Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

적절한 국가 및 기관의 윤리는 동물 실험을 수행하기 전에 확인하셔야합니다. EDL 근육과 신경의 1 제거 <ol><li> 무게와 깊이 5 % 이소 플루오 란을 가진 기화기 플러스 1.5 L / 분 산소 유량 또는 바닥에 이소 플루오 란 적신 코튼 벨 항아리를 사용하여 흡입 이소 플루오 란과 성인 마우스를 마취. </li><li> 마우스가 깊이 마취하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 빨리 크고 날카롭게 가위 단두대를 사용하여 목을 벨. </li><li> 가위를 사용하여 갈비뼈를 통해 복부 정중선 컷을 확인하고 내부 장기를 제거합니다. </li><li> 목의 영역에서 피부를 잡고 발을지나 당겨 동물 스킨. </li><li> 엉덩이 위에 절단하여 다리를 제거하고 carbogenated 냉장 (4 ° C)와 함께 접시 (95 % O 2, 5 % CO 2) 저 칼슘, 높은 마그네슘, 중탄산 완충 식염수 용액 contai로 피부 다리를 배치밀리미터에서 닝 : 128 염화나트륨, 1.9의 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 26 탄산 수소 나트륨, 0.85 염화칼슘, 16 6.5 황산, 10 포도당 (7.4 ± 0.05의 pH를). 저 칼슘은 높은 마그네슘 용액 중에 절개 시냅스 전달을 억제한다. </li><li> 접시에 다리에게 지느러미 측면을 놓고 다리를 고정하고 무릎과 발목 관절이 90도 각도를 이루도록 바늘이나 곤충 핀을 사용하여 아래로 엉덩이. 대신에 조직을 유지하기 위해 각 다리의 끝과 전방 및 후방 허벅지에 각각 한 핀에 핀을 배치합니다. </li><li> Castroviejo 스프링 가위를 사용하여, 허벅지 근육의 상단에 레이어를 위로 들어 올려 바로 아래 좌골 신경을 노출 잘라 중간 선을합니다. 좌골 신경은 단지 위쪽 근육 층의 아래에 위치 엉덩이 근처의 출구에서 대퇴골 위의 실행 때까지 그냥 무릎 관절 전 비골과 경골 신경으로 분기합니다. </li><li> 포까지 좌골 신경 위의 근육을 제거INT가되는 굴근 hallucis의 longus (FHL) 근육에 깊은 비골 신경 분기 다이빙 볼 수 있습니다. </li><li> # 55 집게를 사용하여, 경골의 내측에있는 비복근과 가자미근에서 잘 나오도록 비골 지점 주변의 결합 조직을 해부하다. 비복근과 가자미근 근육의 힘줄을 잘라 조심스럽게 신경 아래에서 제거합니다. </li><li> TA 아래에 숨겨진 EDL로, FHL, EDL과 전 경골근 (TA) : 공동의 내측 측 방향하기 위해 발목에 세 개의 서로 다른 건 번들을 노출 경골의 측면에서 표면 근육을 제거합니다. </li><li> , 발목 관절에서 TA 건을 잘라 EDL로부터 멀리 TA 들어 올린 후를 제거하는 무릎 근처 근육을 잘라. </li><li> 발목 FHL 건 잘라 신경이 FHL을 입력 영역에 도달하는 데 다시 올립니다. 단지 그 시점 아래 잘라 FHL 근육의 ~ 2 / 3를 제거합니다. </li><li> POS와 고관절에 가깝게 좌골 신경을 잘라sible 부드럽게 깊은 비골 지점을 제외한 모든 신경 가지를 벗겨. </li><li> 큰 봄 가위를 사용하여 두 발목과 무릎 관절의 EDL의 힘줄을 잘라. </li><li> 예리한 가위를 사용하여, 무릎 뼈 경골을 절단하여 주위 조직에서 EDL, 나머지 FHL 신경을 제거하고 허벅지를 통해 중간에. 그래서 그냥 EDL은, FHL 신경의 일부가 남아있는 남아있는 경골 뼈를 버려야. </li></ol> 조직 목욕에 EDL 근육과 신경의 2 실장 (그림 1A) <ol><li> 실험을 시작하기 전에, 조직 욕을 준비한다. 지속적으로 목욕을 관류 산소 (100 % O 2) 합성 간질 액 (SIF) 123 염화나트륨, 3.5의 KCl (mm 단위)를 포함, 0.7 황산, 1.7의 NaH 2 PO 4, 2.0 염화칼슘, 9.5 NAC 6 H 11 O ( 글루 콘산 나트륨), 5.5 포도당, 자당 7.5, 10 N -2 - hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2 - 동부 표준시hanesulfonic 산 (HEPES); pH가 7.4 ± 0.05 17. 15-30 ㎖ / 분의 유속을 권장합니다. 욕실의 바닥에 장착 조직 포스트와 힘과 길이 컨트롤러에 대한 마운트 (대략 목욕 차원에 고정이 자극 전극을 25 ㎖의 용량이 시중에서 판매하는 목욕은 표시 8.5 cm X 3cm X 1cm, 사양 ) 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> 고립 된 근육 신경을 처리하고 조직 화장실로 배치 나머지 FHL 조직을 사용합니다. 접시의 바닥에 실 가드의 작은 조각을 배치하고 근육을 안정 남아있는 FHL 조직을 통해 곤충 핀을 사용합니다. </li><li> 두 힘줄을 묶어 하나의 조직 게시물에 끝과 힘과 길이 컨트롤러의 레버 암에 다른 부착하는 6-0 실크 봉합사를 사용 (사양 재료 / 장비의 표 참조). 실제 최소의 봉합 길이를 사용합니다. 당신은 힘줄을 연결 한 후 곤충 핀과 실 가드를 제거합니다. 주 : 쉽게 용이하게하기 위해레버에 연결 와이어의 작은 조각은 에폭시와 레버 아암으로 &quot;J&quot;형상 훅으로 절곡하여 고정 할 수있는 팔. 봉합 후, 와이어에 묶여 대신 레버 아암에 작은 구멍에 나사 수있다. </li><li> 첫번째 유리 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 SA (16) 유리 흡입 전극을 확인 (열 = 286, = 0, 속도 = 150 시간 = 200 당겨); 다시 끝을 중단하고 직접 3mm 테이퍼에 대해있을 때까지 숫돌에 갈기. (전극 제품 정보에 대한 개략적 인 표 재료 / 장비도 1B-1C 참조) 한 표본을 추출하고자하는 신경의 지역에 따라 100 μm의 - 10 사이의 원하는 팁 내경에 microforge를 사용하여 끝 부분을 용융. </li><li> SIF와 내부 실버​​ 와이어에 들어 찬 유리 흡입 전극을 입력합니다. </li><li> 전극으로 신경의 절단 단부를 흡입 및 차동 증폭기의 양의 포트에 연결한다. 염화물로 실버 전극을 감싸headstage의 부정적인 포트에 연결 와이어. headstage의 접지 포트에 화장실에서 초 염화물로 실버 와이어를 실행하여 SIF 목욕을 접지합니다. 또한 관류 펌프를 통해 소개 전기 노이즈를 완화하기 위해 여러 지점에서 패러데이 케이지에 관류 튜브를 접지하십시오. </li><li> 트 수축을 유도하는 조직 욕 근육의 양측에 장착 된 전극을 통해 근육을 자극한다. 또한 신경의 절단 끝에 자극 전극을 배치합니다. 피크 수축력이 관찰 될 때까지 자극 전압을 증가하고 supramaximal 전압 (0.5 msec의 펄스 폭)에 도달하도록 추가로 15 %의 전압을 증가시킨다. 그 사이 10 초 휴식으로 supramaximal 전압에서 트 수축을 계속하지만, 피크 수축력까지 근육의 길이를 변화하는 것은 근육의 최적 길이 (L 오)을 찾기 위해 도달된다. 모든 길이 경사로 및​​ 진동이 LENG의 근육과 함께 시작됩니다일. </li><li> 근육 신경 제제는 조직이 조 온도에 도달하고 정상 시냅스 전달을 위해 저 칼슘 용액 해부 다음 복구 할 수 있도록 후속 데이터를 수집하기 전에 최소한 1 시간 동안 욕에서 유지하도록 허용. </li><li> 실온 이외의 온도 데이터를 수집하기 위해, 근처의 근육 조직 욕에 온도 센서를 배치했다. 천천히 목욕 티슈베이스 플레이트를 통해 가열 된 물을 펌핑하여 온도 욕 위로 가져온다. 일정한 온도를 유지하는 데 도움이되는 SIF 저수지 주변에 점토 전자 레인지 가열 패드를 감 쌉니다. </li></ol> 3 데이터 수집 <ol><li> , 스핀들 심성으로 심성을 식별 반복 트 한 번 전달 0.5 밀리 supramaximal 전압 자극에 의​​해 생성 된 수축 모든 초 동안 신경 세포의 활동을 기록합니다. 참고 : 근육 스핀들 심성이 트 수축 (18, 19) (그림 2)를 일시 중지해야합니다. </li><li> 를 사용하여 다타 수집 소프트웨어는 다른 속도로 서로 다른 길이로 길이 변경 사항을 적용합니다. 이 작업을 자동화 (주어진 뻗어 사용자 정의하는 방법의 스크립트와 방향의 스크린 샷에 대한 추가 정보를 참조) 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 2.5 %, 5 %, 7.5 %의 L 오의 스트레치 길이와 / 15 초 20, 40, 또는 60 %의 L 오의 스트레치 속도로 4 초 램프 홀드 뻗어을 적용합니다. 참고 : 필요한 전압 - mm 환산 계수에 대한 구체적인 힘과 길이 컨트롤러에 대한 사용자 설명서를 참조하십시오. </li><li> 실험의 끝에서, 최대 아이소 메트릭 파상풍의 수축 (500 밀리 기차, 120 Hz에서 기차 주파수, 0.5 밀리 초 펄스 폭, supramaximal 전압)를 사용하여 24 ° C에서 근육의 건강을 결정합니다. 이전에보고 된 값과 피크 수축력 비교 (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

이 문서의 목적은 고립 된 마우스 근육 - 신경 준비 근육 스핀들 심성에서 기록하는 방법을 설명하는 것이 었습니다. 우리는 마우스 스핀들 심성 쥐, 고양이와 인간 15 것과 같은 스트레칭과 유사하게 반응 것을 발견했다 및 기타 실험실은 근육과 생체 외 피부 모두에서 감각 뉴런을 연구하는 모델 생물로 쥐를 사용했다 (예 : 3,13 용) . 근육 감각 신경 섬유는 24 ° C와 34 ° C에서 모두 적어도 6-8 시간 동안 녹화 할 수 있습니다. EDL 신경 운반 최소화하기 위해 가능한 한 조직을 처리하기 FHL의 나머지 부분을 사용한다. 절개 후, 조직 목욕 온도와 정상 시냅스 전달은 복구하는 동안 평형을 할 수 있도록 데이터 수집을 시작하기 위해 1 시간 이상을 기다립니다. 이전에는 근육 건강은 최대 파상풍 콘트라 것으로 판단하여이 제조에 사용되는 근육의 부분 집합에 대한 확인되었다근육 생성 ctile 력 실험 (15)의 시작과 끝에서의 다른 사람에 의해보고 된 것과 유사하다. 근육 스핀들 심성은 (그림 3) (그림 2) 수축을 트에 대한 응답으로 발사의 특성을 일시 정지를 찾고뿐만 아니라 길이 변화에 따라 예상되는 순간 주파수가 증가하여 준비 기능적으로 확인되었다. 우리의 경험에 의하면, 제어 조건에서 화재 대부분의 구 심성 신경은 근육 스핀들 심성이다. 이 혼합물 (~ 7mm 최대)에 유지 된 신경의 길이는 근육 심성 아형 13를 식별 심성 전도 속도의 차이를 사용하기에 충분히 길지. 또한, 고양이와 인간과는 달리, 동적 감도 조치 (논의는 윌킨슨 등. 15 참조) 명확하게 마우스에서 Ia 군과 II 심성을 구별 할 수 없었다. 심성의 다른 아형 (즉,., 그룹 III 및 IV) 등 근육 허혈로 노출 욕 pH를 감소, 캡사이신, ATP, 브라 디 키닌 또는 3,13,21-23 같은 물질을 추가하여, 예를 들면,이 혼합물에 추가 기능 테스트를 사용하여 식별 될 수있다 흡입 전극을 사용하여 하나의 근육에서 수집 될 수있는 데이터의 양을 증가시키는 여러 감각 뉴런에서 활성이 한번에 기록 될 수있다. 이 제제는 감각 뉴런 집단 응답 또는 확인 응답의 구 심성 신경에서 섭동의 전체적인 효과를 측정하기 위해 사용될 수있다. 스파이크 모양이 충분히 고유 경우, 4 감각 신경까지 () Spike2 모두 (캠브리지 전자 디자인) 및 LabChart 프로 (AD 악기와 유사하게 수행 한) 소프트웨어에 의해 식별 될 수있다. 뉴런 판별 할 수없는 경우에는, 전극 배치 나 팁 직경의 변화가 용이하게 구현 될 수있다. 체외 위해 준비에 요약하면, 마우스의 근육 - 신경토 오크 다양한 물리 화학적 섭동, 상해 및 질병 모델에 대한 근 감각 구 심성 신경의 응답 특성을 조사하기 위해 이용 될 수있는 간단한 실험적인 접근 방법이다. 또한,이 준비는 이상적으로 형질 전환 동물 및 optogenetic 도구를 포함하여 마우스에서 사용할 수있는 강력한 유전자 도구를 활용하기에 적합합니다.

골격근은 근육 환경에 대한 중요한 정보는 중추 신경계를 제공하는 감각 뉴런에 의해 신경 지배된다. 근육 스핀들은 매우 extrafusal 근육 섬유와 병렬로 위치 intrafusal 근육 섬유로 구성된 캡슐화 된 구조를 전문으로하고 있습니다. 스핀들은 Ia 군과 근육의 길이와 intrafusal 섬유 톤의 변화가 동적으로 분포하는 감마 운동 뉴런 하나에 의해 조절되는 인코딩 II 구 심성 신경 지배를하고 있습니다. 그룹 IB의 구 심성 신경은 근육 섬유과 힘줄 삽입 사이에 위치와 근육의 수축이 중 예를 들어 근육의 힘의 변화에 민감합니다. 그룹 IA, IB 및 II 심성은 적절한 모터 제어에 도움 고유 감각 피드백을 제공합니다. 근육 통하여있는 근육 심성의 추가 인구 (그룹 III 및 IV) 대사 증강, 통각 자극의 존재, 및 근육 온도를 신호하는 역할 <sup&gt; 3. 이러한 근 감각 정보는, 항상성 유지 근육 손상을 예방하고 운동을 조절에 중요​​하다. 근육 심성은 사전 경험 4를 기반으로 자신의 발사 패턴을 변경할 수 있습니다. 침해 수용체의 활성화는 밸런스 운동 6 문제가 발생할 수 있습니다 만성 통증 상태 오와 근육 proprioceptors에서 비정상적인 신호의 유도로 이어질 수 있습니다. 우리는 (아르 표시 2-4 개월 된 C57BL / 6 마우스의 응답) 남녀 성인 쥐에서 근육 감각 신경 세포의 수용체 엔딩의 반응을 연구하기 위해 체외 준비에 고립 된 근육 신경을 사용합니다. 마우스는 포유 동물의 연구 모델 유전 종입니다. 이 준비는 좌골 신경의 깊은 비골 분기 및 신근 심지 longus (EDL) 근육, 종아리의 측면 부분에있는 비골 그룹의 속근의 분리가 필요합니다. EDL은 종종 근육 수축 특성 7-9을 연구하는 데 사용됩니다, 테가쉽게 ndons은 격리하고 휴식과 합리적인 수축 듀티 사이클 10 적절한 확산 산소 공급을 허용 할 정도로 작은합니다. (인스턴스 가자미근과 경골근의 경우)이 지역의 다른 근육과 비슷한 크기이며 이러한 준비는 쉽게 이러한 근육의 구 심성 신경에서 기록 수정할 수 있습니다. 흡입 전극 근 감각 구 심성 소성을 기록하는 신경의 절단 단부에 배치된다. 개인 식별 뉴런 및 스파이크 정렬 소프트웨어를 사용하여 스파이크 형상에 기초하여 분석 될 수있다. 목욕 또는 신경에​​ 전극을 자극하는 근육 수축을 연상 할 수있다. 근육 길이와 힘 제어 및 상업적으로 입수 한 시스템을 사용하여 측정 할 수있다. 비슷한 체외 준비는 EDL 11 쥐 t에서, 쥐 넷째 lumbrical 발가락 근육 Ia 군과 II 스핀들 심성 (12)와 그룹 III 및 IV 근육 심성을 그룹 III 및 IV 근육 심성을 연구하는 설치류에 사용되었습니다에서마우스 발바닥의 근육 (13) 그. 시험 관내 시스템은 약리학 적 접근성 온도 및 pH를 관류와 같은 물리 화학적 변수의 직접적인 제어의 장점을 갖는다. 시험관 방법은 생체 내에서 잠재적 인 마취와 근육 관류 상태를 혼동 제거합니다. 근육 신경 제제 심성에서 섭동의 직접 반응의 연구 수 있지만, 생체 (14) 또는 예 3 제제로 희생 생체 가능하다 스핀들 민감도 및 다른 집적 응답 감마 원심성 변조를 연구 할 수있는 능력 이 준비에 더 신경 세포 기관이 없다. 이러한 준비는 이전에 램프 배터리 마우스 근육 스핀들 심성의 응답을 특성화하고 뻗어 진동을 유지하는 데 사용하고, 그것은 그 마우스 스핀들 심성 응 답을 결정 하였다ES는 쥐, 고양이, 및 인간과 같은 다른 종에서보고 된 것과 유사 하였다. 마우스 스핀들 심성 응답은 34 ° C 절대 발사 속도 빠른 있었지만, 24 ° C와 34 ° C 목욕 온도 모두에서 유사하게 발견하고 심성 (15)를 변경 빠른 길이에 대응하는 것이 더 수 있었다되었다. 우리는이 제제는 근육 스핀들 심성을 식별하고 연구하는 데 사용되는 방법을 이하 설명한다. 또한, 본 제제는 쉽게 약물 또는 질병 상태 또는 모듬 다른 변수 (예를 들어, 나이, 성별, 유전자 녹아웃)에 응답하여 감각 구 심성 신경의 특성을 비교하기 위해, 다른 근육 심성 아형 (13)의 반응을 연구하기 위해 수정 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

근육 감각 신경은 근육 스핀들와 골지 건 기관은 고유 감각에 필수적인 길이와 힘의 변화를 인코딩에 분포. 구 심성 섬유는 추가의 대사 증강, 온도 및 통각 자극을 포함한 근육 환경의 다른 특성을 모니터링한다. 전반적으로, 감각 신경 세포의 비정상적인 활성화는 운동 장애 또는 만성 통증 증후군으로 이어질 수 있습니다. 우리는 성인 마우스의 스트레치 유발 심성의 답변 체외 연구를위한 신전 심지 longus (EDL) 근육과 신경의 분리를 설명합니다. 감각 활동은 흡입 전극과 신경에서 기록되고 개인의 심성 스파이크 정렬 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 체외 준비가 마취의 잠재적 혼동되거나 변경 근육 관류없는 감각 심성에 잘 조절 공부를 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 확인하고 스트레칭 근육 스핀들 심성의 응답을 테스트하기위한 프로토콜을 설명합니다. 중요한 것은,이 혼합물은 또한 약물 응용 프로그램과 마우스에서 강력한 유전 적 접근 방법과 질병 모델의 결합 다음과 같은 근육의 구 심성, 응답 특성의 다른 아형의 연구를 지원합니다.

근육 심성의 응답이 검토되고있는 심성 아형에 따라 섭동 다양한 다음 기록 될 수있다. 근육의 수축 및 램프와 스트레치를 길게 근육 스핀들 심성의 대표적인 응답은 여기에 표시됩니다. 스핀들 심성으로 심성을 확인하려면, 경련 수축을 수축 (18, 19) 동안 소성에 일시 정지가 있는지마다 초 (0.5 밀리 초 펄스 폭)이 제공됩니다.이 그림은 신경 세포의 활동과 근육의 긴장을 대표하는 추적 중을 표시 이러한 트 수축. 스핀들 심성에 대해 예상대로 어떤 신경 세포의 활동은, 트 수축 동안 관찰되지 않습니다. 기록 심성이 그룹 IB 골지 건 기관의 심성, 수축하는 동안 속도를 발사의 증가 인 경우 예상된다. 제어 조건 34 ° C에서 대부분 24 ° C에서 일반 연소 패턴 (~ 12 충동 / ​​초와 심성과 ~ 32 충동 / ​​초에서) 근육 스핀들 심성이다. 스핀들 심성의 부분 집합만이 화재 스트레칭 동안 (우리 손에 ~ 스핀들 심성의 11 %) 15. 그림 3a는이 근육 스핀들 심성의 대표 원료 추적이 램프에 응답하고 힘과 길이 컨트롤러에서 생성 스트레칭을 보유 보여줍니다. LabChart의 스파이크 히스토그램 기능을 확인하고 순간 별도로 두 개의 개별 뉴런의 발사 주파수 (그림 3B-3C)을 분석하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 격리 된 근육 준비 A) 신전 심지 longus (EDL)와 분포하는 좌골 신경은 산소를 합성하여 체액 (SIF) 관류 고립 된 조직 욕조에 장착되어있다. sucti에 연결된 세포 외 증폭기전극에 신경 활동을 기록합니다. 적절한 소프트웨어를 측정하고 제어하며 근육의 힘과 길이 컨트롤러와 듀얼 힘과 길이. 조직 목욕 전극 트이나 파상풍의 수축을 생산하는 자극을 제공합니다. 내부 목욕 접시 채널을 통해 가열 된 물을 펌핑 조직 욕 온도. B) 뽑아 유리 흡입 전극을 제어 microforge를 사용하여 제조되는 흡입 전극 이상적인 선단 형상 ~ 3mm 테이퍼 팁. C)을 확대 묘사와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> 수축을 트 위치하는 그림 2 스핀들 수입 성의 응답. 신경 activitY (상단 트레이스)와 30 트의 수축에서 근육의 긴장 (하단 트레이스는) 블랙 위에 중첩 추적 중첩된다. 구 심성 활동 근육 스핀들 심성의 응답 특성 인 수축 유도 된 장력이 증가하는 동안 일시. 활동이 일시 중지 될 때 상단 추적 상기 브라켓과 화살이 수축하는 동안 시간을​​ 나타냅니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3 스핀들 수입 성의 응답 진입로와 스트레치를 잡고)이 심성 (상단 트레이스)의 원시 신경 활동을 경사로 동안 및 EDL (하단 추적에서 같이 근육의 길이). B) 순간 발사 주파수 (순시에 적용 스트레치를 개최합니다. Fr.은 L부터 오에서 활성을 나타내는 단위는 초당 자극) (파랑)에 도시. C) Instantane만 화재 스트레칭 동안 (주황색으로 표시) 작은 단위의 조직 구성 단위 발사 주파수를 설정합니다. 두 유닛은 근육 스핀들 심성 하나의 특징이다 스트레칭 동안에 스파이크 주파수 적응을 나타낸다.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

근육 감각 신경은 proprioceptor 신호에 참여하고 또한 신진 대사 상태 및 상해 관련 이벤트를보고있다. 우리는 스트레치 활성화 근육의 심성에 대한 연구를위한 체외 근육 - 신경 준비 성인 마우스를 설명합니다.

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

17.0K 조회수.  San José State University.  근육 감각 신경은 proprioceptor 신호에 참여하고 또한 신진 대사 상태 및 상해 관련 이벤트를보고있다. 우리는 스트레치 활성화 근육의 심성에 대한 연구를위한 체외 근육 - 신경 준비 성인 마우스를 설명합니다. 

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

연구

신경과학

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

성인 마우스에서의 모터 단위 제작 룸버 Motoneuron과 포스의 동시 세포 녹화<em&gt; 생체에</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

의학

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative to understand the cellular and molecular changes involved in maintaining and repairing NMJs. For this purpose, we have developed a method to reliably and consistently examine regenerating NMJs in mice. This nerve injury method involves crushing the common fibular nerve as it passes over the lateral head of the gastrocnemius muscle tendon near the knee. Using 70 day old female mice, we demonstrate that motor axons begin to reinnervate previous postsynaptic targets within 7 days post-crush. They completely reoccupy their previous synaptic areas by 12 days. To determine the reliability of this injury method, we compared reinnervation rates between individual 70 day old female mice. We found that the number of reinnervated postsynaptic sites was similar between mice at 7, 9, and 12 days post-crush. To determine if this injury assay can also be used to compare molecular changes in muscles, we examined levels of the gamma-subunit of the muscle nicotinic receptor (gamma-AChR) and the muscle-specific kinase (MuSK). The gamma-AChR subunit and MuSK to are highly upregulated following denervation and return to normal levels following reinnervation of NMJs. We found a close relationship between transcript levels for these genes and innervation status of muscles. We believe that this method will accelerate our understanding of the cellular and molecular changes involved in repairing the NMJ and other synapses.

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

결합된 공초점 및 초분해능 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부 특성 분석

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

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