그녀의 지속적인 도​​움을이 작품에서 건설적인 비판과 박사 도나 L. 해먼드, 우리는 공촛점 현미경 / 마우스 발바닥 펀치 생검 immunostaining의 이미징의 초기 표준화 그의 도움 박사 유리 M. Usachev 감사합니다. 이 작품은 NINDS / NIH (NS069898)에서 보조금 및 DPM에 국방 전립선 암 연구 프로그램의학과 (DOD - PCRP - 101096)에서 아이디어 개발 보조금 수상에 의해 투자되었다

1. 동물 재관류 이 연구에서 수행한 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을, 그리고 연구에 동물 사용에 대한 NIH의 지침을 따르 있습니다. <ol><li> 재관류 전날 4 ° C. 1 인산 버퍼의 L (더블 소주 H 2 O, pH를 7.4에서 0.2 M PB) 및 저장을 준비 이것은 재관류 후 - 고정 공정에 사용됩니다. </li><li> 30 초위한 유리 비커에 ddH 2 O의 전자 레인지 200 ML : 재관류 당일 (PFA, 산도 7.4) 0.1M PB에 4.0 %의 paraformaldehyde의 고정력있는 솔루션이 생쥐의 재관류에 대한 충분한 볼륨을 500 ML 준비 아니면 끓는 접​​근까지. 연기 후드 아래에 지속적인 교반과 함께 비커에 세분화된 paraformaldehyde 20 G (PFA)를 추가합니다. 드롭 현명하고 솔루션 나올 때까지 저어 5 N NaOH의 5 ML을 추가합니다. PFA가 완전히 해소되면, 실온 (RT)에 솔루션을 냉각. Slo지속적으로 교반하면서 wly 0.2 M PB 250 ML를 추가합니다. 점차적으로 약한 HCL 솔루션 (6 N 1 N 0.1 N)를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 500 ML 얼음에 진정 최종 볼륨을 조정합니다. 또한 얼음 ddH 2 O와 냉기의 1시 1분을 diluting하여 0.2 M 주식의 0.1 M PB 400 ML을 준비합니다. </li><li> 마취 (27G 바늘로 투여 pentobarbital 나트륨, 80 MG / kg)의 과다 복용의 intraperitonial 주입하여 마우스를 마취. </li><li> 재관류 동안, 0.1 M PB (ddH 2 O로 희석 0.2 M PB 주식 1:1) 및 PFA 150 ML의 50 ML는 마우스 순환에 순차적으로 전달됩니다. PB와 튜브를 작성 한 끝에 23 2분의 1 G 나비 바늘을 고정하여 연동 펌프를 설정합니다. 0.1 M PB가 들어있는 비커에 튜브의 다른 쪽 끝을 젖어. 튜브에 공기 거품이 없다는 것을 보장하기 위해 솔루션의 충분한 양의를 통해 10 ML / 분 연동 펌프의 속도, 그리고 펌프를 설정합니다. </li><li> 때까지 기다립니다nesthetized 마우스는 더 이상 같은 발가락 / 꼬리 핀치와 깜박 반사와 같은 반사 활동을 보여줍니다 않습니다. 퓸 배출 후드 안쪽까지 절개 트레이 복부 측면에 동물을 배치하고 테이프로 발 확보. 70 % 에탄올로 모피를 스프레이. 복부 벽의 ribcage과 최고의 분기를 노출하는 중간선을 따라 피부 절개를 통해하십시오. 그런 다음 ribcage의 기지에 복벽을 통해 했네요. 이 절개 후, 횡경막과 흉골의 하단부가 표시되어야합니다. 조심스럽게 폐에 손상되지 간병, 다이아 프램의 여백을 통해 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 가슴의 전체 길이를 따라 했네요. 이 단계에있는 흉골에서 약간의 출혈이 정상이며 재관류를 타협하지 않습니다. 일단 흉골을 따라 절개가 만들어되었으며 격막 컷, 그것은 심장이 노출되는 등 ribcage 위쪽과 바깥쪽, 각각의 절반을 리프트 수 있어야한다. 필요한 경우 폐 옆으로 이동합니다. ribcage 모두 반쪽 수 있습니다hemostatic 클램프의 사용이 위치에 개최됩니다. 동물의 긴 축에 평행하게 좌심실에 연동 펌프 3-4mm에 부착된 나비 바늘 (23 2분의 1 G), 넣습니다. 이 위치는 바늘이 dislodged되기의 위험을 최소화합니다. 반환 순환이 심장 밖으로 흐름 수 있도록 오른쪽 안뜰에 작은 절개를합니다. </li><li> 10 ML / 4-5 분 분 0.1 M PB로 재관류를 시작합니다. 이 시점에서 오른쪽 아트리움에서 냄새가 나는데 혈액의 상당량이 아직있다면 흐름이 명확 때까지 계속합니다. </li><li> PB의 흐름을 중단하고 4 % PFA 솔루션 연동 펌프의 입구를 전환합니다. 5 ML / 분 유량을 절감하고 20-25 분 PFA 솔루션을 펌핑 재개하십시오. PFA의 순환을 입력으로, 근육이 몇 분 후, 경련으로 가서, 동물은 말 그대로 위치에 &quot;고정&quot;됩니다. 이 강성은 동물에게 이동하지 돌보는, 부드럽게 hindpaws에 대한 밀어 테스트 수ND는 정맥을 이동시키다. 좋은 재관류는 응답 flexing에서 다리를 방지할 수 있습니다. PFA와 재관류가 완료되면, 정맥 및 hemostatic 클램프가 연결되고 그 시신이 조직 해부 준비하실 수 있습니다. 사용되는 절개 방식은 특정 조직에 따라 다릅니다. </li><li> 4퍼센트 PFA로 포화 picric 산 솔루션을 추가하여, 4퍼센트 PFA / 5 % (V / V) 피크르산 (단 발바닥 펀치의 수집 및 사후 고정을위한 PA)를 준비합니다. PA의 포함은 주변 장치의 연결을 티슈 1 항원 detectability를 대폭 향상 </li><li> 0.07 %의 글리세롤 15 %의 자당과 0.1 M PB에서 1​​0 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 뼈 / 연골 조직 decalcifying / cryoprotectant 솔루션을 준비합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 기반 솔루션은 epitopes 2 보존 반면 조직을 decalcify. </li><li> 0.1 M PB로 30 % 자당 - cryoprotectant 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 2. 조직 해부 / 제거, 후 고정 및 Sectioning <ol><li> 발바닥 펀치 perfu를 배치아래 커팅 매트 또는 기타 단단한 표면에 SED 동물 복부 쪽. 기슭의 중앙으로, 발을 발바닥이 표면 위로, 펀치 생검 도구 (해리스 마이크로 펀치, 테드 펠라 주식 3mm 직경)으로 단단히 눌러 개최. 생검 도구가 뒷다리 넘어 전체를 자르고 확인하기 위해 180도를 통해 앞뒤 생검 도구를 켭니다. 부드럽게 기슭에서 생검 도구를 제거하고 뚜껑과 멸균이 ML 튜브에 조직을 꺼내, 4% PFA / 5% PA 솔루션의 한 ML을 포함. </li><li> 사지 뼈 (대퇴골의 예) 둘 다 두 다리를 따라 아래로 계속, 골반의 수준에있는 동물의 뒷면을 따라 수평 절개를합니다. 골반과 대퇴골의 근위 머리는 그대로 둔 반면 골반에서 대퇴골을 분리하는 주위의 근육에 절단. 말초 머리를 유지하기 위해 경골 / 비골로 잘라 뼈 축에서 주변 근육 / 골막을 제거. 4퍼센트 PFA / 1 ML을 포함하는 2 ML 관에 몽둥이를 놓으십시오5% PA 솔루션입니다. </li><li> 4 16-18 H의 로커에서 부드러운 혼합으로 4퍼센트 PFA / 5퍼센트 PA 솔루션의 조직 샘플을 사후 수정 ° C </li><li> 다음과 같이 조직을 Decalcify : 발바닥 펀치 (기슭의 작은 뼈를 decalcify까지) 장소 뚜껑이있는 멸균이 ML 관의 조직 펀치는 0.07 %의 글리세롤과 15 0.1 M PB에서 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML을 포함하는 %의 자당. 4 16-18 H에 대한 약한 믹싱과 로커 ° C. 사지 뼈가 0.07 %의 글리세롤과 0.1 M PB에서 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML을 포함, 모자와 함께 멸균이 ML 튜브에 조직을 장소에 튜브를 놓고 15 % 자당. 4 6~7일 ° C.에 대한 약한 믹싱과 로커에 튜브를 놓고 decalcification 솔루션은 24 시간 포셉 한 쌍의과 강성 손실에 대한 모니터링 조직마다 변경해야합니다. </li><li> cryoprotectant 솔루션의 1.5 ML (0.1 M PB로 30 % 자당)와 뚜껑이있는 멸균이 ML 튜브에 조직을 전송하고, 로커 w에 튜브를 삽입4 16-18 H ° C.에 대한 ith 온화한 혼합 </li><li> sectioning을위한 조직을 준비 : 장소 침대 최적의 절삭 온도 볼륨 (-10 월) 그라 이오 스탯 조직 장착 블록에 대한 화합물 (사쿠라 Finetek 미국 주식) 및 (일반적으로 -20 ° C로 유지) 그라 이오 스탯 챔버에서 정지 수 있습니다. 극저온 에어로졸 (Cyto - 냉동, 제어 주식 회사 미국)도 냉동 과정을 가속 OCT에 뿌려놓은 수 있습니다. 장소 조직 OCT의 침대에 시료와 OCT의 추가 얇은 레이어와 커버. 그것이 강화된하고 내에서 조직이 냉동 때까지 부드럽게 극저온 에어로졸이 OCT를 스프레이. 장소 그라 이오 스탯 챔버에서 절단 머리에 표본 및 조직 표본 블록 절삭 온도 평형 수 있도록 - 적어도 1 시간. 퍼가기 화합물 아직 취성 섹션과 조직 손상에 너무 추운 결과 때 섹션 중입니다. </li><li> 일단 조직이 최적의 절삭 온도에 도달, 표본을 절단 시작 40 μm의 섹션을 생성합니다. </li><li&gt;을 발바닥 펀치 10 MM 나트륨 azide와 0.1 M PB를 포함한 12 잘 조직 문화 접시에 cryosections를 수집합니다. 섹션은 4 ° C.에이 솔루션에 빠져들 남아 있는지 확인 섹션은 최대 4~6개월에 immunostaining 목적으로이 방식으로 저장할 수 있습니다. 또는, 자유 부동 섹션은 -20 ° C (500 ML 0.1 M PBS, pH를 7.2, 30g의 자당, 10g PVP40 300 ML의 에틸렌 글리콜)에서 cryoprotectant 솔루션 무기한 저장할 수 있습니다. ) 증류수로 1L에 최종 볼륨을 조정 3. 사지 뼈는 젤라틴 사전 코팅 슬라이드 (또는 Superfrost에 직접 cryosections 수집을 위해 또한 슬라이드, 피셔 과학) 및 -20 ° C.에 저장하기 전에, 1 H를위한 공기 건조 수 이런 방식에 저장된 슬라이드에 뼈 부분은 2~3개월 이내에 목적을 immunostaining 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 감각 신경 섬유에 대한 조직 섹션의 Immunostaining 3.1. 발바닥 펀치섹션 - 부동 섹션 염색법 <ol><li> 면도날을 사용하여 1 ML micropipette 팁의 마지막 6~7밀리미터를 잘라. (이것은 팁의 벽에 조직 섹션의 고집 억제) 0.1 M PB 여러 번에 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 aspirating하여 끝 사전 조건 내부. 24 잘 조직 문화 판으로 물들일 수 발바닥 펀치 섹션을 전송합니다. 일반적으로 80-10 섹션은 여러 가지 고품질 섹션 immunostaining 당 생성되도록 잘 따라 얼룩이되어야합니다. </li><li> 0.1 M PB 500 μl 당 자에 대한 활발한는 RT에서 로커에 혼합 5 분과 발바닥 펀치 섹션을 씻으십시오. 두 번 더 반복합니다. </li><li> 세탁 솔루션을 취소하고 1 H의 로커에서 부드러운 혼합과, 10 % 염소 혈청 및 0.3 % Triton은 0.1에 X - 100 M PB (사람마다 잘 솔루션을 차단 500 μl)의 구성, 솔루션을 차단에 발바닥 펀치 섹션을 품어 4 ° C. </li><li> 차단 솔루션을 취소하고 기본 antibo의 조직 섹션을 품어4 로커에서 부드러운 혼합과 18-24 H 250 μl 차단 솔루션에 희석 다이 / 항체 ° C. 조사의 실험 요구 사항, 하나의 immunolabeling (특정 단백질이나 신경 섬유 마커에 대한 하나의 기본 항체와 함께) 또는 더블 immunolabeling (두 단백질이나 신경 섬유 마커에 대한 두 가지 기본 항체 포함)에 따라 동일한 섹션에서 수행할 수 있습니다. 이중 immunolabeling을 수행하는 동안 다른 면역 글로불린 G (IgG) isotypes (예 :의 단클론 항체를 정화, 또는 사용하는 두 가지 기본 항체가 (예 : 쥐 한마리와 토끼에서 제기된 하나의 제기) 다른 호스트 수종에 제기되었는지 확인하는 것이 중요하다, 또는 한 IgG1 하나 IgG2a)을 사용할 수 있습니다. 과도한 증발을 피하기 위해 야간 incubations에 대한 Parafilm과 번호판을 봉인하는 것이 좋습니다 좋습니다. 말초 감각 신경 섬유를 얼룩하기​​ 위해서는 몇 가지 특정 항체를 사용할 수 있습니다. 단백질에 대한 항체 neurofilament 200 (NF200, 시그마)는 라벨 고맙다을GE - 직경 섬유, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP, 시그마) 반면, 및 과도 수용체 잠재적인 vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) 라벨 peptidergic, 작은 직경 주변 감각 섬유. 모든 말초 신경 섬유는 β3 - tubulin에 대한 항체 물들일 수 있습니다. 피부에서 콜라겐 IV (Abcam)은 진피에서 표피를 분리 지하 막을 윤곽을 그리다하는 데 사용됩니다. 일반적으로 항체는 일반적으로 μg / ML 50-10의 작동 농도에서 교양 셀 기반 immunofluorescence assays에 대한보다 집중 50-10 번해야합니다. </li><li> 차단 용액 500 μl (트리톤 X - 100) 당 잘에 대한 RT에서 로커에서 활발한 혼합과 5 분과 조직 섹션을 씻으십시오. 3 번 이상 반복합니다. </li><li> 4 로커에서 부드러운 혼합과 함께 적절한 형광단 - 복합 차 항체 (일반적으로 용액 500 μl를 차단에 1:1000 희석)에서 세탁 솔루션 및 품어 조직 섹션 ° C.을 삭제하시겠습니까 플레이트 뮤스t는 fluorophores의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일에 싸여 있습니다. </li><li> 차단 솔루션마다 잘에 대한 RT에서 로커에서 활발한 혼합과 10 분 500 μl와 조직 섹션을 씻으십시오. 다음 RT 10 분 활발한 혼합과 0.1 M PB 500 μl로 씻으십시오. 마지막으로, RT 10 분 활발한 혼합과 0.05 M PB 500 μl로 씻으십시오. </li><li> FBS - 대우 팁 (끝부분 6-7mm를 잘라)으로 1 ML의 micropipette를 사용 SuperFrost로 조직 문화 플레이트와 전송에서 섹션을 기음 플러스 현미경 슬라이드. 섹션을 정렬하고 좋은 붓을와 함께 여분의 세척 버퍼를 흡수. 빛에 장시간 노출을 피하십시오. 섹션 슬라이드 (50-30 분)에 대한 섹션을 건조 수 있도록, RT에있는 슬라이드를 품어. </li><li> 설치 매체 (ProLongGold, Vectashield 또는 이와 유사한 것)의 몇 방울을 적용, 천천히 섹션에 유리 coverslip을 넣으십시오. 슬라이드 5 분 어둠에 앉아서, 다음 투명 손톱으로 coverslip의 가장자리를 밀봉하도록 허용폴란드어. 15-20 분 공기 건조 수 있습니다. 슬라이드 지금은 형광의 큰 손실없이 몇 년 동안 시각 또는 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3.2. 사지 뼈 부분 -에 - 슬라이드 염색법 <ol><li> 슬라이드는 -20 ° C 저장에서 RT로 돌아갈 수 있습니다. 소수성 장벽 펜 (슈퍼 아빠 액체 차단 펜, 테드 펠라 주식 회사)를 사용하면 솔루션의 풍부한 레이어 물들일 수 뼈 섹션을 포함하는 슬라이드 영역을 제한하다. 10-15 분 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 5 분 슬라이드 당 0.1 M PB 250 μl와 뼈 섹션을 깨끗이 씻어 2 번 이상 반복하십시오. </li><li> 세탁 솔루션을 취소하고 10 % 염소 혈청과 4에서 1 H를 위해 0.3 % Triton은 0.1에 X - 100 M PB (슬라이드 당 솔루션을 차단 250 μl) ° C. 구성, 솔루션을 차단의 뼈 부분을 품어 </li><li> , 차단 솔루션을 취소하고 기본 항체 (또는 차 항체의 조합에 뼈 부분을 품어 경우로 3.1.4 아래 언급된 두 immunolabeling의) 4시 18-24 H 250 μl 차단 솔루션 ° C.에 희석 이것은 슬라이드가 기본 항체 솔루션의 건조 방지하기 위해, 밀폐 뚜껑이있는 humidified 챔버에 배치해야합니다 매우 중요합니다. 말초 감각 신경 섬유를 얼룩하기​​ 위해서는 (섹션 3.1.4 참조) 항체의 세트 위에서 언급한는 유사한 작업 농도와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> RT 15 분 슬라이드 당 차단 솔루션을 250 μl (트리톤 X - 100)로 조직 섹션을 깨끗이 씻어 3 번 이상을 반복. </li><li> 세탁 솔루션을 취소하고 4 적절한 형광단 - 복합 차 항체 (일반적으로 차단 솔루션, 250 μl의 1:1000 희석)의 뼈 부분을 품어 ° C. 얼룩 챔버는 fluorophores의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일에 싸여 있어야합니다. 편의를 위해, 그것은 어두운 색 얼룩의 회의소 (예 : 슬라이드 배양 트레이 / 상자 RPI 주식 회사)를 사용하는 것이 바람직하다. </li><li> WRT 15 분 슬라이드마다 솔루션을 차단 250 μl와 재가 뼈 부분. 다음 RT 15 분 0.1 M PB 500 μl로 씻으십시오. 마지막으로, RT 15 분 0.05 M PB 500 μl로 씻으십시오. ddH 2 O에서 수영을 잠시는 슬라이드를 씻어 후 공기 건조 (50-30 분)에 뼈 부분을 허용하기 위해 RT에서 부화. 빛에 장시간 노출을 피하십시오. </li><li> 설치 매체 (ProLongGold 또는 이와 유사한 것)의 몇 방울을 적용하고 천천히 섹션에 유리 coverslip을 넣으십시오. 슬라이드 5 분 어둠에 서서, 그리고 투명 매니큐어로 coverslip의 가장자리를 밀봉합시다. 15-20 분 건조 수 있습니다. 슬라이드는 형광의 손실없이 몇 년 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 4.1. 발바닥 펀치 섹션 발바닥 펀치 조직 섹션은 10X, 40X 또는 63X 목적으로 공촛점 현미경 또는 epifluorescence 현미경 시각하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" /> 그림 1. 표피 - 피부 교차점에서, 연골과 근육에 지하 점막에 콜라겐 IV 항체 (녹색)와 얼룩 광고 보여줍니다. 수많은 CGRP - (AB, 빨강)와 NF200 - 긍정적인 섬유 (CD, 빨간색)은 발바닥 지역에서 마우스 피부 (화살표)를 통해 배포됩니다. (; 적색 F​​)를 중심으로도 (; 화살촉 녹색) CGRP - 양성 작은 ​​직경의 섬유에 국한됩니다 TRPV1 얼룩이 반면, β3 - tubulin은 팬 -의 연결 마커 (E, 레드)입니다. A와 C는 10X 목표 (스케일 바 -500 μm의)에서 찍은 epifluorescence 이미지되며 B, D, E와 F는 60X 목표 (규모에 따라 2 μm의 단위에서 찍은 11 이미지 Z - 스택에서 생성된 공촛점 이미지 합성 아르 바 - 50 μm의). 4.2. 사지 뼈 섹션 사지 뼈 조직 섹션도 epifluorescence 현미경, 또는 공촛점 microscop 아래에서 시각 수 있습니다10X, 40X 또는 63X 목적으로 전자. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" /> ., 안티 - NF200 (CD, 빨강, 화살표), 안티 - β3 - tubulin (E, 적색) 및 안티 TRPV1 (F, 적색) 공동 묻은, 그림 2는 안티 CGRP (화살표 AB, 빨강)과 immunostaining 보여줍니다 안티 CGRP 항체와 함께 (녹색, 화살표). 이러한 이미지는 마우스 대퇴부의 해면 머리 지역에있는 뼈 매트릭스에 걸쳐 분산 감각 신경 섬유의 subtypes을 보여줍니다. A와 C는 10X 목표 (스케일 바 -500 μm의)에서 찍은 epifluorescence 이미지되며 B, D, E와 F는 60X 목표 (규모에 따라 2 μm의 단위에서 찍은 11 이미지 Z - 스택에서 생성된 공촛점 이미지 합성 아르 바 - 50 μm의).

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy.">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 마우스 피부 immunostaining 및 주변 감각 신경 섬유의 검출을위한 뼈 조직 섹션의 준비를위한 방법을 상세있다. 발바닥 펀치 biopsies에서 생산 섹션 모두 glabrous와 털이 피부를 포함하는이 프로토콜은 모든 피부 타입에 사용할 수 수있다는 것을 의미합니다. 이 기술은 또한 (예 : leukocytes, 혈관 endothelia 다른 중에서 평활근)이 조직에서 다른 세포 유형을 얼룩이 고용 수 있습니다. 이러한 방법은 우?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 3mm 해리스 마이크로 펀치 </td><td> 자료 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 15,094 </td><td></td></tr><tr><td> 재관류 펌프 </td><td> 자료 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> 피크르산 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 239,801 </td><td></td></tr><tr><td> OCT의 삽입 화합물 </td><td> 시약 </td><td> 조직 테크 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cyto - 꼼짝마 극저온 에어로졸 스프레이 </td><td>자료 </td><td> 제어 회사 </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 세럼 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Immunostaining을위한 인큐베이션 트레이와 덮개 (대형) </td><td> 자료 </td><td> RPI 주식 회사 </td><td> 248270 (트레이) 248270 - A (뚜껑) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge 소수성 장벽 펜 </td><td> 자료 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H - 4000 </td><td></td></tr><tr><td> 낙타 헤어 브러쉬 (# 1 두께) </td><td> 자료 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 11,859 </td><td></td></tr><tr><td> 프로 롱 골드 매체를 마운트 </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue preparation and immunostaining of mouse sensory nerve fibers innervating skin and limb bones

말초 감각 신경 섬유에 의해 감지 및 물리적, 화학적 및 열 감각 자극의 기본 처리는 동물과 인간의 감각 지각의 열쇠입니다. 이러한 말초 감각 신경 섬유는 특정 감각 자극을 감지하고 시작 수용체 및 이온 채널 단백질의 과다를 표현한다. 방법은 다음과 섬유에서 특정 이온 채널 단백질의 기능 표현을 식별할 활용할 수 피부를 innervating 말초 감각 신경 섬유의 전기적 특성을 특징 사용할 수 있습니다. 그러나, 유사한 electrophysiological 방법을 사용할 수 없습니다 (또한 개발하기가 어렵습니다) 같은 뼈으로 가장 어려운 조직을 포함하여 다른 내장 기관을 innervating 말초 감각 신경 섬유에있는 수용체와 이온 채널 단백질의 기능 표현의 검출을위한. 또한, 그러한 electrophysiological 방법은 아닌 고르기 단백질의 표현을 결정하는 이용 수 없습니다말초 감각 신경 섬유에의. 따라서, 감각 신경 fivers을위한 주변 기기 / 내장 조직 샘플 immunostaining이 신경 섬유에 대한 관심의 특정 단백질의 표현을 결정하는 최선의 방법을 제공합니다. 지금까지, 감각 뉴런의 단백질 표현 연구의 대부분은 정보가 특정 유형이나 감각 신경의 일부의 세포 본문에 특정 단백질의 표현에 제한됩니다 감각 신경에 절차를 immunostaining 활용했습니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 immunostaining에 대한 주변 / 내장 조직 샘플의 준비에 대한 자세한 방법 / 프로토콜을보고합니다. 우리 피부 발바닥 펀치 생검 및 뼈 (대퇴골) 말초 감각 신경 섬유의 immunostaining에 대한 생쥐에서 섹션의 준비를 위해 특별히 세부 방법. 이러한 방법은 주변 감각 뉴런의 단백질 표현의 질적 결정에만 주요되지뿐만 아니라위한 양적 분석 방법을 제공감각 섬유의 특정 유형 또는 하위 집합의 단백질 발현 수준의 변화를 결정뿐만 아니라, 여러 병적인 상태 동안 감각 섬유의 수와 밀도의 형태학의 및 / 또는 해부 학적 변화를 결정하십시오. 또한, 이러한 방법은 감각 신경 섬유의 얼룩에 국한되지 않은, 또한 피부, 뼈 및 기타 내장 조직에있는 신경 섬유의 종류 얼룩 사용할 수 있습니다.

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

tissue-preparation-immunostaining-mouse-sensory-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.1K 조회수.  The University of Iowa. 말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

연구

신경과학

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비<em&gt; 모이 catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...