이 연구는 NCI (R01-94160 및 R01-155086), IU 사이먼 암 센터 소아 연구 웰스 센터에 의해 지원되었다.

이 연구는 의학의 인디애나 대학 학교에서 IACUC위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 올바른 유전자형을 가진 쥐를 생성 <ol><li> BCCs의 마우스 모델을 설정합니다. R26-SmoM2 YFP 마우스 (잭슨 연구소 주식 번호 005130) (18)와 동료 K14-CreER 마우스 (잭슨 연구소 주식 번호 005107)은 K14-creER +와 R26-SmoM2 YFP + 마우스를 생성합니다. </li><li> 유전자형을 수행합니다. 1 MG / ML 단백질 분해 효소 K와 directPCR 꼬리 용해 용액에 담가 꼬리를 표본 (0.5 cm 길이) 55 ° C 떨고 하룻밤. 다음 날 (유전자형에 대한 상층 액을 유지하기) 마이크로 원심 분리기에서 최고 속도로 원심 분리하여 조직 파편을 제거합니다. 공급 업체에서 권장하는 프라이머 및 조건 각 PCR 반응 상층 액 1 μL를 사용합니다. 오른쪽 유전자형 (3-6 주 나이, 0.05-0.1에서 부 프레 노르 핀의 MG / kg이 꼬리를 싹둑 후에 2-3 일 SQ마다 8-12 시간을 통해 적용됩니다) FO와 마우스를 선택R 2 단계. </li></ol> 2. 피부 각질 형성 세포의 SmoM2의 발현을 유도 먹이 바늘 (20 게이지 곡선)을 경구 투여를 통해 연속 5 일 동안 타목시펜 (각 먹이는 식물성 오일 50 ㎖에 5 ㎍ / kg 체중)의 경구 투여에 의한 각질 형성 세포에서 SmoM2 발현을 유도. 3. 피부 표본을 준비 일반적으로, 표현형은 K14creER/R26SmoM2 GFP 마우스의 귀 꼬리에 더 심각합니다. 세포 분석을 준비하기 위해, 우리는 먼저 제도적 승인 절차 (CO 2 플러스 자궁 경부 전위)와 동물의 희생 후에 마우스 피부를 수확. 4. 표피를 분리 <ol><li> 승인 절차 (3 단계 참조) 희생 생쥐 후, 트리머를 사용하여 모피를 제거합니다. 37 디스 파제 (dispase) 용액 (10 % FBS와 DMEM 5 MG / ML) ° 1-2 시간 (이하 8 주 오래 된, 2 시간 마우스를위한 1 시간 동안 C에 담가 피부 표본) 8 주 이상 오래 생쥐합니다. </li><li> 다음 디스 파제 (dispase) 처리, 포셉으로 진피 별도의 표피. </li></ol> 5. 단일 세포를 생성 <ol><li> 단일 세포 인구를 얻으려면, 50 ML 튜브에 37 ° C에서 1-2 시간 동안 콜라게나 제 IV 용액 (10 % FBS와 DMEM 1 ㎎ / ml)에 몰입 한 후 가위로 표피를 말하다. 부드럽게 소용돌이 관에게 세포 분열을하는 데 도움이 매 20 분하려고합니다. </li><li> 현미경으로 세포 분열을 검사합니다. 하나의 세포가 콜라 매체에 감지 할 수있을 때, 세포 수율을 높이기 위해 추가로 30 분 동안 표본을 품어. 일반적으로, 하나의 마우스에서 표피는 10 7 셀을 얻을 수 있습니다. </li><li> 벤치 탑 원심 분리를 통해 1,500 rpm에서 셀 스트레이너 (기공 크기 70 μm의), 스핀 세포를 통해 조직의 혼합물을 필터링하고, PBS와 시간을 한 번 씻는다. </li></ol> 6. 라벨 세포 및 유동 세포 계측법의 분석을 수행 <ol><li> 10 % FBS에서 세포를 resuspend을PBS 2.5 X 10 6 세포 / 비 특정 바인딩을 차단하는 ML에서 (얼음에 30 분 동안) </li><li> 특정 항체 라벨 1.5 ML 모세관의 각 세포의 나누어지는 가져 가라. 2 μg / ML의 최종 농도에서 각 튜브에 서로 다른 항체를 추가합니다. 몇 초 동안 부드러운 정점을 통해 세포와 항체를 혼합하고 1 ML PBS로 세척 한 후, 30 분 동안 얼음에 그들을 두십시오. , vimentin에-FITC (섬유 아세포) (자세한 내용은 시약 참조) CD11b-PE 플러스 GR1-APC (골수 세포 또는 골수 유래 억제 세포) : BCC 견본을 위해, 우리는 다음과 같은 생체에 대한 항체를 사용 하였다. </li><li> 세포 염색을 위해, 우리는 키트를 사용하여 (자세한 내용은 시약 참조) 공급 업체의 설명서를 따르십시오. 우리는 세포 표면 마커를 분석하는 새로운 세포를 사용합니다. 표면 마커 염색 한 후 세포를 세척하고 PBS에서 그들을 resuspend을. 1 μg / ML의 최종 농도에서 세포 혼합물에 DAPI를 추가합니다. DAPI 더 분석에서 게이트 수있을 것이다 죽은 세포를 얼룩 것입니다. </li><li> specifi를 사용하여 데이터를 분석C 소프트웨어. 우리가 처음 FSC 대 SSC 플롯에 따라 단일 셀을 선택하고, 추가 분석을 위해 DAPI 음 인구 (살아있는 세포)를 사용합니다. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. 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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 BCCs의 세포 인구 분석을위한 방법을 설명했습니다. 종양 조직은 많은 세포 유형의 일관성, 각 세포 유형은 체외 조건에서 가장 아래도 탈환하는 것은 매우 어려운, 발암 주어진 시간에 다르게 동작합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 기저 세포 암의 개발은 표피 줄기 세포의 확장뿐만 아니라 골수 세포의 채용에 의해 동반되는 것으로 나타났다. 면역 또는 면역 형광 분석에 비해 세포 인구 분석은 세포 유형의 다양한 특정 항체 이후 세포 인구 변화의 정량적 인 평가를주고는 이제 사용할 수 있습니다. 유전자 유도에 의한 표현형의 변화는 시간이 필요하기 때문에이 프로토콜에 대한 10 주이 연구를 완료하는 데 필요합니다. 그것은 미리 실험을 계획하는 따라서 중요합니다. 세포의 분리 및 분석을 위해, 이틀이 필요할 수도 있습니다. 살아있는 세포는 분석가를 위해 사용되기 때문에ES, 그것은 미리 FACSCalibur을 예약하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜 (아래 참조)로 작업 할 때 우리는 또한 일반적인 문제를 나열했습니다. 우리의 경험에서, 아래는 우리가 발생하는 일반적인 문제 : <ol><li> 표피별로 분리 :이 완료되지 않은 디스 파제 (dispase) 처리 (diapase 치료의 시간을 늘려주세요) 또는 부족 디스 파제 (dispase) 솔루션 (피부가 완전히 디스 파제 (dispase) 용액에 담가해야합니다)가 발생할 수 있습니다. 우리는 하나의 마우스 디스 파제 (dispase) 솔루션의 적어도 5 mL를 사용합니다. 볼륨이 피부의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 콜라게나 제 IV를 가진 불완전한 소화로 인해이 5 월 : 세포 수의 낮은 수율. 첫 번째 검사 콜라 농도 또는 만료 날짜를하시기 바랍니다. 이것은 또한 사용 표피의 부족 금액으로 인해 발생할 수 있습니다. 또한, 효소 소화 ° C (소화를 수행하기 전에 온도를 조정하십시오) 흔들어 37에서 수행되어야한다. </li><li> 세포 덩어리 : 이것은 (피부 세포에 대한 피펫 세포 매우 일반적입니다몇 번 여과기 (원심 분리 이전) 또는 마그네슘 2의 존재를 거쳐 +와 칼슘 2 + 용액 (MG 2를 사용하십시오 셀 워시 +와 칼슘 2 + 무료 PBS). </li><li> 너무 많은 죽은 세포 :이 (신선 조직을 사용하십시오) 저하 조직의 결과이거나, 수에 소화 (디스 파제 (dispase)와 콜라게나 제 IV로 확장 배양을 방지). </li></ol> 이 프로토콜은 골수 이식 또는 세포의 기원을 조사하는 조직 이식과 결합 될 수있다. 예를 들어, 이식 GFP - 표현 치명적 조사 생쥐에 골수 세포는 우리가 종양 - 관련 섬유 아 세포와 골수 세포에 골수 세포의 기여를 검사 할 수 있습니다. 마찬가지로, 피부 종양은 종양 호스트 상호 작용을 조사하는 새로운 마우스 호스트에 이식 할 수 있습니다. 발암 동안 세포 인구 변화를 조사 할뿐만 아니라,이 프로토콜은 연구자들이 검토 할 수 있도록종양 환경에서 세포에 약물 치료의 효과. 이 프로토콜은 피부 동안 세포 인구 분석에 사용하도록 설계되어 있지만 발암, 약간의 수정은 다른 암 유형에 대해 만들 수 있습니다. 요약하면, 피부 암의 마우스 모델에서 세포 인구 분석은 우리에게 종양 전이에서 세포 생물학의 더 나은 이해로 이어지는 발암 동안 동적 세포 변화, 그리고 변환 과정에서 서로 다른 세포 이벤트를 제공 할 수 있습니다.

인간 암의 가장 흔한 유형으로, 기저 세포 암종 (BCC)는 1 년마다 약 2 백만 미국인에 영향을 미칩니다. 증거를 축적하는 고슴도치 (Hh를) 신호의 비정상적인 활성을 나타내는 것은 BCC 개발 (2,3 년 후기) 기본 원동력이다. BCCs의 신호 Hh를의 변경은 불 활성화 PTCH1 4-6의 돌연변이, SMO 7-9의 기능 획득 돌연변이 및 Hh를 통로 전사 인자 GLI1 10 GLI2 11 또는 네거티브 레귤레이터 스와의 희귀 비활성화 돌연변이 (푸의 탈선 표현을 포함 ) 12. 모든 이들과 다른 연구를 통해, 연방 의약청 (FDA)은 최근 BCCs 13-15 전이성 로컬 고급 치료하는 Hh를 신호 억제제 Vismodegib의 사용을 승인했습니다. 이러한 모든 성과 16에도 불구하고, 우리는 여전히 Hh를 신호가 CARC를 구동하는 분자 및 세포 메커니즘을 이해하지inogenesis. Hh를 신호의 조직 특이 활성화를 사용하여 동물 모델을 확립하는 것은 이러한 연구를 위해 및 약물 내성에 대한 우리의 이해를 위해 여전히 중요합니다. 마우스에서 야생 형 생쥐, 심지어 발암 물질 UV 또는 전리 방사선의 무거운 복용량에 따라, BCCs을 개발하지 않습니다. 반면, Ptch1 + / - 마우스는 BCC 개발 17,18에 감염 될 수 있습니다. 정상적인 조건에서 유지하는 경우 마우스를 거의 자란 BCCs을 개발하지 - Ptch1에서 BCC 개발의 투과도는 + / - Ptch1 + /는 있지만 마우스 50 % 이상 18,19입니다. Ptch1의 배아 치사로 인해 - / -, PTCH1의 조직 특이 녹아웃은 일반적으로 연구 20에 사용됩니다. 또한, 종양 SmoM2 YFP (Krt14-creER : R26-SmoM2 YFP 또는 Krt14-CRE : R26-SmoM2 YFP)의 조건 피부 특정 표현에 대한 쉬운 유전 적 분석을 제공하는 아주 어린 나이에 여러 개의 미세한 BCCs의 형성에 이르게 HH 신호는 할SMO 21 하류 측. BCC 생물학 지식의 세 가지 주요 문제가 있습니다. 첫째, BCCs의 세포 기원은 완전히 명확하지 않습니다. 일부 연구는 줄기 세포 사이트에 22-24으로 머리 여포의 꿈쩍도을 지원하지만, 유세프 등. 25 머리 여포에 간 소낭 표피 지역에있을 피부 HH-기반 종양의 기원의 쥐 셀 현지화되지 않음 , ROSA26 기반의 유전자 돌연변이 SMO의 발현을 활성화하는 세포 특정 크레을 사용하여. BCC 개발하는 동안 둘째, 세포의 상호 작용이 잘 이해되지 않습니다. 그것은 활성화 Hh를 신호로 각질이 BCCs의 형성으로 이어질 수 있다고 알려져 있지만 다른 세포 변화가 잘 - 이해되지 않습니다. 또한, 마우스의 SMO 길항제의 치료 약제 내성 26-28로 이어질 수 있습니다. BCC에 대한 그러므로 새로운 표적이 크게 필요하다. 이 세 가지 문제를 이해하는 것은 carcinog 동안 생쥐의 세포 변화에 대한 분석이 필요enesis. 여러 가지 방법이 각질 문화, 유동 세포 계측법, 피부 줄기 세포 분리 29-31으로 출판되었지만, 마우스 BCCs의 세포 분석을위한 종합적인 절차는 현재 없습니다. BCCs의 마우스 모델, 표피의 분리, 조직 및 세포 분석에서 단일 세포의 생성을위한 방법을 결합하여, 우리는 BCC 개발 과정에서 세포 신호, 세포 및 분자의 상호 작용을 연구하는 일련의 절차와 독자를 제공합니다. 우리는이 프로토콜은 독자가 각 절차를 수행하는 방법을 볼 수 있다고 생각합니다. 또한, 우리는 결과가 어떠해야하는지 설명하기 위해 일부 데이터를 제공하고, 독자는 이러한 절차를 수행하는 동안 어려움을 극복하는 데 도움이되는 문제 해결.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

암 개발은 암 전구 세포, 면역 세포, 섬유 아세포 및 혈관 내피 세포를 포함한 여러 세포 유형을 포함하는 여러 단계 프로세스입니다. 세포의 각 유형 발암 동안 신호 및 기능 변화를 겪는다. 많은 암 연구에 대한 현재의 과제는 생체 내에서 여러 단계의 과정 동안 각 세포 유형에서 이러한 변경을 해부하는 것입니다. 지난 몇 년 동안, 저자는 K14creER/R26-SmoM2 YFP 마우스를 사용하여 피부암을 개발하는 동안 다른 세포 집단을 분리하는 절차의 세트를 개발했습니다. 분리 4), 마우스 피부 생검을 준비 3) 마우스 피부 2) 유도 SmoM2 YFP 표현, 연구에 적합한 쥐 (K14creER +와 R26-SmoM2 YFP +이 프로토콜의 생쥐를) 생성 : 1) 절차는 6 부분으로 나누어 져 있습니다 피부의 표피, 5) 표피에서 단일 세포를 제조하는 단계; 6) 유동 세포 계측법 분석을위한 단일 세포 인구를 라벨.오른쪽 유전자형과 생쥐의 충분한 수의 생성은 2 개월까지 걸릴 수 있습니다이 프로토콜의 제한 단계입니다. 단계의 나머지는 몇 일 몇 시간이 걸릴. 이 프로토콜 내에서, 우리는 또한 문제 해결을위한 섹션을 포함. 우리는 피부암에 초점을하지만,이 프로토콜은 인간의 질병의 다른 동물 모델에 적용 할 수정할 수 있습니다.

그것은 쥐 Hh를 신호 활성화를 제외하고 기저 세포 암을 개발하지 않는 것으로 알려져있다. 그림 1은 부드럽게 종양의 유도 발현 후 피부 표현형, SmoM2 YFP. 그림 2는 정상 및 종양 베어링 생쥐의 골수 세포의 분석을 보여줍니다 보여줍니다. CD11b + GR1 + 세포는 골수 세포에서 파생 된, 그리고 그들 중 일부는 파생 억제 세포를 골수 있습니다. 정상적인 상황에서, CD11b + GR1 + 세포 인구가 거의 감지 할 수 있지만, 염증이나 종양 발달에 대한 응답으로 증가 할 것이다. 우리는 CD11b + GR1 + 세포의 증가, 피부 결과에 SmoM2YFP의 유도 발현을 보였다. 현재 BCCs의 변화를 기본 분자 메커니즘은 명확하지 않다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> 그림 1. Morphologica마우스 피부 SmoM2YFP 유도 후 L로 변경됩니다. 위로 마우스 유전자형의 다이어그램을 보여줍니다. 가운데 패널 : 타목시펜으로 치료 K14creER +와 R26-SmoM2 YFP + 마우스 H &amp; E 섹션에서 크게 피부에 이상 (오른쪽)뿐만 아니라 피부 종양 (왼쪽)했다. 하단 패널 : 마우스 SmoM2YFP 유도없이 정상적인 피부를 찾고 (오른쪽)와 H &amp; E 부분 (왼쪽)에 아무 이상 형태를 보여 주었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> 그림 2. CD11b + GR1 + 세포의 흐름 분석. 피부암을 개발하는 동안 CD11b + GR1 + 세포의 변화를 조사하기 위해, 우리는 CD11b와 GR1에 형광 표지 항체 단일 세포와 스테인드 격리. FlowJo와 분석 후, 우리는 타목시펜 투여 쥐의 피부 조직이 세포 인구의 증가를 발견.

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Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

발암 성 암 세포와 암 미세 환경 사이의 상호 작용을 포함하는 프로세스입니다. 분자 이벤트를 해부 한 암을 개발하는 동안 여러 단계에서 서로 다른 세포 집단을 분리해야합니다. 기저 세포 암종에 대한 마우스 모델을 사용하여, 우리는 발암 동안 세포 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.

세포 인구 분석 피부 발암 중

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K 조회수.  Indiana University. 발암 성 암 세포와 암 미세 환경 사이의 상호 작용을 포함하는 프로세스입니다. 분자 이벤트를 해부 한 암을 개발하는 동안 여러 단계에서 서로 다른 세포 집단을 분리해야합니다. 기저 세포 암종에 대한 마우스 모델을 사용하여, 우리는 발암 동안 세포 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

연구

의학

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

전립선 발암 및 양성 전립선 비대증의 평가를위한 신장 캡슐 Xenografting 및 피하 펠렛 주입

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

건강 바이오 마커의 혈액 스팟 컬렉션 인구 연구에의 참여를 극대화하기 위해 건조

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

에 대한 쥐의 내시경<em&gt; 생체</em&gt; 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

흉터 상처 수리의 마우스 태아의 피부 모델

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

다발성 경화증 재발 데이터로 입증 된 계절 변화의 삼각 모델링하는 방법

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Assessment of Child Anthropometry in a Large Epidemiologic Study

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to understand health effects of child growth and adiposity. Gold standard methods of measuring adiposity, such as dual X-ray absorptiometry (DXA), may not be feasible in large field studies. Research staff can, however, complete anthropometric measurements, such as body circumferences and skinfold measurements, using inexpensive portable equipment. In this protocol we detail how to obtain manual anthropometric measurements from children, including standing and sitting height, weight, waist circumference, hip circumference, mid-upper arm circumference, triceps skinfold thickness, and subscapular skinfold thickness, and procedures to assess the quality of these measurements. To demonstrate accuracy of these measurements, among 1,110 school-aged children in the pre-birth cohort Project Viva we calculated Spearman correlation coefficients comparing manual anthropometric measurements with a gold standard measure of body fat, DXA fat mass1. To address reliability, we evaluate intra-rater technical error of measurement at a quality control session conducted on adult female volunteers.

In epidemiologic studies of children, well-trained research staff can accurately and precisely assess weight, height, sitting height, skinfold thicknesses, and body circumferences.

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to ...