및 사후 PCR 단계를 구분하는 것입니다. 이상적으로, PCR 제품 및 모든 후속 단계의 분석은 별도의 방에서 수행하여야한다. 또한, 실험실의 각 회원은 버퍼와 다른 시약의 자신의 세트를 사용해야합니다. 이러한 방법으로 오염 물질의 출처는 쉽게 확인할 수 있습니다.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

겔 전기 영동과 막 전송을 위해 우리는 그가 XCell SureLock 사용 t 권장 ® 프로토콜을 통해 지정된 다른 프리 캐스트의 minigels의 사용과 호환 미니 셀 및 XCell II ™ 블롯 모듈 키트 CE 마크 (Invitrogen, EI0002) . 사용되는 모든 재료의 브랜드와 순서 번호는 프로토콜 중에 언급합니다. 프로토콜에 사용되는 효소의 목록은 아래 표에 표시되어 있습니다. <table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 단백질 Dynabeads을 </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> 마우스 또는 염소 항체에 대한 단백질 G를 사용하여 </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> 앰비온 </td><td> AM2295 </td><td> 활동 배치에서 배치로 변경할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> T4 RNA ligase I </td><td> 코 </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> 코 </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> 로체 </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> 윗첨자 III 반전 transcriptase </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> 이 PCR 혼합은 우리 손에 최상의 결과를 제공합니다 </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

성적표에서 RNA 결합 단백질의 독특한 구성과 공간적 배열 (RBPs)는 포스트 transcriptional 규칙 1의 다양한 측면을 안내입니다. 따라서, 분자 수준에서 명시 규정을 이해 향한 필수적인 단계는 RBPs 2의 바인딩 사이트에 위치 정보를 얻을 수 있습니다. 단백질 RNA 상호 작용은 생화 학적 방법을 사용하여 공부 할 수 있지만, 이러한 방식은 원시 세포 문맥에 바인딩 RNA를 해결하지 않습니다. 자신의 세포 환경에서 단백질 RNA의 단지를 공부하는 초기 시도는 차동 디스플레이 또는 microarray 분석 (RIP 칩) 3-5와 결합 친화력 정화 또는 immunoprecipitation을 고용. 이러한 접근은 간접적 또는 비 생리 상호 작용 6 파악하는 경향이 있었다. 클립 (UV 교차 연결 및 immunoprecipitation) 7,8 도입되면서 특이성과 위치 해상도를 향상시키기 위해, 전략 언급. 클립 UV 가교 denaturing polyacrylamide 젤 전기 영동을 포함한 엄격한 정화 체계와 단백질과 RNA 분자의 결합. 높은 처리량 시퀀싱 기술와 함께, 클립 게놈 전체 규모의 단백질 RNA 상호 작용 (조회수 - 클립이나 CLIP - seq로 함) 9,10을 연구하는 강력한 도구로 입증되었습니다. 최근 PAR - 클립 11,12을 교차 연결을위한 photoreactive ribonucleoside의 analogs를 사용 도입되었습니다. 얻은 데이터의 높은 특이성에도 불구하고, 클립 실험은 종종 제한된 순서 복잡 cDNA 라이브러리를 생성합니다. 이것은 공동 정화 RNA의 제한 금액과 도서관 준비에 필요한 두 가지 비효율적인 RNA의 결합 반응에 일부 때문입니다. 또한, 뇌관 확장 assays 많은 cDNAs의 가교 뉴클레오 티드 13 성급하게 잘릴 것을 지적했다. 이러한 잘린 cDNAs는 표준 클립 라이브러리 준비 프로토콜 동안 손실됩니다. 우리는 최근에보다 효율적인 분자내 cDNA circularization (그림 1) 14과 비효율적인 분자간 RNA의 결합 단계 중 하나를 교체하여 잘린 cDNAs을 캡처 iCLIP을 (개인 - 염기 해상도 클립), 개발했습니다. 중요한 것은 잘린 cDNAs을 시퀀싱하는 뉴클레오 티드 해상도에서 상호 링크 사이트의 위치에 통찰력을 제공합니다. 우리는 성공적으로 게놈 전체의 규모에서 hnRNP C 입자 조직을 연구하고 splicing 규정 14의 역할을 평가할 수 iCLIP 적용.

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iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

성적표에서 RNA 결합 단백질의 공간적 배열이 포스트 transcriptional 규칙의 주요 결정자이다. 따라서, 우리는 RNA 결합 단백질의 바인딩 사이트의 정확한 게놈 차원의 매핑을 허용 개별 - 염기 해상도 자외선 crosslinking 및 immunoprecipitation (iCLIP)를 개발하였습니다.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

58.1K 조회수.  Medical Research Council - MRC. 성적표에서 RNA 결합 단백질의 공간적 배열이 포스트 transcriptional 규칙의 주요 결정자이다. 따라서, 우리는 RNA 결합 단백질의 바인딩 사이트의 정확한 게놈 차원의 매핑을 허용 개별 - 염기 해상도 자외선 crosslinking 및 immunoprecipitation (iCLIP)를 개발하였습니다.

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Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

싱크로 트론 - X - 레이 - tomography를 사용하여 서브 마이크론 해상도로 비침습 3D - 시각화

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

연구

생물학

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

개인 Presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 FFNs와 시각

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

형광 공명 에너지 전송과 리간드 - 수용체 상호 작용의 실시간 모니터링

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

쎄의 후유증을 매핑하는 기능 영상과 함께 인간 청각 컴퓨터에 접속 자극을 버스트

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.