우리는 위스타 연구소 동물 시설, 현미경 시설, Histotechnology 시설 및 연구 공급 센터를 주셔서 감사합니다. 이 연구는 보건 CA 076674 국립 연구소, CA 098101, CA 및 CA 10815 025874의 보조금에 의해 일부 자금했다.

1. 3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : <ol><li> acellular 계층의 준비 : 0.59 ML 10X EMEM, 50 μl 200mM L - 글루타민, 0.6 ML FBS, 120 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염 및 4.6 ML 소 콜라겐 I. 1 ML 추가 : 얼음에 50 ML 튜브에 다음과 같은 시약을 혼합 조직 문화 트레이의 각 삽입 혼합물. 실온에서 30 분 부화하고 젤 응고 수 있습니다. 혼합물의 색상은 밀짚 노란색에서 핑크색을해야합니다. </li><li> DMEM가 중립 10 % FBS를 포함하는 추가, 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 flasks에서 인간의 섬유아 세포를 Trypsinize. 10% FBS와 1.5 ML DMEM에서 원심 분리하고 resuspend 0.45 X 10 6 세포의 세포를 수집합니다. 피부 줄기 세포 들어, 분야, 원심 분리를 분리 플라스크를 감청하여 6600 피부 분야를 (피부 줄기 세포가 줄기 세포 성장 매체 때, 그들은 neurospheres와 비슷한 방식으로 분야를 형성)를 수집합니다. </li><li> 세포 계층의 준비 : 얼음에 50 ML 튜브에 다음을 믹스 : 1.65 ML 10X EMEM, 150 μl 200 MM의 L - 글루타민, 1.85 ML FBS, 350 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염, 14 ML 소 콜라겐 I 및 1.5 ML 섬유아 세포 현탁액 2 단계 (또는 피부 줄기 세포 reconstructs 는거 매체를 재구성 피부의 1.5 ML에서 0.45 X 10 6 섬유아 세포 및 피부 6,600 분야의 조합을 사용하여)에서, 잘 섞는다. 각 acellular 레이어 코팅 삽입하는 혼합물의 3 ML을 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 조직 문화의 인큐베이터에서 45 분 알을 품다. 혼합물의 색깔은 분홍색으로 노란색 밀짚에서해야합니다. 젤 굳은 후 DMEM 10 % FBS (2 ML 내부와 피부 재구성 트레이의 각 우물에 삽입 10 ML 외부)가 포함된 추가합니다. 4 일간 부화 및 겔 계약 있는지 확인하십시오. </li><li> 각 삽입의 내부와 외부 모두에서 매체를 대기음. 정기적으로 혈청 씻어하기 위해서는 삽입의 외부 내부 10 ML에 (1 % dialyzed FBS와 HBSS) 2 ML을 매체를 세척 추가합니다. 37에서 1 시간 동안 품어 ° C. </li><li> 피부의 준비 매체를 재구성 : <ol><li> 정상 melanocyte 및 피부 줄기 세포에 대한 reconstructs : 기본 매체 (500 ML)를 확인하려면 다음 시약을 혼합 : 490 ML keratinocyte 혈청 무료 매체, 1.8 ML 소 뇌하수체 추출물, 10 ML dialyzed 태아 소 혈청, 10 μg / 500 μl를 ML SCF, 4 μg / ML bFGF와 264 μg / ML 동부 표준시 - 3 500 μl의 562.5 μl. 중간 I : 100 μg / ML 100 ML 기본 매체 10 μl EGF를 추가합니다. 중간 II : 100 ML 기본 중간 2 μl EGF를 추가합니다. 중간 III : 300 ML 기본 매체 1 M의 720 μl CaCl 2를 추가합니다. </li><li> 흑색증 피부를위한 재구성 : 중간 I (100mL)는 다음과 같은 시약을 혼합하려면 다음과 DMEM의 72.5 ML, F12 24 ML (햄의)을, 2 ML 200 mm의 L - 글루타민, 269g / ML 200 200 μl 하이드로코티손 500X의 μl ITES, 0.05 200 μl O - phosphorylethanolamine M, 90 MM 200 μl 아데닌, 2 NM 200 μl Progesterone, 1 240 μl CaCl 2 M 10 NM 200 μl Triiodothyronine 및 chelexed 신생아 송아지 혈청 100 μl (혈청 100 ML에 Chelex 100 3g을 용해 4 1.5 시간을 저어 ° C, 필터 소독). 중간 II (100mL)를 확인하려면, 다음과 같은 시약을 혼합 : DMEM의 72.5 ML, F12 24 ML (햄의)을, 2 ML 200 mm의 L - 글루타민, 269g / ML, 500X 200 μl ITES 200 μl 하이드로코티손, 0.05 200 μl O - phosphorylethanolamine M, 90 MM 200 μl 아데닌, 2 NM 200 μl Progesterone, 1 M의 240 μl CaCl2, 10 NM 100 μl 신생아 송아지 혈청 200 μl Triiodothyronine. 중간 III (300mL)를 확인하려면, 다음과 같은 시약을 혼합 : DMEM의 142.5 ML, F12의 142.5 ML (햄의), 200 mm의 L - 글루타민 6 ML을 269g / ML, 500X 600 μl ITES 600 μl 하이드로코티손 , 0.05 600 μl O - phosphorylethanolamine M, 90 MM 600 μl 아데닌, 2 NM 600 μl Progesterone, 1 720 μl CaCl 2 M 10 NM 6 ML 신생아 송아지 혈청 600 μl Triiodothyronine. </li></ol></li><li> , 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 flasks에서 인간 keratinocytes을 Trypsinize 간장 콩 트립신 억제제 (250 1X 인산염의 MG / L은 생리 버퍼)와 트립신을 중화, 스핀 다운 매체를 재구성 피부에 4.17에서 X10 6 셀 / ML을 세포 펠릿을 resuspend I. </li><li> 피부에 X10 6 셀 / ML 중간 I.를 재구성, 스핀 다운 0.83에서 세포 펠렛을 resuspend, 콩 콩 트립신 억제제와 트립신을 중화, 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 인간 melanocytes 또는 문화 flasks에서 흑색증 세포를 Trypsinize </li><li> 각 삽입의 내부와 외부 모두에서 매체를 세척 제거합니다. </li><li> 피부가 중간 난 (각 삽입의 외부 내부 10 ML 1.5 ML)를 재구성 추가합니다. </li><li> , keratinocytes과 melanocytes 또는 흑색증 세포 600 μl 세포 현탁액 600 μl 세포 현탁액을 잘 섞는다. 각 삽입 안쪽에 드롭하여 200 μl 혼합 세포 현탁액 드롭을 분배. 피부 줄기 세포가 재건 들어, keratinocyte 정지 100 μl를 사용합니다. 37 2 일 품어 ° C. </li><li> 기음 피부 전을 중간 재구성내부 각 삽입의 외부 모두에서. 피부가 중간 II를 (외부에 내부 10 ML 2 ML) 재구성 추가합니다. 37 또 다른 2 일 품어 ° C. </li><li> 기음 피부는 내부에서 매체 II를 재구성하고 각 삽입의 외부, 7.5 ML 피부는 외부 매체 III를 재구성 추가합니다. 이 시점부터의 표면은 공기에 노출되는 시작 reconstructs. 18 일까지 매일 중간 III를 변경합니다. </li><li> 수확의 피부는 하루에 18 개조 : <ol><li> 내부와 삽입의 밖에서 미디어를 대기음. </li><li> 포셉와 트레이에서 삽입을 제거합니다. </li><li> 메스 블레이드로 가장자리에 원형 닫기 추적하여 (폴리 카보 네이트 필터 포함) 재구성을 잘라 버릴거야. </li><li> 하드 표면에 절반으로 재구성 및 필터를 잘라요. </li></ol></li><li> 파라핀 섹션의 경우 : 2 블랙 TBS 생검 용지 사이 조직학 카세트의 재구성 이상 4 시간 동안 포르말린 10 % 전체 카세트를 적시게의 절반을 놓으십시오. 그런 다음 70 % 에탄올에 카세트를 배치하고 그것은 4 ° C 보관하면 파라핀의 포함에 대한 재구성을 처리하기 위해 준비가 될 때까지. </li><li> 냉동 섹션의 경우 : <ol><li> 의 다른 절반을 플레이스 4 50 % 자당의 재구성 ° C를 1-2시간 들어, 다음 2M로 자당을 변경하고 다른 1-2시간 4 ° C에서 그것을 저장합니다. </li><li> 그것이 보트의 약 50 %를 채우도록 일회용 기본 주형으로 최적의 절삭 온도 냉동 미디어 (OCT)를 분배. OCT에서 거품을 피하십시오. </li><li> 포셉과 재구성의 가장자리를 잡고 자당의 재구성을 제거하십시오. Kimwipes은 자당을 흡수까지 Kimwipes에 놓으십시오. </li><li> 포셉 및 주걱을 사용하여 OCT 위에 기본 주형으로 재구성을 전송합니다. 기본 금형이 완전히 가득 때까지 더 OCT과 재구성의 상단 커버. 당신은 어려운 절삭 것입니다 OCT에 거품이없는 있는지 확인하십시오. </li><li> 조각 드라이 아이스에 골고루 기본 몰드를 삽입하고, OCT 완전히 동결 수 있습니다. </li><li> 주석 박의 기본 금형을 싸서가 -70 ° C에 저장이 그라 이오 스탯으로 잘라 준비가 될 때까지. </li></ol></li><li> 이식 피부가 마우스 재구성 : <ol><li> DMEM 5 ML (동결 defrosting 마우스 피부)와 50 ML 팔콘 튜브를 준비합니다. </li><li> 육주 주변 여성 SCID 사나이 답게 outbred 마우스를 사용합니다. </li><li> 마우스 isoflurane (EZ 마취 시스템)와 함께 anesthetized입니다 초기 마취는 수술 중에 nosecone 숨통을 통해 4 isoflurane % (마우스가 수술 침대로 이동하기 전에) 및 유지 마취로 유도 챔버에서 수행됩니다 (isoflurane : 1.5-2 % ). 마취 중에 안구 부상을 방지하기 위해 저체온증과 적용 살균 안과 윤활제을 방지하기 위해 온수 패드로 열 지원합니다. </li><li> 비커에 600 ML 물을 넣어 40 사이의 수온을 유지하기 위해 철판 위에두고 - 60 ° C. </li><li> 복합 benzoin 팅크와 알코올 사립 면봉으로 마우스 피부를 청소하십시오. </li><li> 나중에 suturing에 대해 동일한 순위를 유지하는 마우스를 다시 위에 라인을 표시합니다. </li><li> 이리스 가위와 집게를 사용하여 마우스를 상단 뒷면에 직경 1.2 cm에 대한 원형 상처 침대 컷. 멸균 거즈 스폰지와 상처 침대 커버. 그것이 완전히 동결까지 DMEM 5 ML에있는 둥근 마우스 피부를 넣어 다음 액체 질소 용기에 둡니다. 서리를 없애다는 철판 위에 온수에있는 튜브가 완전히 해동까지. 3 회 반복합니다. </li><li> 피부가 수술 블레이드를 사용하여 트랜 스웰에서 재구성 매우 신중하게 막을 제거 분리, 피부 상처 침대 위에 (최대 표피 사이드) 재구성 전송할 수 있습니다. </li><li> 피부 재건 위에 마우스 피부 (최대 표피 사이드)를 놓으십시오. </li><li> 이전에 표시된 마커의 첫 봉합, 마우스 피부를 해결하기 위해 양쪽에 두 번 더 봉합 후, 바닥에 두 번째를 확인합니다. </li><li> 접목 후 클린 마우스 피부. nosecone를 제거하고 깨어 및 외래까지 온수 패드에서 마우스를 계속. </li><li> 새 케이지에 마우스를 올려. </li><li> 즉시 수술 후 피하 주사, 수술 후 24 시간 48시간에 의해 Meloxicam (1 MG / kg) : 수술 진통제를 게시합니다. </li></ol></li></ol> 2. 대표 결과 : 피부는 정상 피부 melanocytes 및 줄기 세포로 reconstructs 피부는 삽입과 특수 6 잘 트레이에 양식 아르 reconstructs. 피부 구획은 첫 번째 사일 (그림 1A) 10 % FBS와 DMEM에 교양있다. 피부는 매체 keratinocytes가 melanocytes 또는 흑색증 세포 (그림의 1B)와 씨앗을 때 제가 사용을 재구성. 표피는 일 9시 공기에 노출이 keratinocytes는 (그림 1C) 차별화 수 있습니다. 18 일, 피부의 표피는 층상 keratinocyte 레이어로 구성되어 있습니다 reconstructs. undifferentiated 기초 레이어와 순차적으로 차별화된 레이어 (그림의 1D) 세로 방향으로하고 있습니다. 얼룩melanocytic 마커 S100과 reconstructs의 섹션을 주입하면 해당 melanocytes가 dendrite 확장 (그림 1E)를 통해 여러 keratinocytes로 표피와 의사 소통의 기초 레이어에 정렬됩니다 보여줍니다. 피부 칸막이는 콜라겐 유형 I 매트릭스에 포함된 섬유아 세포가 포함되어 있습니다. 입금 콜라겐 IV는 진피 (그림 1 층)에서 표피를 분리 지하 막을 나타냅니다. 피부 줄기 세포가 (GFP lentiviral 벡터로 표시) 콜라겐 I 매트릭스에 섬유아 세포와 함께 포함된 경우, 그들은 표피로 마이 그 레이션 및 melanocytes (1), (그림 2)로 구분. 표피에 keratinocytes 여러 레이어가 개발됩니다. 피부 흑색증 종양의 reconstructs Clinicopathological 연구에 따르면 stepwise 방식으로 melanomas 진행 : 공통 인수 nevi, dysplastic nevi, RGP (레이디얼 성장 단계) melanomas, VGP (수직 성장 단계) melanomas 및 전이성 melanomas (7). 흑색증 세포 라인의 다른 단계는 2 - D 문화 (그림 3A - D)에 서로 morphologically 비슷하지만, 그들은 피부가 reconstructs에 통합하는 경우, 세포의 동작들은 생체내 특성에를 반영합니다. 위치와 정상 melanocytes의 성장 속도는 밀접하게 피부 (그림 3E) reconstructs에서 제어됩니다. VGP melanomas WM793은 진피 (그림 3G)에 invasively 성장 반면 RGP 기본 melanomas WM35은 표피 (그림 3 층)에서 주로 세포 분열 따위에 의해 번식. 전이성 melanomas 1205Lu 적극적으로 진피 (그림 3H)에 깊이 침범. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> 그림 1. 피부는 정상적인 melanocytes로 reconstructs. 피부의 총 외관 AC로 표시됩니다 reconstructs. 콜라겐과 혼합된 A.의 섬유아 세포는 DMEM는 FBS 및 양식 피부 칸막이 10 %를 포함하는 재배하고 있습니다. B.의 Keratinocytes과 melanocytes는 진피 위에 씨앗과 매체를 재구성 피부 성장하고 있습니다. C. 표피는 일 9시 공기에 노출됩니다. D. H &amp; E - 묻은 피부 재구성은 수직 구성 표피, 지향 기저 계층, 그리고 순차적으로 차별화된 층상 세포 레이어를 제공합니다. 진피는 콜라겐 유형 I 매트릭스에 포함된 섬유아 세포가 포함되어 있습니다. E. S100 - 긍정적인 melanocytes (검은색 화살표)가 여러 keratinocytes과 지하 막과 의사 소통에 정렬됩니다. F. 콜라겐 IV - 얼룩은 진피에서 표피를 분리 지하 막을 나타냅니다. DF의 모든 stainings는 포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 섹션에서 수행되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> 그림 2. 피부에 피부 줄기 세포가 표피로 마이 그 레이션 및 melanocytes에 차별 reconstructs. 일 5시 시딩의 keratinocytes 후 단일 GFP 양성 세포 (녹색)이 분야에서 밖으로 마이 그 레이션 시작합니다. 표피는 여전히 하나의 레이어로 구성되어 있습니다. 일 8시, 몇 가지 세포가 표피 - 진피 인터페이스에 도달. 10 일, GFP 양성 세포는 단단히 지하 막 위치에 정렬됩니다. 이전 GFP 양성 표피 표현 melanocytic 표시 HMB45 (빨강, 흰색 화살표로로 표시)에 세포. 핵은 DAPI (파란색) 물들일 수 있습니다. 표피는 여러 계층으로 개발되고 있습니다. 지하 막이 흰색 점선과 함께 표시됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> 그림 3. 피부 melanomas의 다양한 단계의 reconstructs : AD. 일반 melanocytes 및 흑색증 전지는 2D 문화에서 성장. 포피에서 A.의 Melanocytes. B. RGP WM35 세포. C. VGP는 WM793 세포. D. 전이성의 흑색증의 1205Lu 세포. E. 일반 melanocytes은 지하 막에 위치하고 있습니다. F. RGP의 흑색증 WM35 세포는 표피의 세포 클러스터로 성장합니다. G. VGP의 흑색증 WM793 세포는 지하 세포막을 통해 진피에 침공. H. 전이성의 흑색증 1205Lu 세포가 적극적으로 진피 깊숙이 침범. 문제 해결 <table border="1"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 문제 해결 </td></tr><tr><td> 콜라겐 혼합물이 응고되지 않습니다 </td><td> 콜라겐 혼합 색상이 분홍색으로 밀짚 노란색해야합니다 그렇지 않으면 산도 잘못하고 콜라겐 젤하지 않을 수 있습니다. 색상은 노란색 밝은 경우보다 나트륨 중탄산염가 드롭 들러 추가되어야합니다. </td></tr><tr><td> 콜라겐이 성급하게 mixuture에 precipitates </td><td> 콜라겐 혼합물이 삽입에 배치까지 얼음의 모든 구성 요소를 보관 </td></tr><tr><td> 계약 콜라겐은 (한쪽이 다른 쪽보다 두껍습니다)도되지 않습니다 </td><td> 인큐베이터의 선반을 보정 </td></tr><tr><td> 표피가 이하보다 세 keratinocyte 레이어로 형성됩니다. </td><td> 낮은 구절에서 undifferentiated keratinocytes을 사용하여 </td></tr></tbody></table>

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	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 3 차원 피부를 생성하는 것은 정상적인 인간의 melanocytes, 피부 줄기 세포와 흑색증 세포와 reconstructs 설명했습니다. monolayer 문화에서 재배 때, melanocytic 전지는 비슷한 형태 (평평, 스핀들 또는 돌기 모양의 이상)에 관계없이 임상 단계 자신의 기원을 제시. 반대로, 3D 피부 흑색증 세포의 무대 특정 속성을 요점을 되풀이하다 reconstructs. 일반 인간 melanocytes는 표피와 단일 세포로 피부 층 사이의 지하 점막에 거주. 더 적극적인 VGP의 흑색증 세포가 진피에 지하 막 통해 파괴 대형 클러스터로 성장하는 반면 RGP 기본 흑색증 세포는 지하 막 따라 작은 클러스터로 성장합니다. 전이성 흑색증 세포는 모든 방향으로 성장하고 단일 세포 또는 클러스터로 진피 깊숙히 침공. 정량 분석​​은 침략의 깊이와 확산의 범위를 측정하여이 모델에 수행할 수 있습니다. 정상 및 악성 melanocytic 세포의 특성뿐만 아니라, 모델을 사용하여 우리는 직접 (E - cadherin의 upregulation 통해 keratinocytes과 타고난 의사 소통을 확립 표피의 기저 레이어 가정과 성숙 melanocytes에 피부 줄기 세포의 분화를 일으킬 수 6). 바이러스성 벡터를 사용하여, 우리는 중 활성화하거나 melanocytes의 변환 메커니즘뿐만 아니라 공부를 효율적으로 모델이 될 거라는 걸 약속 역학과 피부의 각 세포 유형으로 표현 유전자의 기능 중요성에 대한 이해 reconstructs을위한 유전자 기능을 inactivate 수 있습니다 뿐만 아니라, 흑색증 (8)의 진행. 세포 phenotypes의 장기 관찰 피부가 immunodeficient 동물 reconstructs의 접목을 통해 가능하게되었습니다. 이러한 인간의 피부 마우스 키메라는 melanomagenesis 및 흑색증의 전이를 공부하는 우수한 연구 도구입니다. 피부는 또한 약물 평가를위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다 reconstructs. 2D 문화 조건에서 암 세포를 근절 많은 약물은 종종 실험 및 임상 응용 프로그램에 거의 영향을 미칩니다. 로 본 생체내 종양에 3D 문화의 흑색증 세포는 microenvironment가 흑색증의 신호 경로를 modulates 것을 제안, 자주 2D 문화의 세포가 반응 마약에 강한 있습니다. 성공적인 약물 발견, 3D 피부가 모델이 생체내의 화합물 (9,10)의 효과를 예측할 수있는 이상적인 도구입니다 잠복기 재구성. 요약, 피부는 모델 체외 및 생체내 연구 사이의 격차를 다리 재구성. 그들은 변화에 기여하는 유전자가 변화의 방법과 줄기 세포 관련되어있는 이해로 이어질 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 10X EMEM </td><td> 바이오 휘태커 </td><td> 12 - 684F </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH - 30071.02 </td></tr><tr><td> 보빈 텐든 산성 - 추출된 콜라겐 </td><td> Organogenesis </td><td> 50분의 200 </td></tr><tr><td> 삽입물과 조직 문화 6 - 잘 트레이 </td><td> Organogenesis </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Keratinocyte 세럼 무료 매체 </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Dialyzed 소태아 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH - 30079.03 </td></tr><tr><td> 재조합 인간 줄기 세포 계수 </td><td> 피츠제럴드 산업 </td><td> RDI - 307 - 255X </td></tr><tr><td> 기본 FGF </td><td> 피츠제럴드 산업 </td><td> 30R - AF015 </td></tr><tr><td> 엔도테린 - 3, 인간 </td><td> 미국의 펩타이드 (주) </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 시그마 </td><td> C - 7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH biosciences </td><td> 56430 - 10L </td></tr><tr><td> F12 (햄의) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> 하이드로코티손 </td><td> 시그마 </td><td> H - 0888 </td></tr><tr><td> 인슐린, 트랜스페린, Ethanolamine, 셀레늄 (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O - Phosphorylethanolamine </td><td> 시그마 </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 시그마 </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> 시그마 </td><td> P - 8783 </td></tr><tr><td> Triiodothyronine </td><td> 시그마 </td><td> T - 5516 </td></tr><tr><td> 갓 태어난 송아지 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 포르말린 10 % 버퍼 </td><td> Surgipath </td><td> 00,600 </td></tr><tr><td> 최적의 절삭 온도 냉동 미디어 (-10 월) </td><td> 사쿠라 </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> 멀티 카세트 </td><td> Surgipath </td><td> 02293 - BX </td></tr><tr><td> TBS 생검 논문 </td><td> 트라이앵글 비오 메디컬 사이언스 </td><td> BP - B </td></tr><tr><td> TBS 생검 논문 </td><td> 트라이앵글 비오 메디컬 사이언스 </td><td> BP - B </td></tr><tr><td> 일회용베이스 금형 </td><td> 어부 </td><td> 15-182 - 501C </td></tr><tr><td> 복합 benzoin 팅크 </td><td> 전문 Disposables, Inc의 </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> 알콜 프렙 면봉 </td><td> CVS 약국 </td><td></td></tr><tr><td> 실크 블랙 브레이 디드 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> 거즈 스폰지 (살균) </td><td> CVS 약국 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> 홍채 가위 </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> 외과 블레이드 </td><td> 깃털 </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ의 마취 </td><td> Euthanex 주식 회사 </td><td></td></tr><tr><td> SCID 사나이 답게 outbred 마우스 </td><td> 찰스 리버 </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

누적 증거 세포가 그들이 3D 엑스트라 세포 매트릭스 내에서 재배 때 다르게 행동하고 다른 세포와 (1-5) 넓게 이용하고 있음을 나타냅니다 동안 실험 피부 생물학 체외 연구에서 대부분 (2D) 2 차원 monocultures에서 수행되었습니다 . 마우스 모델은 크게 생체내의 조직 morphogenesis 연구를 이용했습니다. 그러나 마우스와 인간의 피부 세포 구조와 어려운 사람에게 마우스 연구를 추정 수 있습니다 생리학에서 큰 차이가 있습니다. 마우스 피부에 melanocytes가 주로 모낭에서 현지화된 있기 때문에, 그들은 표피의 기저 계층에서 주로 찾을 수있는 인간의 사람에서 독특한 생물 학적 특성을했습니다. 3D 인간 피부의 최근 개발 모델은 셀 매트릭스와 다른 세포 유형 간의 세포 세포 상호 작용을 조사하기 위해 필드를 사용할 수 있습니다 재구성. 콜라겐 I 매트릭스, 층상, 차별화된 keratinocytes 및 진피에서 표피를 분리 기능 지하 막의 구성이다 &quot;표피&quot;에 포함된 섬유아 세포와 &quot;진피&quot;이루어져 reconstructs. 콜라겐은 비계, 양분 전달, 그리고 휴대 전화의 상호 작용에 대한 가능성을 제공합니다. melanocytic 세포 melanocyte 항상성과 인간의 피부에 흑색증의 진행의 자연 기능을 요점을 되풀이 통합 3D 피부 모델. 생체내 마찬가지로 복원된 피부 melanocytes은 기초 레이어 keratinocytes로 interspersed 지하 막에 현지 있습니다. 흑색증 세포는 생체내에서 원래 종양의 단계 (RGP, VGP 및 전이성 흑색증 세포) 반사 같은 특성을 나타냅니다. 최근, 피부 줄기 세포는 인간의 진피 (6)에서 확인되었습니다. 이러한 멀티 - 강력한 줄기 세포가 표피로 마이 그 레이션 및 melanocytes을 구별하실 수 있습니다.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

이 보고서에서는, 우리는 3 차원의 피부 구조와 구성에 인간의 피부를 모방 모델을 재구성 설명합니다. Melanocyte 생리, 흑색증의 진행 및 피부 줄기 세포의 운명은 피부 모델을 재구성 사용하여 조사되었습니다. 모델은 또한 약물 평가를위한 잠복기 도구로 유용합니다.

3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.2K 조회수.  The Wistar Institute. 이 보고서에서는, 우리는 3 차원의 피부 구조와 구성에 인간의 피부를 모방 모델을 재구성 설명합니다. Melanocyte 생리, 흑색증의 진행 및 피부 줄기 세포의 운명은 피부 모델을 재구성 사용하여 조사되었습니다. 모델은 또한 약물 평가를위한 잠복기 도구로 유용합니다.

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

연구

생체공학

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

모델 보컬 폴드 폴립에 의해 유도된 3차원 유동 분리 조사

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

거대 분자 군중을 사용하여 인간의 절단 비대 흉터의 시험관 내 모델

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...