우리는 NSF 상을 CMMI - 1000724의 재정 지원을 인정합니다.

1A. 실리콘에 대한 기본 Monolayer 형성 <ol><li> 1cm 2 기판, 먼지로 실리콘 웨이퍼를 잘라 물을 여과 에탄올로 린스. </li><li> 75 º C.에 나노 스트립이 들어있는 유리 그릇에있는 실리콘 기판을 잠수함이 잠수하여 유기 오염 물질을 제거 십오분 후 deionized, 여과 물을 각 기판 린스. </li><li> 기본 산화 층을 제거하는 : 5 % HF 용액 (HF는 매우 위험한 재료 경고)에있는 각 기판을 놓습니다. 5 분 질소로 산화없는 실리콘을 건조한 후 </li><li> 바로 잠수함 chlorobenzene에서 포화 PCL 5이 ML을 포함하는 섬광 약병의 각 산화물 무료 실리콘 조각, 염소화 기판을 생산합니다. 이 솔루션은 0.2 μm의로 필터링해야합니다. </li><li> 각 유리병 위에 유리 콘덴서를 조립하고 heatblock 그들을 장소는 112 ° C 한 시간 만이라도을 설정합니다. </li><li> 반응이 완료되면 튜브는 각 surfa를 냉각하고 린스합시다필터링 질소하에 chlorobenzene 건조와 CE. </li><li> propenyl - 종료 기판 형태로, propenyl 마그네슘 염화 4 ML을 포함하는 압력 약병의 각 염소화 실리콘 표면에 놓으십시오. 130에서 heatblock의 각 압력 약병 장소 ° C 24 시간 동안. </li><li> heatblock 밖으로 각각의 압력 약병을 가지고 식지. </li><li> DCM과 에탄올과 함께 신속하게 각각의 표면을 씻어 여과 질소에 따라 건조. </li></ol> 1B. 게르마늄에 대한 기본 Monolayer 형성 <ol><li> , 1cm2 기판에 게르마늄 웨이퍼를 자르고 먼지와 물, 에탄올 여과와 린스. </li><li> 20 분 유리 접시가 들어있는 아세톤의 표면을 잠수함이 잠수하여 유기 오염 물질을 제거 </li><li> 15 분 동안 10 % HCL 용액의 각 표면에 놓으십시오. 이 프로세스는 동시에 원시 산화 층을 제거하고 표면을 chlorinates. 5 분 질소와 기판을 건조 후. </li><li> octyl - 종료 기판, 괞찮아을 형성CE는 octyl 마그네슘 염화 4 ML (2 MM)이있는 압력 약병에 게르마늄 표면을 각각 염소화. ° C 48 시간 동안 130에서 heatblock의 각 압력 병을 놓습니다. </li><li> heatblock 밖으로 각각의 압력 약병을 가지고 룸 온도 식지. </li><li> DCM과 에탄올과 함께 신속하게 각각의 표면을 씻어 여과 질소에 따라 건조. </li></ol> 2. 실리콘과 게르마늄의 보건국 기판 작용화 <ol><li> 사염화탄소에 필터링 0.1 M NHS - diazirine 솔루션을 준비합니다. 경고 : 최소로 가벼운 노출을 유지. </li><li> 메틸 종료 표면에 Pipet 솔루션의 몇 방울을. 전체 표면에 걸쳐 확산 솔루션을 허용합니다. </li><li> UV 램프 (☐ = 254 nm의, 0.74 인치 4400/cm2)에서 표면에 놓으십시오. 표면은 30 분 동안 자외선에 따라 반응하도록 허용 후 표면에 더 많은 보건국 - diazirine을 추가하고 추가로 30 분 동안 진행 반응을 보자. </li><li> 보건국의 수정을 씻어DCM과 에탄올과 여과 질소에 따라 건조와 urfaces. </li></ol> 3. 작은 분자 작용화 <ol><li> 반응 보건국 - 수정 20 MM tert - 부틸 carbamoyl 실온에서 두 시간 동안 dichloromethane (DCM)에서 (Boc -) 에틸렌 솔루션 기판합니다. </li><li> 반응 후, DCM 및 에탄올과 Boc - 수정된 기판 헹굼. </li><li> 상온에서 한 시간 만이라도 DCM에서 25% trifluoroacetic 산성 (TFA)를 사용하여 Boc 수정 기판을 Deprotect. </li><li> 필터링 질소 하에서 물과 건조의 결과 DCM과 표면, 에탄올과 10 % (W / V) 탄산수 소 칼륨을 씻어. </li><li> 원소 조성을 결정하기 위해 XPS하여 모든 표면을 분석할 수 있습니다. </li></ol> 4. 산성 폴리 우레탄 아크릴 레이트 스탬프 (PUA) 준비 <ol><li> 점도를 줄이기 위해 trimethylolpropane ethoxylate triacrylate의 B와 30 % 아크릴 레이트를 희석. 반응 혼합물 (그림에 photoinitiators C와 D를 추가ure 6). </li><li> dioxane (10 ML)에 4N HCL 솔루션 나트륨 2 mercaptoethanesulfonate을 (0.2 g, 1.22 mmol)을 추가하고 2 분 동안 상온에서 저어. </li><li> 멋진 유리 필터를 통해 다음 dioxane의 2 mercaptoethanesulfonic 산의 명확한 솔루션을 여유 필터 0.2 μ m PTFE 막 주사기를 통해 먼저 나트륨 염화물을 필터링합니다. </li><li> 감소 압력 하에서 dioxane을 증발 </li><li> 50 상온에서 폴리 우레탄 - 아크릴 레이트 prepolymeric 혼합 2 ML과 다음 진공에서 발생 sulfonic 산을 반응 ° C. 완전히 갇혀있는 공기 방울의 혼합물을 무료로해야합니다. </li><li> 실내 온도 결과 솔루션을 쿨 두 유리 현미경 슬라이드 또는 실온에서 2 시간 동안 자외선에 노출하여 유리 슬라이드와 마스터 사이의 중합. </li><li> 중합 후, 조심스럽게 마스터 해제 스탬프 껍질과 에탄올과 물로 우표를 씻고 여과 nitroge와 건조N. </li></ol> 5. 촉매 인쇄 및 SEM / AFM 분석 <ol><li> 그들을 지탱해없이 외부 하중과 하나 분간 실온에서 보건국 - 수정 기판 위에 해당하는 폴리 우레탄 - 아크릴 레이트 스탬프를 배치합니다. </li><li> 반응 후, 스탬프와 기판을 분리. </li><li> 에탄올, 물, 그리고 여과 후 건조 질소로 에탄올과 기판을 씻어. </li><li> 에탄올, 물, 그리고 여과 후 건조 질소로 에탄올과 함께 우표를 씻어. </li><li> 다음 응용 프로그램을하기 전에 실온에서 우표 보관하십시오. </li><li> 접촉 모드 측면 원자 힘 microsopy (AFM)을 사용하여 전자 현미경 (SEM)을 스캔 생산 패턴을 분석 </li></ol> 6. 단백질 Patterning 및 형광 현미경 <ol><li> 로 씻어서 다음 H20 (1:1) 1 시간을위한 상온에서 후 라이신 - N, N - diacetic 산 (20 ㎜)과 DMF에 잇 3 N (100 ㎜)에서 잠수함 보건국 - 패턴 bifunctional 기판물과 에탄올. </li><li> 상온에서 5 분 50 MM NiSO4 솔루션의 기판을 품어. </li><li> 0 1 시간에 대한 과도한 필터링 GFP 솔루션 (~ 40 μ의 M)에 물과 구속력을 버퍼 (20 MM 낮잠, 250 MM NaCl, 10mM 이미다졸, 산도 7.5)과 잠수함과 chelated 기판을 씻어 ° C. </li><li> 즉시 PBS (산도 7.4)에 의해 다음 바인딩 버퍼와 기판은 린스. </li><li> 0 PBS의 기판은 수산화 유지 ° C 그들은 형광 현미경 분석을위한 준비가 될 때까지. </li></ol> 7. 단백질 Patterning 및 형광 현미경 <ol><li> 물로 씻어서 다음 H 2 1 시간을위한 상온에서 0 (1:1)과 : 라이신 - N, N - diacetic 산 (20 ㎜)과 DMF에 잇 3 N (100 ㎜)에서 잠수함 보건국 - 패턴 bifunctional 기판 와 에탄올. </li><li> 상온에서 5 분 50 MM NiSO 4 용액에 기판을 품어. </li><li> 지나치게 w chelated 기판을 씻어0 1 시간에 대한 필터링 GFP 솔루션 ith 물과 결합 버퍼 (20 MM 낮잠, 250 MM NaCl, 10mM 이미다졸, 산도 7.5)과 잠수함 (~ 40 μm의) ° C. </li><li> 즉시 PBS (산도 7.4)에 의해 다음 바인딩 버퍼와 기판은 린스. </li><li> 0 PBS의 기판은 수산화 유지 ° C 그들은 형광 현미경 분석을위한 준비가 될 때까지. </li></ol> 8. 대표 결과 : 소프트 리소그래피 촉매 나노 patterning의 예제는 그림 7에 표시됩니다. 접근 방식은 orthogonally ...와 비슷하지 않은 화학 및 생물 학적 moieties과 기능화 수 있습니다 산화물 무료 실리콘과 게르마늄에 chemoselective 패턴을 만듭니다. 보건국 - functioanlized 기판 및 촉매 패턴 스탬프 사이의 반응이 활성화 보건국의 패턴 기판 bifunctional 베어링 지역 및 무료 carboxylic 산을 항복, 등각 접촉 지역에서 보건국의 moieties의 가수 분해에 이르게한다. diffus으로 인해우리 방식의 이온 무료 자연, 우리는 석판술의 가까운 해상도를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 그림 7은 균일하게 전체 실리콘 기판 표면에 걸쳐 재현되었습니다 125 nm의 기능을 보여줍니다. 현저하게, 촉매 우표는 효율성을 잃지 않고 여러 번 활용할 수 있습니다. biomolecules과 무늬 반도체 Chemoselective 작용화가 감지, 진단 및 연구 분석 분야의 애플 리케이션을위한 고도의 선택적 생물 학적 기판 전통적인 전자 자료를 통합의 전망이 열립니다. 이러한 작용화의 예제는 보건국 - 패턴 실리콘이 선택적으로 단백질 분자로 작용했다 그림 8에 표시됩니다. 활성화 무료 carboxylic 산의 차등 reactivities을 악용함으로써, 우리는 먼저 보건국 - 기능화 지역 nitrilotriacetic 산성 - 종료 (NTA) heterobifunctional linkers를 붙인 후 그 결과 사용hexa - 히스티딘 - 태그 GFP. 그림 8B의 선택적 부착을위한 템플릿으로 NTA - 패턴의 표면은 명확하게 GFP - 수정 및 분해 무료 카르복실산 지역 간의 차등 형광 강도를 보여줍니다. 크기와 복제 기능의 형태는 탄소 passivated 표면의 뛰어난 안정성과 스탬핑 방식의 선택도를 확인, 보건국 패턴 표면 (그림 8A)와 GFP - 수정된 표면 (그림 8B) 모두 사이에 일관성이있다. 프로토콜은 그의 - 태그 단백질에 국한되지이며, DNA와 항체를 포함한 패턴의 다른 biomolecules하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig1.jpg" alt="그림 1"/> 촉매 microcontact 인쇄를 나타내는 그림 1. 종합 계획 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 이중 계층 m의 구조GE와시에서 olecular 시스템. 기본 알킬 monolayer는 기판과 안정 GE - C 또는시 - C 유대 관계를 형성하고 기본 표면 열화로부터 보호 화학적 불활성과 가까운 포장 시스템을 제공합니다. (B) 차 overlayer은 기본 보호 레이어와 함께 안정적인 CC 채권을 형성하고 기능 단자를 제공합니다 그룹 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig3.jpg" alt="그림 3"/> 3.시 (A)와 GE에 대한 기본 보호 monolayers의 형성을 나타내는 반응 구조 (B) 그림 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. heterobifunctional carbene 기증자와 기본 보호 monolayer의 화학 작용화 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. 반응 체계는 NHS - 기능화 하위 작은 분자 수정을 보여주는strates 및 해당 XPS 스펙트럼 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 촉매 미리 고분자 혼합, 중합 조건, 그리고 패턴 술폰산 - 수정 스탬프의 SEM 이미지의 구성과 해당 PMMA - 네 마스터 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig7.jpg" alt="그림 7"/> 그림 7. SEM과 산성 도장과 시와 GE에 무늬 SAMs의 AFM 마찰 이미지 <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig8.jpg" alt="그림 8"/> 그림 8 소프트 리소그래피 patterning과 유기 및 생물 학적 분자와 passivated 실리콘 작용화 :..의 SEM 이미지 패턴 보건국 - 수정 기판 B :. GFP 수정 기판의 형광 현미경.

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우리는 공개 아무것도 없어

제시 프로토콜은 보편적으로 간단한 잘 주문한 monolayers을 지원하는 기판에 적용할 수있는 양식 또는 inkless microcontact 인쇄입니다. 이 방법에서는 스탬프 - 고정화 촉매에 해당하는 기능성 그룹을 베어링 표면에 패턴을 전송합니다. 프로세스가 전통과 반응 μCP의 잘 퍼지는 해상도 한계를 표면에 도장에서 잉크 전송에 의존하지 않기 때문에 nanoscale 것은 객체의 일상적인 생산을 허용, obviated입니다. 기본 높은 주문한 분자 시스템의 결합은 산화 손상의 근본적인 반도체의 완전한 보호를 제공합니다. 동시에, 방법은 보조 반응 overlayer을 이용하여 부피가 반응 그룹의 고정을 지원, 함께 시스템 보호 및 작용화 모두를 실현하고 있습니다. 기술은 화학적으로 불활성 primar에 대한 수 있도록 안정적인 탄소 표면 채권의 형성과 함께 시작산화물 형성에 효과적인 장벽 역할을하는 Y의 monolayer. 보조 반응 overlayer의 형성 화학 및 생물 학적 moieties의 다양한 첨부 포인트 역할을 터미널 보건국 기능 그룹을 제공합니다. 이것은 안정적인 bilayered 분자 시스템은 이후의 촉매 μCP 접근 방식을 사용하는 패턴입니다. 본 연구에서 제시 방식은 유기 및 생물 학적 물질의 광범로 patterning 반도체 기판에 대한 일반적인 방법을 제공합니다. 고가의 복잡한 장비없이 패턴 유기 - 반도체 인터페이스를 만들 수있는 능력은 전자, 나노, 생화학 및 생물 물리학 등 분야에서 많은 기회를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 / 모델 </th></tr><tr><td> XPS 분광계 </td><td> Kratos 축 울트라 </td></tr><tr><td> 원자 힘 현미경 </td><td> Veeco D3100 </td></tr><tr><td> SEM - FEG 현미경 </td><td> 황비홍 XL30 </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 자이스 혈구 Axio 영상기 </td></tr><tr><td> Heatblock </td><td> VWR </td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> Boc 에드워즈 </td></tr><tr><td> 물 정화 시스템 </td><td> Millipore </td></tr><tr><td> TESP 실리콘 프로브 </td><td> Veeco </td></tr><tr><td> 규소 </td><td></td></tr><tr><td> 압력 튜브 </td><td> Chemglass </td></tr><tr><td> 진공 매니폴드 </td><td> Chemglass </td></tr><tr><td> UV 램프 </td><td> UVP </td></tr><tr><td> 자료 스탬프 </td><td> 참조 20 18 참조 </td></tr><tr><td> PFTE 주사기 필터 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> 나노 스트립 </td><td> Cyantek </td></tr><tr><td> HCL </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> HF </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Chlorobenzene </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> PCl5 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Propenyl의 마그네슘 염화 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Octyl 마그네슘 염화 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 탄소 TetraChloride </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Boc 보호 에틸렌 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> TFA </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 나트륨 2 - mercaptoethanesulfonate </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> dioxane의 4N HCL 솔루션 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 라이신 - N, N - diacetic 산 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 외 3 N </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> DMF </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> NiSO 4 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> NAP </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 이미다졸 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> PBS </TD&gt; <td> 시그마 </td></tr></tbody></table>

soft lithographic functionalization and patterning oxide-free silicon and germanium

하이브리드 전자 장치의 개발은 효율적인 전자 전송을 허용하고 산화 열화의 기본 기판을 보호 안정적인 인터페이스를 통해 (바이오) 유기 물질 및 무기 반도체의 통합에 큰 부분에 의존하고 있습니다. 그룹 IV 반도체는 효과적으로 유기 및 수성 모두 솔루션 불투과성 장벽 역할을 간단한 알킬 사슬로 구성되어 높은 주문한 자기 조립 monolayers (SAMs)로 보호할 수 있습니다. 간단한 알킬 SAMs 그러나, 불활성 전통 patterning 기술 의무가 없습니다. 반도체에 유기 분자 시스템을 immobilizing에 대한 동기는, 광학 전자 및 기계 기능뿐만 아니라, 화학 및 생물 학적 활동을 제공할 수있는 표면에 새로운 기능을 가르친다하는 것입니다. Microcontact 인쇄 (μ의 CP)는 수많은 표면에 patterning의 SAMs를위한 소프트 리소그래피 기술이다. 1-9은 바보에도 불구하고licity과 융통성은 그 접근 방식은 크게 고귀한 금속 표면에 국한되었으며, 잘 같은 산화물이없는 실리콘과 게르마늄과 같은 기술적으로 중요한 기판에 패턴 전송을위한 개발되지 않았습니다. 이 기법은 탄성체의 기판에 패턴을 전송하는 잉크 확산에 의존하고 있기 때문에 또한, 이러한 전통적인 인쇄의 해상도는 본질적으로 한 μ 근처 M. 10-16로 제한됩니다 전통적인 인쇄 대조적으로, inkless μ의 CP의 patterning은 표면 고정화 기판과 스탬프 바인딩된 촉매 사이에 특정 반응에 의존하고있다. 기술이 잘 퍼지는 SAM 형성에 의존하지 않기 때문에, 그것은 상당히 patternable 표면의 다양성을 확장합니다. 또한, inkless 기술 (&lt;200 nm의) 아주 작은 기능의 복제를 촉진, 분자 확산에 의해 부과된 기능의 크기 제한을 obviates. 17-23 그러나, 지금까지 inkless μ C는P는 주로 저하의 근본적인 표면을 보호하지 patterning 상대적으로 무질서 분자 시스템에 사용되고 있습니다. 여기, 우리는 반응 유기 monolayers와 실리콘과 게르마늄을 passivated patterning을위한 간단하고 신뢰성이 높은 처리량 방법을보고 작은 분자와 단백질 모두 패턴 기판의 선택 작용화를 보여줍니다. 기술은 산화물 무료 실리콘과 게르마늄에 preformed 보건국 반응 bilayered 시스템을 활용합니다. 보건국 잔기는 보건국 활성화 무료 carboxylic 산의 화학적으로 서로 다른 패턴을 생성하는 술폰산 - 변경 아크릴 레이트 스탬프와 패턴 특정 방식으로 분해됩니다. 많은 μ의 CP 기술의 해결에 상당한 제한이 높은 충실도 전송에 필요한 기계적 강성 부족 PDMS 재료를 사용하는 것입니다. 이 제한을 완화하기 위해 우리는 폴리 우레탄 아크릴 레이트 폴리머, 사용할 수있는 비교적 딱딱한 소재를 이용쉽게 다른 유기 moieties로 작용. 우리 patterning 방식은 완전히, 화학 산화 실리콘과 게르마늄을 모두 보호하는 패턴 기능의 모양과 크기를 초과하는 정밀한 제어 기능을 제공하고, 추가로 유기 및 생물 학적 모두 분자로 작용 할 수있는 화학적으로 차별 패턴을 준비 액세스할 수 있습니다. 접근 방식은 일반 및 기타 기술 - 관련 표면에 적용됩니다.

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Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

여기 작은 분자와 단백질과 패턴 기판의 patterning 산화물 무료 실리콘과 게르마늄 반응 유기 monolayers과 입증 작용화에 대한 간단한 방법을 설명합니다. 접근 방식은 완전히, 화학 산화로부터 표면을 보호 기능 형태를 통해 정확한 컨트롤을 제공하며, 화학적으로 차별 패턴을 준비 액세스를 제공합니다.

소프트 리소그래피 작용화 및 Patterning 산화물없는 실리콘과 게르마늄

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K 조회수.  Duke University. 여기 작은 분자와 단백질과 패턴 기판의 patterning 산화물 무료 실리콘과 게르마늄 반응 유기 monolayers과 입증 작용화에 대한 간단한 방법을 설명합니다. 접근 방식은 완전히, 화학 산화로부터 표면을 보호 기능 형태를 통해 정확한 컨트롤을 제공하며, 화학적으로 차별 패턴을 준비 액세스를 제공합니다.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

연구

생체공학

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

뷰-포트 표시 하 고 적외선 빛에 투명 한 플라스틱 미세 소자를 제작 하기 위한 소프트 리소 절차

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

신경 성장 인자의 사업자로 서 다공성 실리콘 필름을 디자인

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics paradigm, especially in biomedical research. Recreating artificial life-like actuation dynamics is crucial for a soft-robotic system. However, the precise control and tuning of actuation behavior still represents one of the main challenges of modern soft robotic systems. This method describes a low-cost, highly scalable, and easy-to-use procedure to fabricate an electrically controllable soft robot with life-like movements that is activated and controlled by the contraction of cardiac muscle tissue on a micropatterned sting ray-like hydrogel scaffold. The use of soft photolithography methods makes it possible to successfully integrate multiple components in the soft robotic system, including micropatterned hydrogel-based scaffolds with carbon nanotubes (CNTs) embedded gelatin methacryloyl (CNT-GelMA), poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), flexible gold (Au) microelectrodes, and cardiac muscle tissue. In particular, the hydrogels alignment and micropattern are designed to mimic the muscle and cartilage structure of the sting ray. The electrically conductive CNT-GelMA hydrogel acts as a cell scaffold that improves the maturation and contraction behavior of cardiomyocytes, while the mechanically robust PEGDA hydrogel provides structural cartilage-like support to the whole soft robot. To overcome the hard and brittle nature of metal-based microelectrodes, we designed a serpentine pattern that has high flexibility and can avoid hampering the beating dynamics of cardiomyocytes. The incorporated flexible Au microelectrodes provide electrical stimulation across the soft robot, making it easier to control the contraction behavior of cardiac tissue.

A bioinspired scaffold is fabricated by a soft photolithography technique using mechanically robust and electrically conductive hydrogels. The micropatterned hydrogels provide directional cardiomyocyte cell alignment, resulting in a tailored direction of actuation. Flexible microelectrodes are also integrated into the scaffold to bring electrical controllability for a self-actuating cardiac tissue.

통합 된 마이크로 전극을 가진 바이오 영감 소프트 로봇

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...