이 방법은 우리가 생체 내에서 세포 외 소포의 역할에 관한 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다, 우리에게 지역 조직 미세 환경을 대표하는 소포의 소스를 제공함으로써. 조직 milieu 내의 세포 외 소포의 연구는 세포 외 소포의 생리적 역할과 생체 내의 병리학 적 과정의 변경에 대한 우리의 이해를 더 발전시킬 수 있습니다. 정맥의 작은 크기로 조작을 어렵게 하기 때문에 포털 정맥 수분의 시각적 데모가 도움이 됩니다.
이시구로 가오리 박사와의 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 아이린 얀 (Irene Yan)이 될 것입니다. 절차를 시작하기 전에 마취 된 마우스의 사지를 확보하고 주사기 펌프 튜브 의 자유 끝에 설정 된 날개 달린 혈액 수집의 23 게이지 바늘을 연결합니다. 마우스의 복부 피부를 70%에탄올과 알코올 패드로 청소하고 가위를 사용하여 가슴 앞쪽에서 골반 뼈까지 마우스를 열어 내부 장기를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
면 기울어진 어플리케이터를 사용하여 내장을 복강의 오른쪽으로 부드럽게 이동하여 포털 정맥과 열등한 베나 카바를 노출하고 곡선 포셉을 사용하여 포털 정맥 아래에 실을 배치합니다. 봉합사에 매듭을 느슨하게 묶어 캐뉼레이션 후 치칭을 준비하고 용액이 캐뉼라 바늘 팁에 도달 할 때까지 40섭씨 HBSS로 캐뉼라를 채웁니다. 합자 아래 5~10밀리미터 의 포털 정맥에 캐뉼라를 삽입하고 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다.
분당 1~2밀리리터로 주입을 시작합니다. 캐뉼라가 올바르게 놓이면 간이 희미해지기 시작합니다. 열등한 베나 카바를 자르고 간 내의 과도한 액체가 배수되도록 합니다.
HBSS의 전체 50 밀리리터가 다음 5 분 동안 간을 통해 침투 될 때까지 천천히 분당 8 밀리리터로 유량을 증가시면. HBSS가 다 떨어지기 직전에, 난투 비커에 40도 의 신선한 준비 된 콜라겐아제 4 용액을 변경하고 5 초 간격으로 열등한 베나 카바에 일시적인 압력을 적용하기 위해 집게를 사용하여 간이 팽창하고 조직 소화 및 해리를 돕습니다. 소화가 진행됨에 따라 간은 부풀어 서 흰색이 됩니다.
면 팁 어플리케이터로 부드러운 프로빙 후 유해가 우울하면 펌프를 멈추고 캐뉼라를 제거하십시오. 간에서 담낭을 제거하고 담낭 조직을 찢지 않도록 주의하고 깨끗한 가위와 집게를 사용하여 간을 PBS의 멸균 10 센티미터 문화 요리로 수확하십시오. 부드러운 세척 후, 신선한 콜라게나아제 4 가지 용액을 포함하는 새로운 10 센티미터 배양 접시로 간을 옮기고 두 개의 깨끗한 집게를 사용하여 간 조직에서 세포를 부드럽게 분해하는 동안 간을 찢어 냅니다.
전체 장기가 단편화되었을 때, 소화되지 않은 간 조각이 흔들릴 때까지 조직 슬러리를 세트리술하는 3 밀리리터 주사기를 사용합니다. 결과 세포 용액을 70 미크론 나일론 메쉬 스트레이너를 50 밀리리터 원내 튜브에 붓고 HBSS로 접시를 세척하여 남은 세포를 수집합니다. 단일 셀 서스펜션으로 세척을 풀과 원심 분리에 의해 간구를 제거합니다.
그런 다음 새로운 50 밀리리터 튜브로 상수체를 전송합니다. 다른 세포를 제거하려면 새로운 50 밀리리터 원판 튜브로 전송하기 전에 상신분리합니다. 다른 원심분리기로 죽은 세포를 제거하고 상체를 둥근 바닥 튜브로 이송하여 세포 이물질과 골재를 제거합니다.
이제 상체를 폴리카보네이트 울트라 원심분리기 튜브로 옮기고 PBS의 약 20 밀리리터에서 펠릿을 두 번째 및 최종 초원심분리에 재차질한다. 그런 다음 소포를 즉시 분석하지 않을 경우 영하 80도 저장에 대한 PBS의 1 밀리리터에서 세포 외 나노 소포 펠릿을 다시 중단합니다. 단일 마우스 간으로부터, 이 방법은 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 밀리리터당 12분의 1에 3.46배 10의 평균으로 1.74에서 4배 10에 이르는 조직 세포외 소포 농도를 산출한다.
고립 된 간 조직 세포 외 소포의 평균 크기는 157.7 나노미터이며 나노 입자 추적 분석에 의해 100에서 600 나노미터에 이르는 144.5 나노미터 및 세포 외 소포 크기입니다. 이 방법을 사용하여 격리된 세포외 소포는 다운스트림 애플리케이션에 적합하며, 추가 특성화에는 전자현미경검사또는 표면 마커 또는 내용의 분석에 의한 형태학적 평가를 포함할 수 있다.
