마우스 원발성 간세포는 간 연구에서 중요하다. 특히 포도당 대사 및 간 약물 검사. 격리 과정은 시간이 많이 걸리고 에너지 비용이 많이 들 수 있습니다.
이러한 프로토콜은 마우스 원발성 간세포를 분리하는 효율적인 방법을 제공할 수 있다. 시간과 노동 친화적입니다. 모든 지역에서 상업적으로 이용 가능한 몇 가지 단계가 필요합니다.
연동 펌프를 사용하여 분당 4 mL의 속도로 이중 증류수를 5 분 동안 예열하여 펌핑을 시작하십시오. 그런 다음 펌핑 튜브를 물에서 예열 된 관류 매체로 바꿉니다. 물과 관류 매체 사이의 기포를 모니터링한다.
시스템을 통한 관류 매체의 흐름을 추적하는 데 도움이 될 것이다. 다음으로 마취된 8주령의 C57 검정 6J 암컷 마우스의 복부를 70%에탄올로 소독한다. 그리고 가위를 사용하여 복부를 열어 간, 문맥 정맥 및 열등한 정맥 카바를 노출시킵니다.
그런 다음 연동 펌프를 중지하십시오. 펌핑 튜브에 물이 아닌 관류 매체가 포함되어 있는지 확인한 후. 24 게이지 카테터를 열등한 정맥 카바에 삽입하십시오.
펌프를 다시 켜고 포털 정맥을 열어줍니다. 관류 매체가 펌핑되는 동안 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석구석에 도달하도록하십시오. 약 삼 ~ 다섯 분 동안 또는 플러시 된 액체가 맑을 때까지 펌핑을 계속하십시오.
다음으로 펌핑 튜브를 관류 배지에서 콜라게나제 디스파제 배지로 변경한다. 그리고 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오. 콜라게나제 디스파제 배지의 모든 25 mL가 고갈될 때까지 펌핑을 계속한다.
다음으로 담낭없이 간 전체를 분리하십시오. 이를 얼음 위의 페트리 접시에 30 mL의 세척 배지에 넣었다. 포셉을 사용하여 간을 조각으로 찢어 원발성 간세포를 용액으로 방출합니다.
이 단계에서, 세척 배지는 방출된 원발성 간세포와 작은 간 조각을 포함하는 흐린 용액으로 변한다. 이 흐린 용액을 70미크론 셀 스트레이너를 통해 여과하고, 얼음 위의 50 mL 튜브에 호당 HBSS 20 mL의 1X에 넣는다. 용액을 튜브를 20회 반전시켜 혼합한다.
다음으로 용액을 원심분리한다. 그런 다음 조직 배양 후드에서 상청액을 흡인하십시오. 펠렛을 30 mL의 차가운 세척 매질로 세척한다.
세포를 원심분리로 다시 한번 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 25 mL의 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 원하는 배양 플레이트에 플레이트하십시오.
실험 설계에 따르면. 도금 후, 분리된 일차 간세포를 1시간씩 단단히 부착하고 12시간 후에 완전히 팽창시켰다. 분리된 간세포에서, 간세포 마커, 예컨대 트랜스티레틴, CD95, ASGR1 및 ASGR2의 mRNA 수준은 간 전체에 비해 유의하게 증가하였다.
대조적으로 면역 세포, 성상 세포 및 내피 세포의 존재는 더 낮았다. CD45, 콜라겐 타입 1 알파 1, 및 내피 세포 2 키나제 2 mRNA 수준의 급격한 감소에 의해 입증된 바와 같이. 이 프로토콜이 다른 간 세포로부터의 간섭을 크게 줄일 수 있음을 시사한다.
도금 후 ASGR1 및 ASGR2 수준은 시간이 지남에 따라 감소했지만 12 시간 시점까지 전체 간과 비교할 수 있습니다. 특히 ASGR1의 경우. 막 결합된 CD81의 발현 수준은 최대 48시간 동안 일관되었다.
비교하여, 톨-유사 수용체 4 발현은 일반적으로 증가하였고, 48시간 후에 생체내 수준보다 더 높아졌다. 인슐린 감수성 검정은 인슐린이 세린 473에서 두 AKT의 인산화를 유의하게 촉진한다는 것을 입증하였다. 및 포크헤드 박스(01)를 세린(256)에서, 간세포에서.
인슐린에 대한 원발성 간세포의 민감성을 나타낸다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 단백질 수준은 글루카곤 처리 후 유의하게 증가하였다. 글루코스 생산 경로가 활성화되었음을 시사한다.
이러한 활성화는 증가된 글루코스 생산에 의해 추가로 확인되었다. 그리고 Forskolin + IBMX와 같은 다른 포도당 생산 자극기와 함께. 이 프로토콜은 마우스 원발성 간세포를 이용한 연구에 시간과 에너지를 모두 절약할 수 있습니다.
이 프로토콜에 따라, 가상의 글루코스 대사 및 제약 바이오마커 분석과 같은 관련 실험이 수행될 수 있다.
