우리는 대학에서 박사 폴 Weigel 감사하고 싶습니다. 그녀의 기술 지원 HARE/Stabilin-2 수용체와 자넷 Weigel의 검출에 대한 단클론 항체 30 사용 오클라호마니다. 이 연구는 네브라스카 연구 자금의 대학에 의해 후원됩니다.

1. 간장의 절단 (변경 14,15과 함께 PO Seglen 12 R. Blomhoff 13 일부터 채택) <ol><li> 닫힌 5.5 L 챔버에 페트리 접시에 폴리에틸렌 글리콜의 isoflurane 10 ML 30 %를 추가합니다. 그것은 챔버 내에 안정 분위기를 만들 수 isoflurane를 추가 후 10-15 분 기다 리 최적입니다. </li><li> 밀폐 챔버에서 쥐를를 삽입하고 anesthetized 될 수 있습니다. 마취의 전체 효과는 동물 응답, 지치게되면 분명하며, 깊은 호흡을 전시하고 있습니다. </li><li> 30 ML 주사기 튜브의 하단에있는 일부 면화 공에 폴리에틸렌 글리콜의 isoflurane의 장소 2 ML. </li><li> 기저귀 - 대상 트레이과 장소 주둥이를 통해 주사기 튜브에 미치는 뒷면에있는 쥐 놓으십시오. </li><li> 즉시 70 % 에탄올로 복부를 젖음하여 깊은 마취를 확인합니다. 동물이 isoflurane 과다 복용에 의해 죽게 내버려하지 마십시오. </li><li> 붕대 가위와 집게를 사용하여 전체 abd 노출ominal 캐비티. </li><li> 베나 포르를 찾아, 집게를 사용하여 즉시 mesenteric 지점 위에있는 베나 포르 아래 수술 실크 또는 폴리에스터 스레드 (끈)의 두 가닥을 그립니다. </li><li> 포셉을 철회하고 느슨한 overhand의 매듭을 묶게. </li><li> 베나 포르 아래 집게를 사용하여 부드럽게 정맥을 평탄케하기 위해 후퇴, Insyte의 Autoguard의 카테 테르 (18 GA, 1.3 X 300mm, BD Biosciences) 또는 유사 카테터와 정맥을 cannulate. 카테 테르는 스레드에 의해 형성된 루프를 넘어 몇 mm를 이동해야합니다. </li><li> 카테 테르에 용수철 트리거를 발표하여 바늘을 철회하고 제거합니다. 피가 적절한 봉합사 배치를 나타내는 카테 테르에까지 들어와서 시작합니다. </li><li> overhand의 매듭을 고정시켜 다른 overhand 매듭으로 확보. </li><li> 하부 대정 맥 또는 내림차순 대동맥 (대동맥의 abdominalis)는 혈액이 순환 시스템에서 유출하도록하거나 끊다. </li><li> 산소로 간 꼴이지 시작37 TBS ° C 20 ML / 분의 유량에서 혈액 (창백)를 제거합니다. 간은 붉은 자주색에서 롬 색상 설정해야합니다. </li><li> 간이 플러시되는 동안, 소비세 GI 요로 및 결합 조직 멀리 절단하여 간장. 간 또는 주사 Glisson의 캡슐을 괴롭히다하지 중요합니다. </li><li> 버퍼가 수집 및 recirculated 수 있습니다 퍼널을 통해 플라스틱 그물에 간 놓습니다. 이 시점에서 버퍼는 recirculated하지만 폐기물 비커에 흐름을해서는 안됩니다. 플러쉬는 10 분 이상 지난해서는 안됩니다. (그림 2A). 단계 2.1 필요한 endocytosis 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 2. 125 I - SA - B - C 형 간염 (또는 기타 적합한 레이블 리간드)의 국제화 <ol><li> 작은 비커에 50 ML RPMI 미디어, 최종 농도 0.05 %의 BSA와 0.01 MCI 125 I - SA - B - C 형 간염 또는 endocytosis 다른 적절하게 표시 리간드에 추가할 수 있습니다. </li><li> apparatu이 비커를 첨부하여S는 산소를 허용합니다. </li><li> , 펌프를 끄고 유입 튜브를 전환한 다음 20 ML / 분 펌프를 켭니다. </li><li> 표시된 RPMI이 간을 방법으로 펌프를 끄고 퍼널 및 튜브의 배수구로 초과하는 액체를 허용합니다. </li><li> 분류 미디어의 재순환을 허용하고 펌프를 다시 시작합니다 미디어 비커에 드레인 튜브를 놓습니다. </li><li> 체액이 2 개 이상의 시간 동안 간을 통해 recirculate 수 있습니다. </li><li> 이 국제화 단계 동안 간장의 온도가 그것을 커버하고 소화에 대한 collagenase를 준비하여 안정되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. collagenase의 소화에 의한 간장의 소화 <ol><li> 신선한 해산 및 필터링 (0.45 μm의) collagenase가 (100 MG / kg 쥐의 무게) 37 60 ML을 초과하지 않는 총 볼륨 ° C. 2를 버퍼에 추가합니다 볼륨 길이 / 튜브의 내부 볼륨에 따라 좌우됩니다 그에 따라 조정해야합니다. </li><li> 펌프 및 교환을 중지미디어 비커에서 TBS로 유입 튜브. </li><li> 50 ML / 칼슘에 의존하는 desmosomal 세포 분기점의 느슨해진을 허용 분 2 분 간 물로 씻어. </li><li> 간이 플러시되는 동안 장치에서 collagenase를 포함하는 비커와 미디어 비커을 교환. </li><li> 즉시 세정 후 최대 15 분 20 ML / 분의 유량에서 순환 루프에서 collagenase로 소화를 시작합니다. collagenase의 배치가 많은 번호에 따라 다를 수 있기 때문에, 소화의 양과 시간에 변화 collagenase의 모든 새로운 많은 최적화해야합니다. Collagenase 또한 칼슘 따라 달라집니다. 펌프를 끄고는 플라스크의 B.에 (그림 2B) 플라스크 B에 쓰레기 컨테이너에서 유출 라인을 전송 플라스크에서 버퍼와 가스 라인을 전환합니다. </li><li> 펌프를 중지 카테 테르를 제거 20-30 명의 ML 버퍼 1을 포함하는 요리에 간장을 전송. </li><li> 다시 껍질 Glisson의 간 캡슐과 세포를 흔들어액체의 아웃. </li><li> 액체가 세포 물질과 불투명 해짐에 따라, 30 μm의 메쉬를 통해 그리고 50 ML 원뿔에 얼음 여과 다음 100 μm의 메쉬를 통해 세포를 전송합니다. </li><li> 간 더 버퍼 1을 추가하고 메쉬 필터와 원뿔에 액체를 전송, 간 매트릭스에서 세포를 흔들어 계속 진행합니다. </li><li> 반복 단계 3.7-3.9 더 이상 세포 간의 합리 잡고 dislodged 수 없습니다 때까지. </li></ol> 4. Hepatocyte 및 SEC 정화 <ol><li> 3 분 150 XG에 세포를 포함하는 50 ML conicals을 원심 분리기. 펠렛 hepatocytes 수 있습니다. </li><li> 얼음 신선한 50 ML conicals에 비 parenchymal 세포를 포함하는 액체 분획을 전송합니다. </li><li> hepatocytes은 버퍼 3의 펠렛을 resuspending 및 단계 4.1 및 4.2 이상을 세 번 반복해야 씻으십시오. </li><li> 세척의 끝에, 산탄들이 ≥ 97% 순수 hepatocytes 있습니다. 초를 얻으려면, 튜브 C의 모든 원심 분리기10 분 200 XG에 (HSCs, 초, 그리고 KCs 및 일부 작은 hepatocytes를 포함)의 표면에 뜨는 풀링 ontaining. 4 ° C. </li><li> 버퍼를 대기음 4에서 5 ML RPMI / BSA의 모든 산탄 ° C.를 resuspend </li><li> 이 튜브로 함께 세포를 풀 35 ML의 볼륨을 최대 RPMI / BSA를 추가합니다. </li><li> 3 분 100 XG에 conicals을 원심. </li><li> 액체와 깨끗한 50 ML 원뿔로 전송의 상위 25 ML를 수집합니다. </li><li> 나머지 10 ML 미디어의 펠렛을 Resuspend 다시 25 차가운 RPMI / BSA의 ML, 3 분 100 XG에 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 3.8 및 3.9 한 번 더 세포 펠렛과 낮은 열 ML 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 펠렛 초, KCs, 그리고 10 분 200 XG에서 HSCs에 supernatents을 원심. 4 ° C. </li><li> 얼음 PBS 20 ML 25 % Percoll을 포함하는 세 50 ML 튜브를 준비합니다. 각 튜브 15 ML 50 % Percoll과 밑받침. </li><li> 30 ML RPMI / BSA의 총 볼륨에있는 세포 알약을 Resuspend. </li><li> 조심스럽게 중첩 EAC4 20 분 900 XG에서 세포 원심 분리기 10 ML과 H 그라데이션 ° C. </li><li> 초 및 KCs은 매우 낙관적인 밀도를 닫고 50분의 25 %의 인터페이스에 있습니다했습니다. HSCs는 / 미디어 지질 저장 세포로 자신의 높은 부력으로 인해 인터페이스를 25 %로 일반적으로하고 있습니다. 남아있는 hepatocytes과 혈액 세포는 낮은 buoyancies을 가지고 pelleted 있습니다. 50분의 25 % 인터페이스 상단의 아래에서 대기음이 자료를 폐기하십시오. </li><li> 50분의 25 %의 인터페이스와 차가운 RPMI와 신선한 원뿔로 전송에서 세포를 수집합니다. 최종 볼륨 Percoll을 희석하기 위해 ~ 40 ML해야합니다. </li><li> 4 10 분 350 XG에있는 원뿔을 원심 ° C를 펠렛 세포 수 있습니다. </li><li> ~ 10 ML 미리 예열 RPMI은 산성 입힌 유리 페트리 접시에 100 U / ML Penicillin/100 G / ML 스트렙토 마이신과 장소 세포를 포함하거나 접시를 crystallizing에있는 세포를 Resuspend. </li><li> 15 분 대한 세포를 품어. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 인치 </li><li> 록 또는 소용돌이 접시 조금다음 뜨는에서 초를 수집합니다. KCs 훨씬 더 빠르게 초보다 유리 준수합니다. 또한, 초는 자기 구슬로 복합 백신 CD31 또는 anti-Stabilin2/HARE 항체를 사용 immunopurification로 KCs 분리 수 있습니다. </li><li> 생존과 세포 숫자는 hemacytometer를 사용하여 trypan 파랑 제외 또는 자동 세포 계수기를 이용하여 평가 수 있습니다. </li><li> 문화 37 fibronectin - 코팅 플라스틱 접시에있는 초 ° C 5 % CO 2, 40 NG / ML VEGF, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신 또는 hepatocyte 에어컨 미디어 RPMI/0.25 %의 BSA. </li><li> Hepatocytes, KCs, 그리고 초는 감마 카운터를 사용하여 표시된 자료의 국제화를위한 평가하고 이러한 culturing 방법을 사용하여 (찬란 표시하는 경우) 전체 세포 단백질이나 현미경으로 정규화 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : Hepatocyte 정화는 ≥ 97%하고 SEC 정화는 typic입니다앨리 ≥이 방법을 사용 95%. 복강, 포털 정맥의 cannulation, 그리고 간 창백의 절단은 모두 좋은 결과를 분 이내에 발생한다. HARE/Stabilin-2 간 초의 특정 수용체​​이며 다른 간 세포 유형에 표현되지 않습니다. 이 샘플에서는 hepatocytes와 초 모두 세포 lysates 5 % SDS - PAGE로 분리되었고 Stabilin - 2의 두 isoforms (그림 3)에 대한 단클론 항체와 탐지. 혈액 흐름에 주입 Unfractionated 헤파린은 간 16 지워집니다. 통관은 주로 hepatocytes 및 KCs 17 대조적으로 간 초에 의해 수행됩니다. Stabilin-2/HARE 수용체는 바인딩과 초 18 헤파린 물질이 주요 통관 수용체이다. 여기에 우리의 예제에서, 우리는 GlcNAc / NS의 카르복 그룹에 비오틴 태그 헤파린을 표시. 비오틴은 보호해주는 내면 헤파린의 검출을위한 iodinated streptavidin과 함께 복합했습니다eoglycan. 분류 헤파린의 주입 30 분 후 분사 우리가 장기 헤파린의이 양식을 internalize있는 모니터 수 과다로 따라갔다. 이 짧은 시간 간격에서 간은 기본 통관 기관 (그림 4)이다. 좀 더 명확하게 셀 유형 통관에 대한 책임있는 이해하기 위해서, 우리는 0.05 %의 BSA와 보충 RPMI 미디어 I - SA - B - C 형 간염 125 추가하고 20 분 간을 통해 순환 수있었습니다. collagenase의 소화와 세포 정화에 따라 레이블 헤파린의 대부분은 hepatocytes (그림 5)에 대조적으로 초에 의해 내면됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 기본 아키텍처 간. 초는 sinusoids의 벽을 형성하고 일반적 (동아리의 작은 클러스터) fenestrated 있습니다. 별 모양의 세포 (HSCs)는 Kupffer C 달리 Disse의 공간에서 발견일반적으로 sinusoids의 microvasculature에 존재 ells (KCs). Hepatocytes는 Disse의 공간의 반대편을 차지하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 재관류 장치의 도식. A) 간 sinusoids의 세정 / 세척하는 동안 장치의 설정. TBS는 1 L 플라스크에 있습니다. B) collagenase와 함께 ~ 60 ML 버퍼 2를 포함하는 125 ML의 플라스크는 폐쇄 회로에 간 소화하는 데 사용됩니다. 유출물 라인도 고무 마개에 노치 컷을 통해 폐기물 컨테이너에서 플라스크를 B로 변경됩니다. 산소 라인은 거품 방지하는 collagenase (플라스크 B를) 포함하는 버퍼로 침수되지 않습니다. 각 플라스크에 stoppers가 유출 라인의 효율적인 전송을 허용하고 산소 가스의 증가 압력을 방지하기 위해 노치 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. </strong&gt; Hepatocyte 준비는 초와 오염되지 않습니다. 정화 hepatocytes의 배치 (레인 1)과 초 (레인 2)에서 세포 lysates의 동등한 양의 5 % SDS - PAGE로 분리하고 nitrocellulose에 blotted했다. HARE/Stabilin-2 두 isoforms (315 kDa 및 190 kDa)에 대한 구체적인 단클론 항체 # 30 lysates을 알아내기 위해 사용되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 장기 표시 헤파린의 유통. 쥐 30 분 125 I - SA - B - C 형 간염 대기와 측면 꼬리 정맥을 통해 주입 후 exsanguinated했다. 혈액은 인공적으로 어떤 장기 높은 수치를 제공하지 않도록 수집했습니다. 각 기관의 분 (CPM) 당 계산이 g에서 기관의 무게에 대한 표준되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. hepatocytes 및 초에 표시 헤파린의 금액입니다. RPM125 포함 나 미디어는 I - SA - B - C 형 간염은 collagenase의 소화와 세포 정화 다음 20 분 간 손상을 통해 순환 수했습니다. hepatocyte 및 SEC 세포 단백질 lysates 동등한 양의는 브래드 포드 분석과 계량 및 감마 카운터로 집계되었다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. Kupffer 세포는 유리에 부착하여 초부터 구분됩니다. 세포는 산성 입힌 유리 crystallizing 접시에 배치하고 ° C 5 % CO 2 37 15 분 준수 허용되었다. 비 준수 세포를 포함하는 supernatent는 부드럽게 swirled 및 원심 튜브에 배치되었다. 유리에 모두 준수 세포 (레인 1)에서와 비 준수 전지 (레인 2)에서 Lysates는 8% SDS - PAGE로 구분 blotted 및 Kupffer 세포에 대한 구체적인 CD163에 대한 항체로 탐지되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="그림 7"/> fibronectin 코팅 플라스틱에 도금 그림 7. 초는 6 - 잘 요리는 0.1 % BSA와 보충 RPMI에서 하룻밤 incubated되었습니다. 위상 콘트라스트 이미지는 (A) 100x와 (B) 200x 배율에서 찍은되었습니다.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

isoflurane 증기 유도의 무의식이 우리의 연구에 대한 선호하는 방법입니다 걸려있는 드롭 방식으로 쥐 마취. 기화기 또한 챔버 밖의 동물을 유지하기 위해 면봉과 주사기 대신 사용하지만 수술 절차가 필요하지 않으므로 재빨리 수 있습니다. 폴리에틸렌 글리콜은 증기 압력과 증발 속도를 감소 isoflurane에 추가됩니다. 너무 isoflurane 수증기가 너무 빨리 죽음을 유발합니다. 간이 cannulated와 TBS, 간장 풀링 혈액 응고와 함께 5 월 blanched 및 collagenase와 sinusoids과 소화의 효율적인 세탁을 방지하기 전에 동물이 죽으면. 헤파린의 또한 항응고제로서 유용하게 사용될 수 있지만 우리의 탐사선으로 표시 헤파린 사용되기 때문에 이러한 연구에 사용되지 않습니다. Gey의 버퍼 생리 식염수 (GBSS)는 종종 초의 정화를 위해 다른 실험실에 의해 대체됩니다. 그것은 SEC 정화, C 형 간염에 대한 유용 동안atocytes 1-3 GBSS뿐만 아니라 버퍼를 용납하지 않으며 viabilities 거의 같은 높이 없습니다. endocytosis를 측정하면, 그것은 기관과 hepatocytes를 정화의 배경 수준을 측정하는 것이 좋습니다. 이 방법은 collagenase와 함께 간 재관류에 따라 초의 효율적인 정화의 두 가지 중 하나입니다. 다른 방법은 elutriation의 원심 분리 19 대신 Percoll 기울기에 의해 비 parenchymal 세포를 분리합니다. Percoll의 그라디언트를 통해 elutriation를 사용하는 장점은 약간 높은 세포 viabilities와 숫자입니다. 단점은 elutriation의 원심 분리는 전문 회전자, 전용 원심 분리기, 그리고 달러 수만명의 비용이 함께 연동 펌프를 필요로한다는 것입니다. 이 방법은 많은 실험실에서 표준 냉동 테이블 상단의 원심 분리기와 연동 펌프의 사용을 필요로합니다. 선택적 부착하여 초와 KCs의 분리는 표준 방법입니다20-22. 그것이 초는 유리와 플라스틱을 준수합니다 사실이지만, 핵심 포인트 37에서 15 분 배양보다는 더 이상 함께 산 - 씻은 깨끗한 유리를 사용하는 것입니다 ° C 5 % CO 2. KCs는 항상 초보다 준수하고, 그것은 부드럽게 느슨하게 연결된되고있는 남아있는 초를 추출 미디어 KCs 씻는 것이 좋습니다. Pronase 및 기타 프로 테아제도 세포 viabilities 향상이 프로​​토콜의 collagenase의 소화 단계에서 생략됩니다. 프로 테아제는 세포외 수용체를 소화하고 최종 정화 단계에서 세포 유착을 억제 수도 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 어플 리케이션의 다양한 있습니다. 우리가 헤파린가 처음 기본 hepatocytes를 얻기 위해 간을 통과, 재관류에 촬영되는 최종 결과를 보여주지만, KC, 초, 그리고 HSCs는 신진 대사 통로, immunoregulation, 청소 활동, 및 기타 관련된 연구 여러 유용할 수 있습니다 생리 studi알면서도. 이 절차의 가장 어려운 부분은 포털 정맥에서 카테 테르 전표를하지 않고 좋은 cannulation, 간장의 소화와 간 처리됩니다.

<ul><li> 버퍼 1 : 142 MM NaCl 6.7 MM KCl, 10 MM HEPES, 1.5 % BSA, pH를 7.4 </li><li> 버퍼 2 (재관류 버퍼) : 67.0 MM NaCl, 6.7 MM KCl, 4.8 MM CaCl 2 - H2O, 101.0 MM의 HEPES, 1.5 % BSA, pH를 7.4. </li><li> 버퍼 3 : 137 MM NaCl, 4.7 KCl MM 0.7 MM MgSO 4, 1.2 MM CaCl 2 - 2 시간 2 O, 10 MM HEPES, 1.5 % BSA, pH를 7.4 </li><li> RPMI / BSA : RPMI에서 15g / L BSA </li><li> 트리스 버퍼 염분 (TBS) : 154 MM NaCl, 10 MM Trizma 자료의 소​​금. </li><li> Collagenase : 시그마 - 올드 리치에서 Roche는에서 Collagenase (# 11088785103) Collagenase 입력 생물 워싱턴이나 Collagenase 전부터 (# LS004691) (# C0130) 또는 IA (# C9891). </li></ul> 모든 소금은 시그마 - 올드 리치 출신 <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 모델 / 카탈로그 # </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 20L 물 목욕 </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> 물은 45 ° C 냉각 보상하는 것입니다 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 튜브 안에. </td></tr><tr><td> 연동 펌프 </td><td> 콜 - Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex 시리즈 </td></tr><tr><td> 냉장 원심 분리기 </td><td> Sorvall </td><td> 전설 XTR </td><td></td></tr><tr><td> 카테 테르 </td><td> BD Biosciences </td><td> 381,444 </td><td></td></tr><tr><td> Dessicator 챔버 </td><td> 어부 </td><td> 08595E </td><td> 내부 플레이트를 사용하여 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 시그마 </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> SeraCare </td><td> AP - 4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 μm의 메쉬 </td><td> 스펙트럼 연구소 </td><td> 146,488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 μm의 메쉬 </td><td> 스펙트럼 연구소 </td><td> 146,506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,870 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 </td><td> 스펙트럼 연구소의 </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

간은 포유류의 신체의 대사 중심이며, 혈액에 대한 필터 역할을합니다. 간장의 기본 아키텍처 간 질량 이상 85%가 hepatocytes로 구성되어 있으며, 세포 대량의 나머지 15%가 Kupffer 세포 (KCs), 별 모양의 세포 (HSCs)으로 구성되어있는 그림 1에서 그림, 그리고 sinusoidal 내피 세포 (초). 초 간 내의 혈관 벽을 형성하고 세포질 내에 fenestrae라는 전문 형태가 포함되어 있습니다. 세포질의 Fenestration은 초 행동 체로 가장 chylomicrons, chylomicron 잔해가 흩어져 및 macromolecules 아니지만 세포가, hepatocytes 및 HSCs 1 (그림으로 통과하는 있도록 세포 내의 구멍의 모양 (~ 100 μm의)입니다 1). 지하 막의 부족으로 인해, 초 및 hepatocytes 사이의 간격이 Disse의 공간을 형성합니다. HSCs이 공간을 점유하고 규제와 나는에 대한 응답으로 두드러진 역할을njury, retinoic 산성과 간 2 immunoregulation의 저장 용량을 확장합니다. 초 자신의 세포 표면 3 스캐빈저 수용체의 배열을 표시하는 신체의 가장 endocytically 활성 세포들이다. 이들은 SR - A, Stabilin - 1 Stabilin - 2를 포함합니다. 큰 입자와 세포 부스러기가 KCs 4로 (phagocytosed) endocytosed이며, 반면에 일반적으로, 버퍼 단계에서 작은 콜로이드 입자 이하 230 NM과 macromolecules은 초에 의해 촬영되었습니다. 따라서, 이러한 혈액의 glycosaminoglycans 등 세포외 물질의 대량 통관이 건강과 초 5,6의 endocytic 기능에 크게 의존하고있다. 예를 들어, 혈액 hyaluronan 수준의 증가는 온화에서 더 심한 형태의 7에 이르기까지 간질환을 나타내는 것입니다. 하나의 리포트 8을 제외하고, 존재에 불후의 SEC 셀 라인은 없습니다. 심지어는이 불후의 세포 라인 드 differenti입니다그것이 주 초 (우리의 데이터가 표시되지 않음)에 존재하는 청소 수용체를 표현하지 않는다는에서 ated. 모든 세포 생물 학적 연구는 동물에서 얻은 신선한 기본 세포에서 수행되어야합니다. 불행하게도, 초는 표준 문화 조건 dedifferentiate과 동물로부터 격리시 1 또는 2 일 이내에 사용해야합니다. 초의 분화는 Stabilin - 2 또는 토끼 수용체 9, CD31, 그리고 세포질 fenestration 1의 존재의 표현에 의해 표시됩니다. 초의 분화는 문화 매체에서 VEGF의 추가 또는 hepatocyte 에어컨 매체 10,11에 culturing 세포에 의해 확장될 수 있습니다. 이 보고서에서는, 우리는 SEC 특정 Stabilin - 2 수용체에 대한 hyaluronan을위한 라디오 레이블 헤파린을 사용하여 손상 장기에서 초의 endocytic 활동을 보여줄 것입니다. 그러면 endocytosis를 측정 per​​fused 간장에서 hepatocytes 및 초 정화됩니다.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

19.0K 조회수.  University of Nebraska, Lincoln. 간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

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Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

연구

생화학

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

쥐 포탈 섬유아 세포의 분리에 의한<em&gt; 현장에서</em&gt; 간 재관류

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

생물학

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

생쥐의 생착 간 스페로이드에 대한 Noninvasive Intraocular In Vivo 이미징

In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until now, optical imaging of the liver in situ is possible by intravital imaging, which offers high-resolution imaging at the cellular level but cannot be performed multiple times and, therefore, longitudinally in the same animal. Noninvasive imaging methods, such as bioluminescence, allow repeated imaging sessions on the same animal but do not achieve cell resolution. To address this methodology gap, we have developed a platform for noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. In the workflow described in this study, primary mouse liver spheroids are generated in vitro and transplanted into the anterior chamber of the eye of recipient mice, where they engraft on the iris. The cornea acts as a natural body window through which we can image the engrafted spheroids by conventional confocal microscopy. The spheroids survive for months in the eye, during which the cells can be studied in contexts of health and disease, as well as being monitored in response to different stimuli over repeated imaging sessions using appropriate fluorescent probes. In this protocol, we provide a breakdown of the necessary steps to implement this imaging system and explain how to best harness its potential.

저자 스포트라이트: 비침습적 간 스페로이드 연구를 위한 마우스 안구 챔버 활용

Here, we describe a platform that allows noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. The workflow spans from generating spheroids from primary liver cells to transplantation into the mouse eye and in vivo imaging at cellular resolution by confocal microscopy.

쥐 눈의 전방에 생착된 간 회전 타원체의 In vivo 이미징

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until ...

간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

요약

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이 비디오의 챕터

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

쥐 포탈 섬유아 세포의 분리에 의한

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

쥐 눈의 전방에 생착된 간 회전 타원체의 In vivo 이미징

쥐 눈의 전방에 생착된 간 회전 타원체의 In vivo 이미징