This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

적절한 국가 및 기관의 윤리는 동물 실험을 수행하기 전에 확인하셔야합니다. EDL 근육과 신경의 1 제거 <ol><li> 무게와 깊이 5 % 이소 플루오 란을 가진 기화기 플러스 1.5 L / 분 산소 유량 또는 바닥에 이소 플루오 란 적신 코튼 벨 항아리를 사용하여 흡입 이소 플루오 란과 성인 마우스를 마취. </li><li> 마우스가 깊이 마취하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 빨리 크고 날카롭게 가위 단두대를 사용하여 목을 벨. </li><li> 가위를 사용하여 갈비뼈를 통해 복부 정중선 컷을 확인하고 내부 장기를 제거합니다. </li><li> 목의 영역에서 피부를 잡고 발을지나 당겨 동물 스킨. </li><li> 엉덩이 위에 절단하여 다리를 제거하고 carbogenated 냉장 (4 ° C)와 함께 접시 (95 % O 2, 5 % CO 2) 저 칼슘, 높은 마그네슘, 중탄산 완충 식염수 용액 contai로 피부 다리를 배치밀리미터에서 닝 : 128 염화나트륨, 1.9의 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 26 탄산 수소 나트륨, 0.85 염화칼슘, 16 6.5 황산, 10 포도당 (7.4 ± 0.05의 pH를). 저 칼슘은 높은 마그네슘 용액 중에 절개 시냅스 전달을 억제한다. </li><li> 접시에 다리에게 지느러미 측면을 놓고 다리를 고정하고 무릎과 발목 관절이 90도 각도를 이루도록 바늘이나 곤충 핀을 사용하여 아래로 엉덩이. 대신에 조직을 유지하기 위해 각 다리의 끝과 전방 및 후방 허벅지에 각각 한 핀에 핀을 배치합니다. </li><li> Castroviejo 스프링 가위를 사용하여, 허벅지 근육의 상단에 레이어를 위로 들어 올려 바로 아래 좌골 신경을 노출 잘라 중간 선을합니다. 좌골 신경은 단지 위쪽 근육 층의 아래에 위치 엉덩이 근처의 출구에서 대퇴골 위의 실행 때까지 그냥 무릎 관절 전 비골과 경골 신경으로 분기합니다. </li><li> 포까지 좌골 신경 위의 근육을 제거INT가되는 굴근 hallucis의 longus (FHL) 근육에 깊은 비골 신경 분기 다이빙 볼 수 있습니다. </li><li> # 55 집게를 사용하여, 경골의 내측에있는 비복근과 가자미근에서 잘 나오도록 비골 지점 주변의 결합 조직을 해부하다. 비복근과 가자미근 근육의 힘줄을 잘라 조심스럽게 신경 아래에서 제거합니다. </li><li> TA 아래에 숨겨진 EDL로, FHL, EDL과 전 경골근 (TA) : 공동의 내측 측 방향하기 위해 발목에 세 개의 서로 다른 건 번들을 노출 경골의 측면에서 표면 근육을 제거합니다. </li><li> , 발목 관절에서 TA 건을 잘라 EDL로부터 멀리 TA 들어 올린 후를 제거하는 무릎 근처 근육을 잘라. </li><li> 발목 FHL 건 잘라 신경이 FHL을 입력 영역에 도달하는 데 다시 올립니다. 단지 그 시점 아래 잘라 FHL 근육의 ~ 2 / 3를 제거합니다. </li><li> POS와 고관절에 가깝게 좌골 신경을 잘라sible 부드럽게 깊은 비골 지점을 제외한 모든 신경 가지를 벗겨. </li><li> 큰 봄 가위를 사용하여 두 발목과 무릎 관절의 EDL의 힘줄을 잘라. </li><li> 예리한 가위를 사용하여, 무릎 뼈 경골을 절단하여 주위 조직에서 EDL, 나머지 FHL 신경을 제거하고 허벅지를 통해 중간에. 그래서 그냥 EDL은, FHL 신경의 일부가 남아있는 남아있는 경골 뼈를 버려야. </li></ol> 조직 목욕에 EDL 근육과 신경의 2 실장 (그림 1A) <ol><li> 실험을 시작하기 전에, 조직 욕을 준비한다. 지속적으로 목욕을 관류 산소 (100 % O 2) 합성 간질 액 (SIF) 123 염화나트륨, 3.5의 KCl (mm 단위)를 포함, 0.7 황산, 1.7의 NaH 2 PO 4, 2.0 염화칼슘, 9.5 NAC 6 H 11 O ( 글루 콘산 나트륨), 5.5 포도당, 자당 7.5, 10 N -2 - hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2 - 동부 표준시hanesulfonic 산 (HEPES); pH가 7.4 ± 0.05 17. 15-30 ㎖ / 분의 유속을 권장합니다. 욕실의 바닥에 장착 조직 포스트와 힘과 길이 컨트롤러에 대한 마운트 (대략 목욕 차원에 고정이 자극 전극을 25 ㎖의 용량이 시중에서 판매하는 목욕은 표시 8.5 cm X 3cm X 1cm, 사양 ) 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> 고립 된 근육 신경을 처리하고 조직 화장실로 배치 나머지 FHL 조직을 사용합니다. 접시의 바닥에 실 가드의 작은 조각을 배치하고 근육을 안정 남아있는 FHL 조직을 통해 곤충 핀을 사용합니다. </li><li> 두 힘줄을 묶어 하나의 조직 게시물에 끝과 힘과 길이 컨트롤러의 레버 암에 다른 부착하는 6-0 실크 봉합사를 사용 (사양 재료 / 장비의 표 참조). 실제 최소의 봉합 길이를 사용합니다. 당신은 힘줄을 연결 한 후 곤충 핀과 실 가드를 제거합니다. 주 : 쉽게 용이하게하기 위해레버에 연결 와이어의 작은 조각은 에폭시와 레버 아암으로 &quot;J&quot;형상 훅으로 절곡하여 고정 할 수있는 팔. 봉합 후, 와이어에 묶여 대신 레버 아암에 작은 구멍에 나사 수있다. </li><li> 첫번째 유리 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 SA (16) 유리 흡입 전극을 확인 (열 = 286, = 0, 속도 = 150 시간 = 200 당겨); 다시 끝을 중단하고 직접 3mm 테이퍼에 대해있을 때까지 숫돌에 갈기. (전극 제품 정보에 대한 개략적 인 표 재료 / 장비도 1B-1C 참조) 한 표본을 추출하고자하는 신경의 지역에 따라 100 μm의 - 10 사이의 원하는 팁 내경에 microforge를 사용하여 끝 부분을 용융. </li><li> SIF와 내부 실버​​ 와이어에 들어 찬 유리 흡입 전극을 입력합니다. </li><li> 전극으로 신경의 절단 단부를 흡입 및 차동 증폭기의 양의 포트에 연결한다. 염화물로 실버 전극을 감싸headstage의 부정적인 포트에 연결 와이어. headstage의 접지 포트에 화장실에서 초 염화물로 실버 와이어를 실행하여 SIF 목욕을 접지합니다. 또한 관류 펌프를 통해 소개 전기 노이즈를 완화하기 위해 여러 지점에서 패러데이 케이지에 관류 튜브를 접지하십시오. </li><li> 트 수축을 유도하는 조직 욕 근육의 양측에 장착 된 전극을 통해 근육을 자극한다. 또한 신경의 절단 끝에 자극 전극을 배치합니다. 피크 수축력이 관찰 될 때까지 자극 전압을 증가하고 supramaximal 전압 (0.5 msec의 펄스 폭)에 도달하도록 추가로 15 %의 전압을 증가시킨다. 그 사이 10 초 휴식으로 supramaximal 전압에서 트 수축을 계속하지만, 피크 수축력까지 근육의 길이를 변화하는 것은 근육의 최적 길이 (L 오)을 찾기 위해 도달된다. 모든 길이 경사로 및​​ 진동이 LENG의 근육과 함께 시작됩니다일. </li><li> 근육 신경 제제는 조직이 조 온도에 도달하고 정상 시냅스 전달을 위해 저 칼슘 용액 해부 다음 복구 할 수 있도록 후속 데이터를 수집하기 전에 최소한 1 시간 동안 욕에서 유지하도록 허용. </li><li> 실온 이외의 온도 데이터를 수집하기 위해, 근처의 근육 조직 욕에 온도 센서를 배치했다. 천천히 목욕 티슈베이스 플레이트를 통해 가열 된 물을 펌핑하여 온도 욕 위로 가져온다. 일정한 온도를 유지하는 데 도움이되는 SIF 저수지 주변에 점토 전자 레인지 가열 패드를 감 쌉니다. </li></ol> 3 데이터 수집 <ol><li> , 스핀들 심성으로 심성을 식별 반복 트 한 번 전달 0.5 밀리 supramaximal 전압 자극에 의​​해 생성 된 수축 모든 초 동안 신경 세포의 활동을 기록합니다. 참고 : 근육 스핀들 심성이 트 수축 (18, 19) (그림 2)를 일시 중지해야합니다. </li><li> 를 사용하여 다타 수집 소프트웨어는 다른 속도로 서로 다른 길이로 길이 변경 사항을 적용합니다. 이 작업을 자동화 (주어진 뻗어 사용자 정의하는 방법의 스크립트와 방향의 스크린 샷에 대한 추가 정보를 참조) 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 2.5 %, 5 %, 7.5 %의 L 오의 스트레치 길이와 / 15 초 20, 40, 또는 60 %의 L 오의 스트레치 속도로 4 초 램프 홀드 뻗어을 적용합니다. 참고 : 필요한 전압 - mm 환산 계수에 대한 구체적인 힘과 길이 컨트롤러에 대한 사용자 설명서를 참조하십시오. </li><li> 실험의 끝에서, 최대 아이소 메트릭 파상풍의 수축 (500 밀리 기차, 120 Hz에서 기차 주파수, 0.5 밀리 초 펄스 폭, supramaximal 전압)를 사용하여 24 ° C에서 근육의 건강을 결정합니다. 이전에보고 된 값과 피크 수축력 비교 (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

이 문서의 목적은 고립 된 마우스 근육 - 신경 준비 근육 스핀들 심성에서 기록하는 방법을 설명하는 것이 었습니다. 우리는 마우스 스핀들 심성 쥐, 고양이와 인간 15 것과 같은 스트레칭과 유사하게 반응 것을 발견했다 및 기타 실험실은 근육과 생체 외 피부 모두에서 감각 뉴런을 연구하는 모델 생물로 쥐를 사용했다 (예 : 3,13 용) . 근육 감각 신경 섬유는 24 ° C와 34 ° C에서 모두 적어도 6-8 시간 동안 녹화 할 수 있습니다. EDL 신경 운반 최소화하기 위해 가능한 한 조직을 처리하기 FHL의 나머지 부분을 사용한다. 절개 후, 조직 목욕 온도와 정상 시냅스 전달은 복구하는 동안 평형을 할 수 있도록 데이터 수집을 시작하기 위해 1 시간 이상을 기다립니다. 이전에는 근육 건강은 최대 파상풍 콘트라 것으로 판단하여이 제조에 사용되는 근육의 부분 집합에 대한 확인되었다근육 생성 ctile 력 실험 (15)의 시작과 끝에서의 다른 사람에 의해보고 된 것과 유사하다. 근육 스핀들 심성은 (그림 3) (그림 2) 수축을 트에 대한 응답으로 발사의 특성을 일시 정지를 찾고뿐만 아니라 길이 변화에 따라 예상되는 순간 주파수가 증가하여 준비 기능적으로 확인되었다. 우리의 경험에 의하면, 제어 조건에서 화재 대부분의 구 심성 신경은 근육 스핀들 심성이다. 이 혼합물 (~ 7mm 최대)에 유지 된 신경의 길이는 근육 심성 아형 13를 식별 심성 전도 속도의 차이를 사용하기에 충분히 길지. 또한, 고양이와 인간과는 달리, 동적 감도 조치 (논의는 윌킨슨 등. 15 참조) 명확하게 마우스에서 Ia 군과 II 심성을 구별 할 수 없었다. 심성의 다른 아형 (즉,., 그룹 III 및 IV) 등 근육 허혈로 노출 욕 pH를 감소, 캡사이신, ATP, 브라 디 키닌 또는 3,13,21-23 같은 물질을 추가하여, 예를 들면,이 혼합물에 추가 기능 테스트를 사용하여 식별 될 수있다 흡입 전극을 사용하여 하나의 근육에서 수집 될 수있는 데이터의 양을 증가시키는 여러 감각 뉴런에서 활성이 한번에 기록 될 수있다. 이 제제는 감각 뉴런 집단 응답 또는 확인 응답의 구 심성 신경에서 섭동의 전체적인 효과를 측정하기 위해 사용될 수있다. 스파이크 모양이 충분히 고유 경우, 4 감각 신경까지 () Spike2 모두 (캠브리지 전자 디자인) 및 LabChart 프로 (AD 악기와 유사하게 수행 한) 소프트웨어에 의해 식별 될 수있다. 뉴런 판별 할 수없는 경우에는, 전극 배치 나 팁 직경의 변화가 용이하게 구현 될 수있다. 체외 위해 준비에 요약하면, 마우스의 근육 - 신경토 오크 다양한 물리 화학적 섭동, 상해 및 질병 모델에 대한 근 감각 구 심성 신경의 응답 특성을 조사하기 위해 이용 될 수있는 간단한 실험적인 접근 방법이다. 또한,이 준비는 이상적으로 형질 전환 동물 및 optogenetic 도구를 포함하여 마우스에서 사용할 수있는 강력한 유전자 도구를 활용하기에 적합합니다.

골격근은 근육 환경에 대한 중요한 정보는 중추 신경계를 제공하는 감각 뉴런에 의해 신경 지배된다. 근육 스핀들은 매우 extrafusal 근육 섬유와 병렬로 위치 intrafusal 근육 섬유로 구성된 캡슐화 된 구조를 전문으로하고 있습니다. 스핀들은 Ia 군과 근육의 길이와 intrafusal 섬유 톤의 변화가 동적으로 분포하는 감마 운동 뉴런 하나에 의해 조절되는 인코딩 II 구 심성 신경 지배를하고 있습니다. 그룹 IB의 구 심성 신경은 근육 섬유과 힘줄 삽입 사이에 위치와 근육의 수축이 중 예를 들어 근육의 힘의 변화에 민감합니다. 그룹 IA, IB 및 II 심성은 적절한 모터 제어에 도움 고유 감각 피드백을 제공합니다. 근육 통하여있는 근육 심성의 추가 인구 (그룹 III 및 IV) 대사 증강, 통각 자극의 존재, 및 근육 온도를 신호하는 역할 <sup&gt; 3. 이러한 근 감각 정보는, 항상성 유지 근육 손상을 예방하고 운동을 조절에 중요​​하다. 근육 심성은 사전 경험 4를 기반으로 자신의 발사 패턴을 변경할 수 있습니다. 침해 수용체의 활성화는 밸런스 운동 6 문제가 발생할 수 있습니다 만성 통증 상태 오와 근육 proprioceptors에서 비정상적인 신호의 유도로 이어질 수 있습니다. 우리는 (아르 표시 2-4 개월 된 C57BL / 6 마우스의 응답) 남녀 성인 쥐에서 근육 감각 신경 세포의 수용체 엔딩의 반응을 연구하기 위해 체외 준비에 고립 된 근육 신경을 사용합니다. 마우스는 포유 동물의 연구 모델 유전 종입니다. 이 준비는 좌골 신경의 깊은 비골 분기 및 신근 심지 longus (EDL) 근육, 종아리의 측면 부분에있는 비골 그룹의 속근의 분리가 필요합니다. EDL은 종종 근육 수축 특성 7-9을 연구하는 데 사용됩니다, 테가쉽게 ndons은 격리하고 휴식과 합리적인 수축 듀티 사이클 10 적절한 확산 산소 공급을 허용 할 정도로 작은합니다. (인스턴스 가자미근과 경골근의 경우)이 지역의 다른 근육과 비슷한 크기이며 이러한 준비는 쉽게 이러한 근육의 구 심성 신경에서 기록 수정할 수 있습니다. 흡입 전극 근 감각 구 심성 소성을 기록하는 신경의 절단 단부에 배치된다. 개인 식별 뉴런 및 스파이크 정렬 소프트웨어를 사용하여 스파이크 형상에 기초하여 분석 될 수있다. 목욕 또는 신경에​​ 전극을 자극하는 근육 수축을 연상 할 수있다. 근육 길이와 힘 제어 및 상업적으로 입수 한 시스템을 사용하여 측정 할 수있다. 비슷한 체외 준비는 EDL 11 쥐 t에서, 쥐 넷째 lumbrical 발가락 근육 Ia 군과 II 스핀들 심성 (12)와 그룹 III 및 IV 근육 심성을 그룹 III 및 IV 근육 심성을 연구하는 설치류에 사용되었습니다에서마우스 발바닥의 근육 (13) 그. 시험 관내 시스템은 약리학 적 접근성 온도 및 pH를 관류와 같은 물리 화학적 변수의 직접적인 제어의 장점을 갖는다. 시험관 방법은 생체 내에서 잠재적 인 마취와 근육 관류 상태를 혼동 제거합니다. 근육 신경 제제 심성에서 섭동의 직접 반응의 연구 수 있지만, 생체 (14) 또는 예 3 제제로 희생 생체 가능하다 스핀들 민감도 및 다른 집적 응답 감마 원심성 변조를 연구 할 수있는 능력 이 준비에 더 신경 세포 기관이 없다. 이러한 준비는 이전에 램프 배터리 마우스 근육 스핀들 심성의 응답을 특성화하고 뻗어 진동을 유지하는 데 사용하고, 그것은 그 마우스 스핀들 심성 응 답을 결정 하였다ES는 쥐, 고양이, 및 인간과 같은 다른 종에서보고 된 것과 유사 하였다. 마우스 스핀들 심성 응답은 34 ° C 절대 발사 속도 빠른 있었지만, 24 ° C와 34 ° C 목욕 온도 모두에서 유사하게 발견하고 심성 (15)를 변경 빠른 길이에 대응하는 것이 더 수 있었다되었다. 우리는이 제제는 근육 스핀들 심성을 식별하고 연구하는 데 사용되는 방법을 이하 설명한다. 또한, 본 제제는 쉽게 약물 또는 질병 상태 또는 모듬 다른 변수 (예를 들어, 나이, 성별, 유전자 녹아웃)에 응답하여 감각 구 심성 신경의 특성을 비교하기 위해, 다른 근육 심성 아형 (13)의 반응을 연구하기 위해 수정 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

근육 감각 신경은 근육 스핀들와 골지 건 기관은 고유 감각에 필수적인 길이와 힘의 변화를 인코딩에 분포. 구 심성 섬유는 추가의 대사 증강, 온도 및 통각 자극을 포함한 근육 환경의 다른 특성을 모니터링한다. 전반적으로, 감각 신경 세포의 비정상적인 활성화는 운동 장애 또는 만성 통증 증후군으로 이어질 수 있습니다. 우리는 성인 마우스의 스트레치 유발 심성의 답변 체외 연구를위한 신전 심지 longus (EDL) 근육과 신경의 분리를 설명합니다. 감각 활동은 흡입 전극과 신경에서 기록되고 개인의 심성 스파이크 정렬 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 체외 준비가 마취의 잠재적 혼동되거나 변경 근육 관류없는 감각 심성에 잘 조절 공부를 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 확인하고 스트레칭 근육 스핀들 심성의 응답을 테스트하기위한 프로토콜을 설명합니다. 중요한 것은,이 혼합물은 또한 약물 응용 프로그램과 마우스에서 강력한 유전 적 접근 방법과 질병 모델의 결합 다음과 같은 근육의 구 심성, 응답 특성의 다른 아형의 연구를 지원합니다.

근육 심성의 응답이 검토되고있는 심성 아형에 따라 섭동 다양한 다음 기록 될 수있다. 근육의 수축 및 램프와 스트레치를 길게 근육 스핀들 심성의 대표적인 응답은 여기에 표시됩니다. 스핀들 심성으로 심성을 확인하려면, 경련 수축을 수축 (18, 19) 동안 소성에 일시 정지가 있는지마다 초 (0.5 밀리 초 펄스 폭)이 제공됩니다.이 그림은 신경 세포의 활동과 근육의 긴장을 대표하는 추적 중을 표시 이러한 트 수축. 스핀들 심성에 대해 예상대로 어떤 신경 세포의 활동은, 트 수축 동안 관찰되지 않습니다. 기록 심성이 그룹 IB 골지 건 기관의 심성, 수축하는 동안 속도를 발사의 증가 인 경우 예상된다. 제어 조건 34 ° C에서 대부분 24 ° C에서 일반 연소 패턴 (~ 12 충동 / ​​초와 심성과 ~ 32 충동 / ​​초에서) 근육 스핀들 심성이다. 스핀들 심성의 부분 집합만이 화재 스트레칭 동안 (우리 손에 ~ 스핀들 심성의 11 %) 15. 그림 3a는이 근육 스핀들 심성의 대표 원료 추적이 램프에 응답하고 힘과 길이 컨트롤러에서 생성 스트레칭을 보유 보여줍니다. LabChart의 스파이크 히스토그램 기능을 확인하고 순간 별도로 두 개의 개별 뉴런의 발사 주파수 (그림 3B-3C)을 분석하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 격리 된 근육 준비 A) 신전 심지 longus (EDL)와 분포하는 좌골 신경은 산소를 합성하여 체액 (SIF) 관류 고립 된 조직 욕조에 장착되어있다. sucti에 연결된 세포 외 증폭기전극에 신경 활동을 기록합니다. 적절한 소프트웨어를 측정하고 제어하며 근육의 힘과 길이 컨트롤러와 듀얼 힘과 길이. 조직 목욕 전극 트이나 파상풍의 수축을 생산하는 자극을 제공합니다. 내부 목욕 접시 채널을 통해 가열 된 물을 펌핑 조직 욕 온도. B) 뽑아 유리 흡입 전극을 제어 microforge를 사용하여 제조되는 흡입 전극 이상적인 선단 형상 ~ 3mm 테이퍼 팁. C)을 확대 묘사와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> 수축을 트 위치하는 그림 2 스핀들 수입 성의 응답. 신경 activitY (상단 트레이스)와 30 트의 수축에서 근육의 긴장 (하단 트레이스는) 블랙 위에 중첩 추적 중첩된다. 구 심성 활동 근육 스핀들 심성의 응답 특성 인 수축 유도 된 장력이 증가하는 동안 일시. 활동이 일시 중지 될 때 상단 추적 상기 브라켓과 화살이 수축하는 동안 시간을​​ 나타냅니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3 스핀들 수입 성의 응답 진입로와 스트레치를 잡고)이 심성 (상단 트레이스)의 원시 신경 활동을 경사로 동안 및 EDL (하단 추적에서 같이 근육의 길이). B) 순간 발사 주파수 (순시에 적용 스트레치를 개최합니다. Fr.은 L부터 오에서 활성을 나타내는 단위는 초당 자극) (파랑)에 도시. C) Instantane만 화재 스트레칭 동안 (주황색으로 표시) 작은 단위의 조직 구성 단위 발사 주파수를 설정합니다. 두 유닛은 근육 스핀들 심성 하나의 특징이다 스트레칭 동안에 스파이크 주파수 적응을 나타낸다.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

근육 감각 신경은 proprioceptor 신호에 참여하고 또한 신진 대사 상태 및 상해 관련 이벤트를보고있다. 우리는 스트레치 활성화 근육의 심성에 대한 연구를위한 체외 근육 - 신경 준비 성인 마우스를 설명합니다.

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.9K 조회수.  San José State University.  근육 감각 신경은 proprioceptor 신호에 참여하고 또한 신진 대사 상태 및 상해 관련 이벤트를보고있다. 우리는 스트레치 활성화 근육의 심성에 대한 연구를위한 체외 근육 - 신경 준비 성인 마우스를 설명합니다. 

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

성인에서 태어난 뉴런의 통합을 공부

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

연구

신경과학

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

생체 외에서 쥐에 있는 저 승 구심 성 섬유의 Electrophysiological 속성의 특성

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

생체 외에서 타우 단백질 및 마약 검사의 집계를 공부에 대 한 분석 결과

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...